CHD5 säätyy alas läpi promoottori hypermetylaation mahalaukun cancer

CHD5 säätyy alas läpi promoottori hypermetylaation mahasyövän
tiivistelmä
tausta
Nonhistone kromosomaalisia proteiineja yhteistuumin histonien tärkeitä rooleja replikointi ja korjaus DNA ja geenin ilmentymisen säätelyyn. Vapautuminen näistä proteiineista voivat edistää erilaisia ​​sairauksia, kuten syöpää. Koska nonhistone kromosomi proteiini, chromodomain helikaasin DNA: ta sitovaa proteiinia 5 (CHD5) on äskettäin todettu tuote uusi tuumorisuppressorigeeniä (APT), edistämällä transkriptio p19 INK4a
ja p16 ARF
. Inaktivointi CHD5 saavutettiin osittain geneettinen poisto, koska se sijaitsee 1p36, alueella usein poistettu ihmisen kasvaimissa. Tässä tutkimuksessa pyrimme tutkimaan osallistumista CHD5 mahasyövän, toiseksi yleisin syöpä maailmassa. Tool Menetelmät
CHD5 ilmaisun paneeli mahalaukun syöpäsolujen määritettiin kvantitatiivisen RT-PCR. Metyloinnin CHD5 arvioitiin metylaatiospesifisen PCR: llä ja bisulfiitti Genomikartoituksen. Vaikutus CHD5 kasvuun mahalaukun syövän solujen testattiin pesäkemuodostusta.
Tulokset
CHD5 ilmentyminen alassäädetty kaikissa mahasyövän käytetyt solulinjat (100%, 7/7) ja merkittävästi uudelleen, kun farmakologinen demetylaatio. Metylaatio CHD5 promoottorin todettiin kaikissa seitsemän mahasyövän solulinjoja ja useimmissa ensisijaisen mahakarsinooman tutkituissa kudoksissa (73%, 11/15). Lopuksi ektooppinen ilmentyminen CHD5 mahalaukun syöpäsolujen johtanut merkittävään kasvun estäminen.
Johtopäätös
CHD5 oli TSG epigeneettiseltä alassäädetty mahasyövän.
Tausta
Kaikki eukaryoottiorganismeja ovat kehittäneet kehittää keinoja pakkausten DNA chromatin kautta dynaaminen vuorovaikutusta erilaisten DNA-liittyviä proteiineja. Tällainen pakkaus ei ole tärkeä ainoastaan ​​varastointiin geneettisen informaation hifi ja eheyden, mutta myös geneettisen tiedon DNA RNA tiiviisti hallitusti. Proteiinit, jotka sitoutuvat DNA: n muodostamiseksi, kromatiinia jaetaan perinteisesti kahteen yleiseen luokkaan: histonien ja nonhistone kromosomaalisia proteiineja. Histones ovat ryhmä erittäin konservoituneiden DNA: han sitoutuvia proteiineja ja niiden eri translaation jälkeiset modifikaatiot muodostavat "histoni koodi", joka ohjaa pakkaus DNA: n tai kromatiinin remodeling. Histoni koodi aloitetaan, säilyy ja tulkitaan pitkälti nonhistone kromosomi proteiinit [1-4]. Esimerkiksi asetylaatio lysiinitähteiden on histoni pyrstön histoni ase- tyylitransferaaseja (HAT) neutraloi niiden varauksen ja vähentää affiniteetti histonien DNA, jolloin DNA saatavilla transkriptiotekijöitä aloittaa geenin transkription. Käänteisesti deasetyloinnilla näiden tähteiden histonideasetylaaseja (HDAC: t) palauttaa tämän affiniteetti ja voivat nostaa DNA transkriptiokoneiston [5]. Lisäksi asetylaatio, fosforylaatio ja metylaatio histoni hännät ovat tärkeitä dynaamisen yhdistys DNA transkription koneet ja muut kromosomaalinen proteiinit [6-8]. Nonhistone kromosomi proteiinit tärkeitä rooleja tulkinnassa histoni koodin muodostamalla kromatiinin remodeling komplekseja. Sekä histonien ja nonhistone kromosomi proteiinit ovat tärkeitä geeniekspression säätelyssä, DNA: n replikaatio ja DNA: n korjaukseen. Sääntelyn purkaminen ilmaisussa ja toimintaa näiden proteiinien voi johtaa kehittää erilaisia ​​sairauksia kuten syöpä [9-13].
Tuoreessa tutkimuksessa, chromodomain helikaasin DNA: ta sitovan proteiinin 5 (CHD5) tunnistettiin novel tuumorisuppressorigeeniä (APT) neuroblastoomakasvaimissa [14]. CHD5 kuuluu superperheen SWI2 /SnF2 liittyviä ATPaasien, yksi suuri ryhmä nonhistone kromosomaalisten proteiineja. CHD5 koodaa ainutlaatuinen yhdistelmä funktionaalisia domeeneja, jotka koostuvat kahdesta N-terminaalista chromodomains, jonka jälkeen SWI2 /SnF2 kaltainen ATPaasi /helikaasidomeeni ja DNA: ta sitova domeeni [14]. Säätelemällä kromatiinin rakennetta, CHD5 voi edistää ilmentymistä p19 ARF, jonka tehtävänä on vakauttaa p53, tuumorisuppressorigeenin inaktivoitua yli puoli ihmisen syövissä [15]. CHD5 on läsnä geenilokus (1p36.31) poistetaan noin 35% neuroblastooma [16]. CHD5 aiemmin ajateltiin nimenomaan ilmaistaan ​​hermostoa, mutta sen rooli syövän muissa kudoksissa alkaa nousta [17]. CHD5 geenin havaittiin merkitsevästi poistettu gliooman [18]. Lisäksi geenideleetio, CHD5 voidaan estää muilla mekanismeilla. Joissakin tapauksissa on neuroblastooma, on olemassa todisteita siitä, että CHD5 ekspressio epigeneettiseltä tukahdutti promoottorin hypermetylaatio [19], vaikka tämä havainto ei ole vahvistettu toisessa tutkimuksessa [20]. Äskettäin CHD5 promoottorin on havaittu metyloitavaa pieniä osajoukkoja rintojen (4,4%), paksusuoli (10%), munasarjojen (15%) ja gliooma (17%) kasvaimissa [17, 20], mikä viittaa siihen, epigeneettinen vaimentaminen CHD5 metylointi voi olla osittaista rooli kasvainten synnyssä näissä kudoksissa. Tässä olemme havainneet, että, toisin kuin muiden syöpien toistaiseksi raportoitu, CHD5 oli usein hypermetyloitunut mahasyövän (73% kasvaimia ja 100% solulinjat). Kohdunulkoinen ilmentyminen CHD5 mahalaukun syöpäsolujen johtanut merkittävään kasvun estäminen. Tämä silmiinpistävä korrelaatio epigeneettiset tukahduttaminen CHD5 ja mahasyövän ehdottaa aiemmin tuntematon suhdetta TSG ja mahalaukun kasvaimen kehittymisen. Tool Menetelmät
Kudosviljelytutkimusten ja RNA /DNA: n eristämiseksi
Kaikki mahasyövän solulinjoissa (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 ja NCI-N87) saatiin riken geenipankin (Tsukuba, Ibaraki, Japani) ja American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Kaikki syöpä solulinjat perustetaan karsinoomien mahalaukun epiteelisolujen. Ellei erikseen mainita, soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa, 5% CO 2, ja 95%: n kosteudessa. Farmakologisen demetylaatio, soluja käsiteltiin 5 uM 5-atsa-2'-deoksisytidiini (atsa) (Sigma, St Louis, MO, USA) kolmena peräkkäisenä päivänä [21]. Aza täydennettiin 24 tunnin välein. Vastaava pitoisuus ajoneuvon (DMSO) käytettiin kontrollina. Ensisijaisen kudosten normaali mahan kudoksissa määriteltiin ei-tulehdus ja ei-tuumorikudoksia. Kaikki mahakarsinoo- kudokset ovat adenokarsinooma kudoksia. Kokonais-RNA: n ja genomisen DNA: ta uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden.
Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR-
Käänteinen transkriptio-reaktio suoritettiin käyttäen 1 ug kokonais-RNA: n käänteistranskriptio System (Promega, Madison , WI, USA). MRNA ilmentymistasojen CHD5 määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Glyseraldehydi-3-phosohate (GAPDH) käytettiin sisäisenä kontrollina RNA eheyden. Käytetyt alukkeet CHD5 RT-PCR oli CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC ja CHD5-R: 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG.
Metylointi PCR (MSP) B-metylointi tila CHD5 määritettiin MSP käyttämällä bisulfaatti muutettu genomi DNA: ta templaattina. Perimän DNA oli bisulfiitti-käsitelty Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) protokollan mukaisesti tarjotaan. MSP suoritettiin 40 sykliä, joissa hehkutus lämpötila 62 ° C, kuten aikaisemmin on kuvattu [22]. Metylaatiospesifistä alukkeet olivat: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (-525--506 suhteessa transkription aloituskohdasta) ja CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (-438--418), ja unmethylation-specific alukkeet olivat: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT ja CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Kaikki alukkeet vahvistettiin aiemmin ole vahvistamiseksi mitään unbisulfited DNA.
Bisulfiittimodifiointi Genomikartoituksen (BGS) B bisulfiittimodifiointi käsiteltyä DNA monistettiin käyttämällä BGS alukkeita, CHD5-BF: 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (-724--701) ja CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (-324--301). PCR-tuotteet puhdistettiin Illustra GFX ™ PCR ja geelivyöhykkeestä puhdistustarvikepakkausta (GE Healthcare life science, Uppsala, Ruotsi) ja kloonattiin pCR4-TOPO-vektoriin sekvensointia (Invitrogen). Vähintään 6 pesäkettä valittiin satunnaisesti plasmidin uuttamalla ja sekvenssianalyysi.
Rakentaminen CHD5 ekspressioplasmidien
CHD5 ekspressioplasmidi kloonaamalla täyspitkä CHD5 avoimen lukukehyksen nisäkkään ekspressiovektoriin pcDNA3.1. CHD5 avoin lukukehys monistettiin normaalista mahalaukun cDNA käyttäen hifi PFU DNA-polymeraasia (Invitrogen) ja kloonattiin pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Jälkeen sekvensointi validointi, insertti subkloonattiin pcDNA3.1 restriktioentsyymeillä Hind III ja Xba I
Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä
transfektoitiin ohimenevästi AGS solujen tyhjä pcDNA3.1 tai pcDNA3.1-CHD5 käytettiin yksikerroksisen pesäkemuodostusta. Soluja viljeltiin yön yli 12-kuoppalevyllä (1,0 x 10 5 /kuoppa) ja transfektoitu pcDNA3.1 tai CHD5 ilmentävä vektori käyttäen Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen). 48 tuntia myöhemmin, transfektantit uudelleen maljattiin kolmena kappaleena, ja viljeltiin 10-15 päivä täydellisessä RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi G418: aa (400 ug /ml). Elossa pesäkkeet värjättiin Gentian Violet jälkeen metanolia kiinnitys ja pesäkkeet ylittää tietyn koon (≥ 50 solua) laskettiin. Kokeet toistettiin kolme kertaa.
Tulokset
Down-regulation of CHD5 ilmentymisen mahasyövän solulinjoissa
ilmentyminen CHD5 mahasyövän solulinjoissa määritettiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä. Vaikka CHD5 oli erittäin ilmentyy normaaleissa mahan kudoksissa, sen ilmaisut olivat alassäädetty kaikissa 7 mahasyövässä solulinjoissa (AGS, Kato III MKN28, MKN45 ja NCI-N87 SNU1 ja SNU16) (Fig. 1). Kuva 1 CHD5 säätyy alas mahasyövän solulinjoissa. Ilmentymistä CHD5 mahasyövän solulinjoissa määritettiin RT-PCR: llä. GAPDH käytettiin normalisoimaan CHD5 ilmaisua. Normaali mahalaukku kudos (vatsa) käytettiin vertailukohtana. Tulokset kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR esitetty ylähavaksessa ja tulos perinteisiä RT-PCR osoitettiin alapaneeli.
Promoottori hypermetylaatiota CHD5 mahasyövän solulinjoissa ja ensisijainen mahakarsinoo- kudosten
Tyypillinen CpG Island (CGI) todettiin noin CHD5 eksonin 1 käyttäen seuraavia kriteereitä: GC-pitoisuus > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65, ja pituus > 500 kp (Fig. 2A). Metylaatiostatuksen Tämän CGI mahalaukun syövän soluissa määritettiin metylaatiospesifisen PCR: llä (MSP). Kuten on esitetty kuviossa. 2B, kokonaan tai osittain metylaatio havaittiin kaikissa 7 mahalaukun syövän solulinjat tutkimme. Johdonmukaisesti tietojen kanssa mahalaukun solulinjojen CHD5 promoottori myös metyloitu useimmissa ensisijaisen mahakarsinooman testatuissa kudoksissa (73%, 11/15) (Fig. 2C). Tärkeää on, metylaatio CHD5 promoottori oli joko havaitsematta tai heikosti havaittavissa normaaleissa kudoksissa vieressä kasvainten saman potilaiden ja mahalaukun kudoksissa terveillä koehenkilöillä. Lisäksi metylaatio CHD5 promoottorin mahasyövässä solulinjoissa ja mahakarsinoo- kudosten varmistettiin bisulfiitti Genomikartoituksen (BGS) (Fig. 2D). Yhdessä CHD5 oli pääosin vaiennettu mahasyövän ja promoottori hypermetylaation näytti olevan merkittävä mekanismi CHD5 hiljentäminen kasvainten synnyssä tämän kudosta. Kuva 2 CHD5 promoottori hypermetyloitunut mahasyövässä. A, CHD5 on tyypillinen CpG Island (CGI) ympärille sen eksonissa 1. CGI piirrettiin mukaan GeneTool ohjelmasta. Sijainnit BGS ja MSP-alukkeet merkitty nuolilla. B, The metylaatiostatus CHD5 promoottorin mahalaukun syövän soluissa määritettiin metylaatiospesifisen PCR: llä. M: metylaatio; U: unmethylation. C, metylaatiostatuksen CHD5 promoottorin ensisijainen mahasyövän kudoksissa määritettiin metylaatiospesifisen PCR B. Normaali mahan kudoksissa ja viereisen ei-tuumorikudoksissa käytettiin verrokkeina. N1 ja N2 ovat normaaleja mahalaukun kudoksia. T1 ja T2 osoittaa mahakarsinoo- kudoksiin samalla A1 ja A2 edustavat viereisen ei-kasvainkudoksia. Edusti Tulokset on esitetty. D, metylointi CHD5 promoottorin mahasyövässä solulinjoissa ja ensisijainen mahakarsinoo- kudoksissa varmistettiin BGS. Jokainen ympyrä merkitsee yhden CpG päällä ja ympyröitä täytetty mustalla edustavat metyloitu CpG sivustoja. Yksi rivi ympyröitä, edustaa yksi pesäke.
Up-regulation CHD5 ilmaisun jälkeen Aza hoidon
edelleen varmistamiseksi promoottori CGI hypermetylaation välittämää CHD5 hiljentäminen mahasyövän solulinjoissa, CHD5 ilmaisuja AGS ja Kato III ennen ja jälkeen demetylaatio reagenssi Aza hoitoa analysoitiin. Molemmat solulinjat osoittavat täydellistä metylaatio CHD5 promoottorin. CHD5 ilmentymistä näissä kahdessa solulinjassa oli merkittävästi lisääntynyt sen jälkeen, kun Aza-indusoidun demetylaation CHD5 promoottorin (Fig. 3A ja 3B), jotka osoittavat, että CHD5 todellakin epigeneettiseltä vaiennetaan mahasyövän. Kuvio 3 Farmakologiset demetylaatio aktivoi CHD5 ilmentymistä mahasyövässä solulinjoissa. A, suhteellinen CHD5 ilmaisuja ennen ja jälkeen Aza hoidon määritettiin RT-PCR: llä, kuten on esitetty. 1. GAPDH käytettiin normalisoimaan malli määrää. B, demetylointi CHD5 promoottorin AGS soluissa jälkeen Aza hoidon vahvistettiin BGS kuten kuvassa. 2D.
Kasvua estävä toiminto CHD5
tuumorisuppressiogeeneksi ominaisuus CHD5 mahalaukun syövän soluissa tutkittiin voitto-of-function strategiaa. Täysi avoimen lukukehyksen (ORF) CHD5 kloonattiin nisäkkään ekspressiovektoriin pcDNA3.1. Vaikutus Kohdunulkoisten CHD5 ilmentymisen kasvuun mahalaukun syöpäsolujen AGS määritettiin yksikerroksista pesäkemuodostusta. Pakko ilmentyminen CHD5 in AGS-soluissa varmistettiin RT-PCR: llä (Fig. 4A). Pesäkkeiden lukumäärä, jotka on muodostettu levyyn solut yli-ilmentävät CHD5 väheni merkitsevästi (p
< 0,01) (Fig. 4B ja 4C), mikä osoittaa, että CHD5 voi estää kasvua mahalaukun syöpäsoluja. Kuva 4 CHD5 estää kasvun mahasyövän solulinjan AGS. Vaikutus Kohdunulkoisten CHD5 ilme kasvaimen solujen kasvua tutkittiin yksikerroksista pesäkemuodostusta. A, CHD5 ilmentyminen AGS-soluissa transfektion jälkeen määritettiin RT-PCR: llä. Valokuva pesäkkeiden muodostettu AGS transfektoitujen solujen pcDNA3.1 (vektori) tai pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) on esitetty B. C, määrälliset analyysit pesäkkeen numerot on esitetty arvoina keskiarvo ± keskihajonta. P
arvot laskettiin käyttäen opiskelijan t-testiä. Tähti osoittaa tilastollista merkitsevä ero (p
< 0,01).
Keskustelu
Useiden viime vuosina monet APT on todettu olevan epigeneettiseltä inaktivoitu mahasyövän, mikä osoittaa, että epigeneettiset vaiennettu APT on yksi merkittäviä molekulaarisia muutoksia prosessissa mahasyövän [22-25]. Tässä tutkimuksessa CHD5 tunnistettiin toinen mahdollinen TSG joiden epigeneettisellä inaktivoitumista voi myötävaikuttaa mahasyövän. Se oli usein alassäädetty kautta promoottori hypermetylaation mahasyövän solulinjoissa. Ektooppinen ilmentyminen CHD5 johti kasvun estäminen mahalaukun syövän solujen, mikä osoittaa, että CHD5 toimii TSG epigeneettiseltä vaiennettu mahasyövän.
Promoottori hypermetylaatiota CHD5 syövän on havaittu muiden syöpien [17, 20]. Kuitenkin ilmaantuvuus CHD5 promoottorin metylaation mahasyövän solulinjoissa ja kasvainten havaittiin tässä tutkimuksessa on suhteellisen korkea verrattuna taajuus CHD5 metylaation muissa syövissä (yleensä alle 20%) [17, 20]. Tietenkin enemmän näytteitä on käytettävä vahvistaa tämän tuloksen samalla MSP-alukkeita seuraavissa tutkimuksissa. Siitä huolimatta meidän havainto viittaa siihen, että CHD5 inaktivointi voisi välittyvän eri mekanismien eri kudoksissa. Kun taas CHD5 inaktivoidaan kopioluvun poikkeavuutta erilaisissa syövissä [15, 16], vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) osoitti, että 1p36, The CHD5 sisältävä lokuksessa ei ole merkittävästi epätasapainoinen syöpien [26]. Sen sijaan, kuten tässä tutkimuksessa, CHD5 näyttää vaiennetaan pääasiallisesti promoottoriaktivoinnilla hypermetylaation mahasyövän.
On yhä enemmän todisteita siitä, että hypermetylaatiota APT promoottori on yksi suuri molekyyli muutoksia syövän kehittymisessä. Yleisyys CHD5 promoottorin hypermetylaatio mahasyövän voidaan tutkia ei vain mahasyövän diagnoosi mutta myös ennuste ennustus. Tämän vuoksi on tärkeää luonnehtia CHD5 promoottori metylaatio yhdessä kliinisiä tekijöitä, kuten ikä, sukupuoli, helikobakteeri-infektion, kasvaimen, Lauren luokittelu ja erilaistumista. Koska korkea heterogeenisyys ensisijainen mahakarsinooman kudoksia, metylaatio analyysit Tarkempaa kuten kvantitatiivinen metylaatiospesifisen analyysin avulla sequenom tai Taqman reaaliaikainen PCR on hyödyllistä arvioida, CHD5 promoottori metylaatio on käyttökelpoinen varhaisen mahasyövän havaitsemiseen ja ennusteen ennustaminen.
Vaikka promoottori metylaatio usein inaktivoi CHD5 mahasyövän solulinjoissa, emme voi sulkea pois muita mekanismeja menetys funktio CHD5 mahasyövän. CHD5 ilmentyminen on erittäin alhainen MKN28 ja SNU16 (Fig. 1), kuitenkin, promoottori CHD5 oli vain osittain metyloitu näissä kahdessa solulinjassa (kuvio. 2B), mikä osoittaa, että muut mekanismit voivat olla vastuussa hiljentämisen CHD5 joissakin mahasyövän solulinjoissa.
Johtopäätös
CHD5 oli usein alassäädetty kautta promoottori hypermetylaation mahalaukun syöpäsoluja. Ektooppinen ilmentyminen CHD5 johti kasvun estäminen mahalaukun syövän solujen, mikä osoittaa, että CHD5 toimii tuumorisuppressorigeenin epigeneettiseltä vaiennettu mahasyövän.
Ilmoitukset
Kiitokset
Kiitämme Dr Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Run Run Shaw sairaala, Zhejiangin yliopisto) hänen korvaamatonta neuvoja ja teknistä tukea. Teos on kuvattu tässä paperissa oli osittain tuettu avustusta Research Grants neuvosto Hongkongin erityishallintoalueen alueella, Kiinassa (hanke nro CityU 160508).
Kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alta linkit kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 4 Kilpailevat edut
Kirjoittajat ilmoittavat, että ne ei ole kilpailevia intressejä.

• Prognostisia vaikutus kasvutekijän reseptorin metastasoituneen mahalaukun syöpä
• Laparoskooppinen säädettävä porrastettuja Roux-en-Y mahalaukun ohitusleikkaus ensisijaisena menettely super-super-lihavilla (painoindeksi > 60 kg /m2)