CHD5 je down-regulovaná promótorom hypermetylace v žalúdku cancer

CHD5 je down-regulovaná promótorom hypermetylace u karcinómu žalúdka
abstraktné
pozadia
nehistonové chromozomálnych proteínov v zhode s históny hrajú dôležitú úlohu pri replikácii a oprave DNA a pri regulácii génovej expresie. Deregulácia týchto proteínov môže prispieť k rozvoju celého radu ochorení, ako je rakovina. Ako nehistonové chromozomálne proteín, viazanie chromodomain helikáza DNA proteín 5 (CHD5) bol nedávno identifikovaný ako produkt, ktorého román nádoru supresorický gén (TSG), podporovať transkripciu P19 ink4a stroje a p16 ARF
. Inaktivácia CHD5 bolo dosiahnuté čiastočne prostredníctvom genetickej delécie, pretože sa nachádza v 1p36, oblasť často odstránené v ľudských nádoroch. V tejto štúdii sa snažíme študovať zapojenie do CHD5 rakoviny žalúdka, druhou najčastejšou rakovinou na svete.
Metódy
CHD5 výraz v paneli nádorových buniek žalúdka boli stanovené kvantitatívne RT-PCR. Metylácia CHD5 bola hodnotená metyláciou špecifické PCR a hydrogensiričitanom sekvenovania genómu. Účinok CHD5 na rast buniek karcinómu žalúdka bola testovaná testom tvorby kolónií.
Výsledky
CHD5 expresie bola down-regulované vo všetkých bunkových línií karcinómu žalúdka použitý (100%, 7/7), a významne obnovená po farmakologická demetylácia. Metylácia CHD5 promótorom bola zistená u všetkých siedmich bunkových línií karcinómu žalúdka a vo väčšine primárnych karcinómu žalúdka skúmaných tkanivách (73%, 11 patnácttin). Napokon, ektopická expresia CHD5 do buniek karcinómu žalúdka viedlo k významnému inhibíciu rastu.
Záver
CHD5 bol TSG epigenetické down-regulovaný u rakoviny žalúdka.
Pozadie
všetkých eukaryotických organizmov, vyvinuli komplikované spôsoby obalov DNA do chromatínu cez dynamických interakcií rôznych proteínov, DNA spojené. Takéto balenia je dôležité pre ukladanie genetickej informácie s vysokou vernosťou a integrity, ale aj pre prenos genetickej informácie z DNA na RNA v pevne kontrolovaným spôsobom nielen. Proteíny, ktoré sa viažu na DNA, ktorá má tvoriť chromatín sú tradične rozdelený do dvoch všeobecných tried: histónov a nehistonové chromozomálnych proteínov. Históny sú skupinou vysoko konzervovaných viazanie DNA proteínov a ich rôzne post-translačný modifikácie histónov predstavujú "kód", ktorý vedie obal DNA alebo chromatínu remodelácia. Histon kód je začaté, udržiavaný a interpretované do značnej miery nehistonové chromozomálnych proteínov [1-4]. Napríklad, acetylácia lysinových zvyškov na Histon chvosty podľa histonové acetyltransferázy (čiapky), neutralizuje svoj náboj a znižuje afinitu histónov s DNA, čo DNA prístupná pre transkripčné faktory, ktoré iniciujú transkripciu génu. Naopak, deacetyláciou týchto zvyškov podľa histondeacetyláz (HDACs) obnovuje túto afinitu a môžu vyberať z DNA transkripčný strojov [5]. Okrem acetylácia, fosforylácie a metylácii chvostov Histon sú dôležité pre dynamické spojenie DNA s transkripčný strojov a iných chromozomálnych proteínov [6-8]. Nehistonové chromozomálne proteíny hrajú dôležitú úlohu vo výklade Histon kódu tvoria remodeláciu chromatínu komplexy. Ako históny a nehistonové chromozomálne proteíny sú dôležité pre reguláciu génovej expresie, replikácie DNA a oprava DNA. Že deregulácia na expresiu a aktivitu týchto proteínov môže viesť k vývoju rôznych ochorení, ako je rakovina [9-13].
V nedávnej štúdii, chromodomain helikázy DNA viažuci proteín 5 (CHD5) bol identifikovaný ako román nádorový supresorový gén (TSG) u neuroblastómu [14]. CHD5 patrí do superrodiny SWI2 /SNF2 súvisiacich ATPázy, jednej hlavnej skupiny nehistonové chromozomálnych proteínov. CHD5 kóduje jedinečnú kombináciu funkčných domén pozostávajúce z dvoch N-koncových chromodomains, nasledovaný SWI2 /SNF2-ATPázy, ako je /helikázovou doménu a doménu viažuci DNA [14]. Reguláciou štruktúru chromatínu, CHD5 môže podporovať expresiu P19 ARF, ktoré slúžia na stabilizáciu p53, nádorového supresor vypína vo viac ako polovici všetkých ľudských rakovín [15]. CHD5 je prítomná v génovom mieste (1p36.31) vypúšťa do asi 35% neuroblastómu [16]. CHD5 sa predtým myslelo, ktoré majú byť špecificky exprimovaný v nervovom systéme, ale jeho úloha v rakoviny v iných tkanivách sa začína objavovať [17]. CHD5 gén bol nájdený významne zmazaný v gliómu [18]. Okrem deléciu génu, CHD5 možno potlačiť pomocou iných mechanizmov. V niektorých prípadoch neuroblastómu, existujú dôkazy, že expresia je CHD5 epigenetické potlačená promótorom hypermetylace [19], aj keď toto nebolo potvrdené inej štúdii [20]. V poslednej dobe bolo zistené, že CHD5 promótor sa methyluje v malých podskupín prsníka (4,4%), hrubého čreva (10%), vaječníkov (15%) a glióm (17%) nádorov [17, 20], čo naznačuje, epigenetické umlčanie CHD5 metyláciou môže hrať úlohu v čiastočnej vzniku nádorov v týchto tkanivách. Tu sme zistili, že, na rozdiel od iných typov rakoviny boli doteraz, CHD5 bol často hypermethylated u karcinómu žalúdka (73% nádorov a 100% bunkovej línie). Ektopickej expresie CHD5 do buniek karcinómu žalúdka viedlo k významnému inhibíciu rastu. Tento zarážajúce korelácia epigenetické potlačenie CHD5 a rakoviny žalúdka naznačuje doteraz neznámu vzťah medzi týmto TSG a žalúdočné vzniku nádorov.
Metódy
tkanivové kultúry a RNA /extrakcie DNA
Všetky žalúdočných nádorových bunkových línií (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 a NCI-N87) boli získané od Riken génovej banky (Tsukuba, Ibaraki, Japonsko) a American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Všetky bunkové línie rakoviny boli stanovené z karcinómov žalúdočných epiteliálnych buniek. Pokiaľ nie je výslovne uvedené, bunky boli pestované v médiu RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), doplnenom 10% fetálnym bovinným sérom pri 37 ° C s 5% CO 2 a 95% vlhkosťou. Farmakologické demetyláciou, bunky boli ošetrené s 5 uM 5-aza-2'-deoxycytidínu (AZA) (Sigma, St. Louis, MO, USA) počas troch po sebe idúcich dní [21]. Aza bola doplňovaná každých 24 hodín. Ekvivalentné koncentrácie nosiča (DMSO), bol použitý ako kontrola. Pre primárne tkaniva, normálne žalúdočné tkaniva boli definované ako non-zápal a nenádorových tkanív. Všetky tkanivá karcinómu žalúdka, adenokarcinómu, sú tkanivá. Celková RNA a genomická DNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu.
Kvantitatívne real time RT-PCR
reakcia reverznej transkripcie bola vykonaná za použitia 1 ug celkovej RNA s reverznej transkripciou systému (Promega, Madison , WI, USA). Úrovne expresie mRNA z CHD5 bola stanovená kvantitatívne real-time RT-PCR SYBR Green Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Glyceraldehyd-3-phosohate dehydrogenázy (GAPDH) bola použitá ako vnútorná kontrola integrity RNA. Primery použité pre CHD5 RT-PCR boli CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC a CHD5-R :. 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
metylácie špecifická PCR (MSP)
metylácie stave CHD5 bol určený pomocou MSP bisulfátu upravené genómovej DNA ako templátu. Genómovej DNA bola hydrogensiričitan ošetrené Zymo DNA modifikácie Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) podľa protokolu uvedeného. MSP bola vykonávaná po dobu 40 cyklov s teplotou žíhanie pri teplote 62 ° C, ako bolo opísané skôr [22]. Metylácia špecifické primery boli: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (od -525 do -506 vzhľadom k startovnímu miestu transkripcie) a CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (od -438 do -418), a unmethylation špecifické primery: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT a CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Všetky primery boli potvrdené predtým za to, že zosilňovanie žiadnu unbisulfited DNA
hydrogénsiričitanu sekvenovania genómu (BGS)
hydrogensiričitanovú upravené DNA bola amplifikovaná s použitím primerov BGS, CHD5-BF :. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (od -724 do -701) a CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (od -324 do -301). PCR produkty boli čistené s Illustré GFX ™ PCR a súpravy čistenie ako pruh na gélu (GE Healthcare vedy o živote, Uppsala, Švédsko) a klonovaný do pCR4-TOPO vektora pre sekvencovanie (Invitrogen). Aspoň 6 kolónie boli náhodne vybrané pre extrakciu plazmidu a sekvenačnej analýzou.
Konštrukcia CHD5 expresné plazmidy
CHD5 expresný plazmid bol konštruovaný klonovaním plnej dĺžky CHD5 otvoreného čítacieho rámca do cicavčieho expresného vektora pcDNA3.1. Otvorený čítací rámec CHD5 bol amplifikovaný z normálneho žalúdka cDNA pomocou vysoko verné DNA polymerázy PFU (Invitrogen) a klonovaný do pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Po overení sekvenčné, vložka bol subklonován do pcDNA3.1 reštrikčnými enzýmami Hind III a XBA I.
test tvorby kolónií
prechodne transfekovány AGS bunky s prázdnym pcDNA3.1 alebo pcDNA3.1-CHD5 boli použité k monovrstvě test tvorby kolónií. Bunky boli kultivované cez noc v 12-jamkové doštičky (1,0 x 10 5 /jamka) a transfekovány pcDNA3.1 alebo CHD5 exprimujúcim vektorom za použitia Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen). O 48 hodín neskôr sa transfektanty boli znova nanesené v triplikátech a kultivované po dobu 10-15 dní v kompletnom médiu RPMI1640 s obsahom G418 (400 ug /ml). Preživší kolónie boli zafarbené s horko Violet Po fixácii metanolom a kolónie presahujúce určitú veľkosť (≥ 50 bunky) boli spočítané. Experimenty boli opakované trikrát.
Výsledky
Down-regulácia expresie v CHD5 žalúdočnej nádorových bunkových línií
Expresia CHD5 v žalúdočných nádorových bunkových línií bol stanovený kvantitatívnej RT-PCR. Kým CHD5 bol vysoko exprimovaný v normálnej žalúdočnej tkaniva, jej prejavy boli down-regulované vo všetkých 7 žalúdočné rakovinové bunkové línie (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 a NCI-N87 SNU1 a SNU16) (obr. 1). Obrázok 1 CHD5 je down-regulovaná v žalúdočných nádorových bunkových línií. Expresie CHD5 v žalúdočných nádorových bunkových línií bol stanovený pomocou RT-PCR. GAPDH bola použitá pre normalizáciu expresie CHD5. Normálne žalúdočné tkaniva (žalúdok), bol použitý ako referencie. Výsledky kvantitatívnej real-time RT-PCR bolo ukázané v hornom paneli a v dôsledku bežného RT-PCR bol uvedený v dolnom paneli.
Promoter hypermetylace z CHD5 v žalúdočných nádorových bunkových línií a primárnych karcinómu tkaniva žalúdka
Typické CPG Island (CGI) bolo zistené okolo CHD5 exónu 1 použitím nasledujúcich kritérií: GC obsah > 55% ObsCpG /ExpCpG > 0,65 a dĺžka > 500 bp (obr 2A.). Stav metylácie tohto CGI v nádorových bunkách žalúdka sa stanovuje metylácie špecifické PCR (MSP). Ako je znázornené na Obr. 2B, úplné alebo čiastočné metylácie bola detekovaná vo všetkých 7 žalúdočných nádorových bunkových línií sme sa zaoberali. V súlade s údajmi o bunkovej línie žalúdka sa CHD5 promótor bol tiež methyluje vo väčšine tkanív, karcinómu žalúdka primárne testovaných (73%, 11/15) (obr. 2C). Dôležité je, že metylácie promótorom CHD5 bol buď nepozorovane, alebo slabo detegovateľný v normálnych tkanivách, ktoré susedia s nádormi u rovnakých pacientov a v žalúdočných tkanivách zdravých jedincov. Navyše metylácie promótorom CHD5 v žalúdočnej bunkových línií karcinómu a karcinómu žalúdka tkanív bola potvrdená hydrogénsiričitanu sekvenovania genómu (BPS) (obr. 2D). Dohromady, CHD5 bol umlčaný prevažne u karcinómu žalúdka a promótor hypermetylace sa zdá byť hlavným mechanizmom CHD5 umlčanie v tumorigenezi tohto tkaniva. Obrázok 2 CHD5 promótor je hypermethylated u karcinómu žalúdka. A, CHD5 má typickú CPG ostrova (CGI) okolo jeho exón 1. CGI bola vynesená programom GeneTool. Polohy BGS a MSP primery boli označené ako šípky. B, Stav metylácie promótorom v CHD5 buniek karcinómu žalúdka bola stanovená metylácie špecifické PCR. M: metylácie; U: unmethylation. C, Stav metylácie CHD5 promótorom v primárnych karcinómu žalúdka tkanivách bola stanovená pomocou metylácie špecifickú PCR ako v B. normálnej žalúdočné tkaniva a okolitom normálnom tkanív, boli použité ako kontroly. N1 a N2 sú normálne žalúdočné tkaniva. T1 a T2 ukazujú, karcinóm žalúdka, zatiaľ čo tkanivá A1 a A2 predstavujú okolitom normálnom tkanív. Bolo preukázané zastúpené výsledky. D, Metylácia CHD5 promótorom v žalúdočnej nádorových bunkových línií a primárnych karcinómu žalúdka tkanív bola potvrdená BPS. Každý kruh označuje jednu pozíciu a kruhy vyplnené v čiernom CPG predstavujú methyluje CPG miest. Jeden riadok kruhov predstavuje jediné kolónie.
Up-regulácia expresie CHD5 po liečbe Aza
Pre ďalšie potvrdenie promótor CGI hypermetylace sprostredkované CHD5 umlčanie v žalúdočnej rakovinové bunkové línie, CHD5 výrazy v AGS a Kato III pred a po demetylovaného činidlá boli analyzované liečba Aza. Obe bunkové línie vykazujú úplnej metylácie promótorom CHD5. CHD5 expresie v týchto dvoch bunkových línií boli významne zvýšila po Aza-indukovanej demetyláciou CHD5 promótorom (obr. 3A a 3B), ktoré preukazujú, že CHD5 skutočne epigenetické umlčaný v karcinómu žalúdka. Obrázok 3 Farmakologická demetylácie aktivuje CHD5 expresiu v žalúdočných nádorových bunkových línií. A, relatívna CHD5 výrazy pred ošetrením a po ošetrení Aza boli stanovené pomocou RT-PCR, ako na obr. 1. GAPDH bola použitá pre normalizáciu množstva šablóny. B, demetyláciu CHD5 promótorom v bunkách po ošetrení AGS Aza bola potvrdená BPS, ako na obr. 2D.
Funkcia Rast inhibičný CHD5
potlačenie nádoru majetku CHD5 v nádorových bunkách žalúdku bol vyšetrovaný stratégie gain-of-funkcie. Plné otvorený čítací rámec (ORF) o CHD5 bol klonovaný do cicavčieho expresného vektora pcDNA3.1. Vplyv ektopickej expresie CHD5 na rast buniek karcinómu žalúdka AGS bola stanovená testom tvorby kolónií monovrstva. Nútené expresie CHD5 v AGS buniek bola potvrdená pomocou RT-PCR (obr. 4A). Počet kolónií vytvorených na doske buniek s nadmernou expresiou CHD5 bola významne znížená (p Hotel &0,01) (obr 4B a 4C.), Čo naznačuje, že CHD5 môže potlačiť rast buniek karcinómu žalúdka. Obrázok 4 CHD5 inhibuje rast karcinómu žalúdka bunkové línie AGS. Vplyv ektopickej CHD5 prejave na rast nádorových buniek bola skúmaná pomocou testu jednovrstvová kolónie formácie. A, CHD5 expresie v AGS bunkách po transfekciu bola stanovená pomocou RT-PCR. Fotografie kolónií vytvorených AGS buniek transfekciou pcDNA3.1 (vektor) alebo pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) bol uvedený v B. C, kvantitatívnej analýzy čísel kolónie sú uvedené ako hodnoty priemeru ± štandardnej odchýlky. P
hodnoty boli vypočítané s použitím Studentovho t-testu. Hviezdička označuje štatisticky významný rozdiel (p Hotel < 0,01).
Diskusia
počas posledných niekoľkých rokov, bolo zistené, že veľa ZTS byť epigenetické inaktivovaná u karcinómu žalúdka, čo naznačuje, že epigenetické umlčanie zaručené tradičné špeciality patrí veľkej molekulárnej zmeny v procese žalúdočnej karcinogenézy [22-25]. V tejto štúdii, CHD5 bol identifikovaný ako ďalší potenciálny TSG ktorého epigenetické inaktiváciu môže prispieť k žalúdočnej karcinogenéze. To bolo často down-regulovaná promótorom hypermetylace v žalúdočnej nádorových bunkových línií. Ektopickej expresie CHD5 viedla k inhibícii rastu buniek karcinómu žalúdka, čo ukazuje, že pôsobí ako CHD5 TSG epigenetické umlčaný v karcinómu žalúdka.
Promoter hypermetylace z CHD5 rakoviny bolo pozorované u iných druhov rakoviny [17, 20]. Avšak, výskyt CHD5 metylácie promótorom v žalúdočnej nádorových bunkových línií a nádorov bol nájdený v tejto štúdii byť pomerne vysoká, v porovnaní s frekvenciou CHD5 metylácie v iných nádorov (všeobecne nižší ako 20%) [17, 20]. Samozrejme, že viac vzoriek by mal byť použitý na potvrdenie tohto výsledku s rovnakými MSP priméry v nasledujúcich štúdiách. Avšak, naše výsledky naznačujú, že CHD5 inaktivácie môže byť sprostredkovaná rôznymi mechanizmami v rôznych tkanivách. Vzhľadom k tomu, CHD5 sa inaktivuje pomocou počtu kópií abnormality v rôznych druhov rakoviny [15, 16], komparatívna genomická hybridizácia (CGH) je uvedené, že 1p36 je CHD5 obsahujúce génové miesto, nie je významne nevyvážený v karcinómov žalúdka [26]. Namiesto toho, ako je ukázané v tejto štúdii, CHD5 sa zdá byť umlčaný prevažne od promotora hypermetylace v karcinómu žalúdka.
Existuje stále viac dôkazov, že hypermetylace o TSG promótorom predstavuje jeden z hlavných molekulárnych zmien vo vývoji rakoviny. Vysoký výskyt CHD5 promótorom hypermetylace rakoviny žalúdka môže byť skúmané nielen ako žalúdočné diagnózu rakoviny, ale aj prognóza predikciu. Za týmto účelom je dôležité, aby charakterizovať CHD5 metylácie promótorom v spojení s klinickými charakteristikami, ako je vek, pohlavie, infekcie H. pylori, grade tumoru, Lauren klasifikácie a diferenciácie. Vzhľadom na to, že vysoká heterogenita primárnych karcinómu tkaniva žalúdka, metylácia analýzy s vyšším rozlíšením, ako je kvantitatívne metylácie osobitnú analýzu pomocou sequenom alebo TaqMan PCR v reálnom čase bude užitočné pre posúdenie toho, či CHD5 metylácie promótorom je užitočné pre žalúdočné včasnú detekciu rakoviny a predikcie prognóza.
Aj keď promotér metylácie často deaktivuje CHD5 v žalúdočnej rakovinové bunkové línie, nemôžeme vylúčiť prítomnosť iných mechanizmov pre funkciu stratovosti CHD5 u rakoviny žalúdka. CHD5 expresie je veľmi nízka v MKN28 a SNU16 (obr. 1), avšak promótor CHD5 iba čiastočne metylovaný v týchto dvoch bunkových línií (obr. 2B), čo naznačuje, že iné mechanizmy môžu byť zodpovedné za umlčanie CHD5 v niektorých žalúdočných nádorových bunkových línií.
Záver
CHD5 bol často down-regulovaná promótorom hypermetylace do buniek karcinómu žalúdka. Mimomaternicové vyjadrenie CHD5 viedla k inhibíciu rastu rakovinových buniek žalúdka, čo naznačuje, že CHD5 funguje ako supresorové gén nádoru epigenetické umlčaný u karcinómu žalúdka.
Vyhlásenie
Poďakovanie
Ďakujeme Dr. Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Runrun Shaw nemocnice, Zhejiang University) za jeho cenné rady a technickú podporu. Práca opísané v tomto dokumente bol čiastočne podporený grantom z Rady pre výskumné granty v Hong Kong osobitnej administratívnej oblasti, Čína (projekt č city 160508). Pôvodné predložené súbory
autorov pre obrázky
Nižšie sú uvedené odkazy na pôvodné predložených súborov autorov pre obrázky. "Pôvodný súbor pre Obrázok 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg autorského 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg autorov pôvodného súboru na obrázku 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg autorského pôvodného súboru pre Obrázok 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg autorského pôvodného súboru na Obrázok 4 protichodnými záujmami
autori vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy.

• Prognostická vplyv receptora epidermálneho rastového faktora u pacientov s metastatickým karcinómom žalúdka
• Laparoskopickej nastaviteľný pruhovaný Roux-en-Y žalúdočnej bypass ako primárny postup pre super-super-obezitou (body mass index telesnej > 60 kg /m2)