Bakteriedödande verksamhet katjoniska steroiden CSA-13 och cathelicidin peptiden LL-37 mot Helicobacter pylori i simulerad magsaft

Bakteriedödande verksamhet katjoniska steroiden CSA-13 och cathelicidin peptiden LL-37 mot Helicobacter pylori
i simulerad magsaft Bild Sammanfattning
Bakgrund
världsomspännande utseende av läkemedelsresistenta stammar av H. pylori
motiverar ett sökande efter nya medel med terapeutisk potential mot denna familj av bakterier som koloniserar magsäcken, och är associerad med adenokarcinom utveckling. Denna studie var utformad för att utvärdera in vitro
anti-H. pylori
potential cathelicidin LL-37-peptiden, som är naturligt närvarande i magsaft, sin optimerade syntetisk analog WLBU2, och den icke-peptid antibakteriellt medel ceragenin CSA-13.
Resultat
I överensstämmelse med tidigare studier , ökat uttryck av HCAP-18 /LL-37 observerades i magslemhinna som erhållits från H. pylori
infekterade individer. MBC (minsta baktericida koncentration) värden bestämdes i näringsinnehållande medium intervallet 100-800 pg /ml för LL-37, 17,8 till 142 ^ g /ml för WLBU2 och 0.275-8.9 ig /ml för ceragenin CSA-13. Dessa data indikerar betydande, men mycket olika antibakteriella aktiviteter mot kliniska isolat av H. pylori
. Efter inkubation i simulerad magsaft (lågt pH med närvaron av pepsin) CSA-13, men inte LL-37 eller WLBU2 behöll antibakteriell aktivitet. Jämfört med LL-37 och WLBU2 peptider, CSA-13-aktivitet var också mer resistent mot inhibition genom isolerad värdgastriska muciner.
Slutsats
Dessa data indikerar att cholsyra baserade antimikrobiella medel, såsom CSA-13 motstå proteolytisk nedbrytning och hämning av mucin och har potential för behandling av H. pylori
infektioner, inklusive sådana som orsakas av klaritromycin och /eller metronidazol-resistenta stammar.
bakgrund
Helicobacter pylori
bärs av mer än hälften av världens vuxna befolkning [1]. Det kan kroniskt kolonisera den humana magslemhinnan, där det konstateras i slemlager och följs epitelceller [2]. Även om de flesta infekterade individer förblir asymtomatisk, infektion med H. pylori
kan främja svår gastrit [3] och avsevärt öka risken för magsår maligniteter [4, 5]. I några epidemiologiska studier, var H. pylori
utrotning visat sig vara effektiva i gastrisk cancerprevention [6, 7]. Dessutom var H. pylori
utrotning visat sig minska förekomsten och svårighetsgraden av lesioner med cancerframkallande potential i djurmodeller [8, 9]. Naturliga mekanismer som skyddar värden från H. pylori
infektioner beroende på funktionen av det medfödda försvarssystemet i vilket antibakteriella peptider såsom cathelicidin LL-37 [10, 11] och O-glykaner i gastrisk mucin [12] spela en nyckelroll.
LL-37 är en proteolytiskt bearbetad peptid härledd från den C-terminala domänen av human cathelicidin (HCAP-18 /LL-37) som konstitutivt släpps till det extracellulära utrymmet av fagocytiska granulocyter och epitelceller [13] . Funktioner som tillskrivits LL-37 innefattar förebyggande av bakterietillväxt [14], neutralisering av bakteriell vägg molekyl bioaktivitet [15], och aktivering av värdceller genom att binda specifika cellmembranreceptorer [16-18]. H. pylori
uppreglerar produktionen av LL-37 /hCAP18 av mag epitel, vilket tyder på att cathelicidin eller dess derivat LL-37 bidrar till att bestämma balansen mellan värd mucosal försvar och H. pylori
överlevnadsmekanismer som styr kronisk infektion med denna gastric patogen [10, 11]
. Katjoniska antibakteriella peptider (CAP), inklusive LL-37 har undersökts som en potentiell källa till nya antibakteriella molekyler. Den konstruerade WLBU2 peptid vars rester är anordnade att bilda en amfipatisk helixstruktur med optimal laddning och hydrofoba densitet, övervinner vissa begränsningar av naturliga LL-37, såsom känslighet för Mg 2+ eller Ca 2 + och inaktivering genom blod serum [19]. WLBU2 kunde därför behandla infektioner där LL-37 är ineffektiv. För att alstra molekyler med förmåga att efterlikna CAP förmåga att kompromissa bakteriell membranintegritet, icke-peptid ceragenins med katjonisk, var facially amfifila strukturer som är karakteristiska för de flesta antimikrobiella peptider utvecklats. Ceragenins såsom CSA-13 återge krävs CAP morfologi med hjälp av en galla syra byggnadsställningar och bifogade amingrupper [20]. De är bakteriedödande mot både grampositiva och gramnegativa organismer, inklusive läkemedelsresistenta bakterier som kliniskt relevant MRSA
(MRSA), och en tidigare mottaglighet studie visade att CSA-13 har en MIC 50 /MBC 50 förhållande av 1 [21, 22]. I denna studie jämför vi den bakteriedödande potensen hos LL-37, WLBU2 och CSA-13 mot kliniska isolat av H. pylori
. Resultaten tyder på att cholsyra baserade härmar av antimikrobiell peptid såsom CSA-13 har potential för behandling av H. pylori
infektion, inklusive de som orsakas av klaritromycin och /eller metronidazol-resistenta stammar.
Resultat
immunohistokemisk sondering av magslemhinnan sektioner mänskliga med anti-HCAP-18 /LL-37-antikropp
Mikroskopiska bilder av mukosala biopsier efter immunohistokemisk utvärdering med anti-HCAP-18 /LL-37-antikropp visas i Figur 1. DAB- positiv färgning indikerar närvaron av LL-37 peptid och /eller dess moderproteinet HCAP-18. Hög intensitet DAB färgning (indikeras med brun färg) vid slemproducerande epitelceller och fundic körtlar indikerar hög ansamling av HCAP-18 /LL-37 peptid troligen drivs av LL-37 specifik interaktion med mucin, som rapporterades i tidigare studier [23, 24]. Fördelningen av HCAP-18 /LL-37 i mer differentierade epitelceller befolkningen i magslemhinnan skiljer sig från den som konstaterats för human β-defensin 2 [10] eller lysozym [25], men liknar den som observerades i tjocktarmen [26 ]. Magslemhinnan biopsier från patienter infekterade med H. pylori
visa högre intensitet DAB färgning jämfört med de som erhållits från icke-infekterade individer. Enligt tidigare rapporter indikerar resultatet en värdförsvars svar på H. pylori
[11], som delvis bygger på ökat uttryck av HCAP-18 /LL-37 från gastric epitelceller. Figur 1 Förekomst av HCAP-18 /LL-37 peptid i mukosala biopsier från den mänskliga magsäcken detekteras med användning av immunohistokemisk analys med monoklonala antikroppar mot humant CAP-18 /LL-37. Prov A /B och C /D representerar prover som erhållits från icke-infekterade och H. pylori
infekterade individer respektive. Data som visas är representativa för fem experiment.
Bakteriedödande aktivitet av LL-37, WLBU-2-peptider och ceragenin CSA-13 mot olika stammar av H. pylori
att identifiera resistenta stammar, kliniska isolat av H. pylori
utsattes för MIC utvärdering (Tabell 1) med ett flertal antibiotika som för närvarande används vid klinisk behandling av H. pylori
infektion. Bland sju testade isolat erhållna från olika ämnen, stam 4 var resistent mot metronidazol och stammar 5, 6, 7 var resistenta mot både metronidazol och klaritromycin. Alla isolat var känsliga för amoxicillin och tetracyklin. I överensstämmelse med tidigare rapporter om effekterna av HBD-1, H-BD-2 och LL-37 peptider mot H. pylori
[10, 11] alla isolerade stammar av H. pylori
dödades efter 6 timmars inkubation med LL-37, WLBU2 och CSA-13 med snitt MBC (Mg /ml) värden 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 och 0,31 ± 0,25 när MBC utvärderades i HEPES-buffert, eller 300 ± 232, 53 ± 41 och 2,98 ± 3,11 när MBC utvärderades i Brucella buljong Bullion respektive (figur 2). Utvärdering av MBC-värden i HEPES-buffert med tillsats av 2 mM MgCb 2 för H. pylori
ATCC 43504 visade en åtta-faldig ökning för LL-37, och en fyra-faldig ökning för både WLBU2 och CSA-13 (data inte visa). Figur 2 bakteriedödande aktivitet mot H. pylori. Minsta bakteriedödande koncentration (MBC) av LL-37 (vit spalt), WLBU2 (grå kolumn) och CSA-13 (svarta kolumnen) mot H. pylori
(ATCC 43504 stam och sju kliniska isolat erhållna från slemhinnor prover från olika ämnen ) utvärderades i HEPES (panel A) eller Brucella-buljong Bulion (panel B). MBC indikerar koncentrationer vid vilka föreningar fullständigt utrota en ymp av H. pylori
.
Tabell 1 Utvärdering av känsligheten hos kliniska stammar av H. pylori
mot antibiotika.
H. pylori
stammar
Antibiotika
AMX
CLR
TET
Metronidazol
ATCC 43504
0,016
0,094
0,25
64,0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0,25
64,0 ®
1,0
96,0 ®
6
0,032
1,5 ®
1,5
32,0 ®
7

0,047 1,5 ®
2,0
48,0 ®
MIC-värden (pg /ml) (AMX-amoxicillin, CLR-klaritromycin, TET-tetracyklin) Review Antibakteriell aktivitet av LL-37, WLBU2 och CSA-13 efter förinkubering vid lågt pH med pepsin eller mucin
Förutom kända hämning av CAP antibakteriella aktivitet genom divalenta katjoner, såsom Mg 2 + och Ca 2 +, den proteolytiska aktiviteten pepsin kan negativt CAP funktion i magsaft miljö med närvaro av muciner, och lågt pH. Att ta itu med denna möjlighet vi utvärderade antibakteriell aktivitet mot Escherichia coli
MG1655 efter 3 timmar före inkubation av LL-37, WLBU2 och CSA-13 i simulerad magsaft jämfört med aktivitet efter deras pre-inkubation i PBS vid pH 7,4 . Innan de utför dödandet analysen, pH-värdet för prover med lågt pH och lågt pH /pepsin justerades till 7,4. Den antibakteriella aktiviteten hos LL-37 och WLBU2 peptider mot E. coli
MG1655 ändrades inte signifikant efter förinkubering vid pH ~ 1,5, men förlorades efter förinkubering vid pH ~ 1,5 i närvaro av pepsin (figur 3A och 3B). I motsats, den antibakteriella aktiviteten hos CSA-13 var oförändrad genom förinkubation vid pH ~ 1,5 med eller utan pepsin (Figur 3C). Å andra sidan, var bakteriedödande aktiviteter av alla komponenter äventyras i olika utsträckning när den testades med hjälp av en bakteriedödande analys i närvaro av renat gastric mucin. I nära överenskommelse med resultat som erhållits från denna E. coli
MG1655 studie, MBC värden av LL-37-peptiden utvärderades efter 1H pre-inkubation med buffert vid lågt pH innehållande pepsin eller mucin ökades men de av CSA-13 var nästan oförändrad (Figur 3D). Samtliga utvärderade medel förlorade antibakteriell aktivitet i PBS supplementerat med 10% humant galla (en koncentration som inte interfererar med E. coli
MG1655 tillväxt - data ej visade). Detta resultat tyder på att fysikalisk-kemiska egenskaperna hos antibakteriella molekyler främja deras införande i galla lipoprotein, vilket begränsar deras interaktion med den bakteriella väggen. Det har inte funnits någon studie för att utvärdera antibakteriella aktiviteten hos CAP i duodenal juice, men dessa resultat tyder på att galla reflux i magen kan störa CAP aktivitet. Figur 3 Antibakteriell aktivitet mot E. coli MG1655 och H. pylori stam ATCC 43504. Antibakteriell aktivitet hos LL-37 (panel A), WLBU2 (panel B) och CSA-13 (panel C) mot E. coli
MG1655 efter förinkubation (3 h vid 37 ° C) i PBS (ofyllda cirklar), simulerad magsaft vid pH ~ 1,5 (kvadrater), simulerad magsaft med pepsin (diamanter), simulerad magsaft med mucin (trianglar) och PBS med human galla (10%), som erhållits från gallblåsan (fylld cirkel). Data som visas är medelvärden ± SD av tre till fyra experiment. MBC av LL-37 (vita kolumnen) och CSA-13 (svarta kolumnen) (panel D) mot H. pylori
(ATCC 43504) efter förinkubering (1 h vid 37 ° C) i simulerad magsaft vid pH ~ 1,5 (A), simulerad magsaft med pepsin (B) och i närvaro av mucin (C) Review Analytisk karakterisering av LL-37 och CSA-13 efter inkubation med pepsin
Masspektrometri-analys (Figur 4) avslöjar att tre timmars inkubering med pepsin resulterar i omfattande nedbrytning av LL-37. Men vid lågt pH, är pepsin digestion högspecifik och LL-37 peptidklyvning är begränsad till platsen med hydrofoba aminosyror. Potentiella klyvningsställen förutsägs av PeptideCutter karakterisering programvara http:.. //Kr ExPASy org /verktyg /peptidecutter /tyder på att LL-37 spjälkning med pepsin i våra experimentella betingelser ska släppa 11 produkter, inklusive 3 kortare peptider (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD och LVPRTES). Dessa förutsägelser är förenliga med masspektralanalys, som inte visar förekomst av intakt LL-37 kvarvarande efter inkubation med pepsin vid lågt pH, men avslöjar uppkomsten av flera nya toppar med olika retentionstider. Den kvarvarande antibakteriella aktiviteten hos LL-37 efter behandling med pepsin (Figur 3A och 3D) i dödandet analyser utgör sannolikt den återstående aktiviteten hos dessa LL-37 fragment. I motsats till den observerade nedbrytningen av LL-37, var CSA-13 analytisk karaktärisering inte förändrats efter inkubation med pepsin vid lågt pH. Figur 4 Masspektrometri-analys. Masspektrometri-analys av LL-37 (panel A) och CSA-13 (panel B) i PBS (kurva 1) buffert med lågt pH (kurva 2) och buffert med lågt pH med närvaro av pepsin (kurva 3). Den totala jonkromatogram (TIC) presenteras för varje prov tillstånd med en infälld massa till laddning (m /z) spektra visar intensiteten för inramade TIC toppar. Molekylvikten för intakt LL-37 är 4494, som kan observeras med flera avgifter (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 MW = 900, etc) i positiv jon-läge. Molekylvikten för CSA13 är 678, som kan observeras direkt och med flera avgifter. Data från ett experiment visas.
Toxicitet av LL-37, WLBU2 och CSA-13 mot RBC och mänskliga adenokarcinomceller
Ospecifik införande av antibakteriella peptider och deras härmar i värdcellmembran kan orsaka toxicitet. Värdcellmembranet permeabilization kan mätas genom frisättning av proteiner, såsom hemoglobin och LDH från cytosolen till det extracellulära utrymmet. Genom att utvärdera hemoglobin och LDH-frisättning (figur 5A och 5B), visar vi ingen signifikant membran permeabilization av några testade molekyler i det område inom vilket de har bakteriedödande aktivitet i saltbuffertar (Figur 2A, Figur 3). Denna upptäckt bekräftades genom mikroskopisk utvärdering av adenokarcinom cellmorfologi visar inga synliga skillnader mellan kontrollceller och de som behandlats med 10

• Utvärdering av passagen av Lactobacillus gasseri K7 och bifidobakterier från magen till tarmarna genom att använda en enda reaktor model
• Ballong tilltäppt retrograd transvenösa utplåning för magvaricer: förhållandet mellan det kliniska resultatet och gastrorenal shunt ocklusion