Bakteriedrepende virkninger av kationiske steroid CSA-13 og den cathelicidin peptid LL-37 mot Helicobacter pylori i simulert mage juice

bakteriedrepende virkninger av kationiske steroid CSA-13 og den cathelicidin peptid LL-37 mot Helicobacter pylori
i simulert magesaft
Abstract
Bakgrunn
verdensomspennende utseende av resistente stammer av H. pylori
motiverer et søk etter nye agenter med terapeutisk potensial mot denne familien av bakterier som koloniserer magen, og er assosiert med adenokarsinom utvikling . Denne studien er designet for å vurdere in vitro
anti-H. pylori
potensialet av cathelicidin LL-37 peptid som er naturlig til stede i mavesaft, det optimaliserte syntetisk analog WLBU2, og den ikke-peptid antibakterielt middel ceragenin CSA-13.
Resultater
I overensstemmelse med tidligere studier , økt uttrykk av hCAP-18 /LL-37 ble observert i mageslimhinnen hentet fra H. pylori
infiserte fag. MBC (minimum bakteriedrepende konsentrasjon) verdiene fastsettes i næringsholdig medium range 100-800 mikrogram /ml for LL-37, 17,8 til 142 mikrogram /ml for WLBU2 og 0.275-8.9 mikrogram /ml for ceragenin CSA-13. Disse dataene indikerer betydelige, men vidt forskjellige antibakterielle aktiviteter mot kliniske isolater av H. pylori
. Etter inkubering i simulert magesaft (lav pH med nærvær av pepsin) CSA-13, men ikke LL-37 eller WLBU2, beholdt antibakteriell aktivitet. Sammenlignet med LL-37 og WLBU2 peptider, CSA-13-aktivitet ble også mer resistente overfor inhibering ved hjelp av isolert vertsmageslimstoffer.
Konklusjon
Disse data indikerer at cholsyre-baserte antimikrobielle midler slik som CSA-13 motstå proteolytisk nedbrytning og hemming av mucin og har potensiale for behandling av H. pylori
infeksjoner, inkludert de som er forårsaket av klaritromycin og /eller metronidazol-resistente stammer.
Bakgrunn
Helicobacter pylori
er gjennomført av mer enn halvparten av verdens voksne befolkning [1]. Det kan kronisk kolonisere humant gastrisk mucosa, hvor det er funnet i slimlaget og er festet til epitelceller [2]. Selv om de fleste smittede forblir asymptomatiske, infeksjon med H. pylori
kan fremme alvorlig gastritt [3] og i betydelig grad øke risikoen for mage malignitet [4, 5]. I noen epidemiologiske studier, var H. pylori
utrydding vist seg å være effektive i magekreftforebygging [6, 7]. I tillegg ble H.pylori
utrydding funnet å redusere hyppigheten og alvorlighetsgraden av lesjoner med karsinogent potensial i dyremodeller [8, 9]. Naturlige mekanismer som beskytter verten fra H. pylori infeksjoner
avhengig av funksjonen av det medfødte forsvarssystemet i hvilket antibakterielle peptider slik som cathelicidin LL-37 [10, 11] og O-glykaner i gastrisk mucin [12] spille nøkkelrolle.
LL-37 er et proteolytisk prosessert peptid avledet fra det C-terminale domene av humant cathelicidin (hCAP-18 /LL-37) som konstitutivt frigjøres til det ekstracellulære rom av fagocytiske granulocytter og epitelceller [13] . Funksjoner tilskrives LL-37 omfatte forebygging av bakterievekst [14], nøytralisering av bakteriell vegg molekyl bioaktivitet [15], og aktivering av vertsceller ved å binde spesifikke cellemembranreseptorer [16-18]. H. pylori
oppregulerer produksjon av LL-37 /hCAP18 ved gastrisk epitel, noe som tyder på at cathelicidin eller dens avledede LL-37 bidrar til å bestemme balansen mellom verten slimhinneforsvaret og H. pylori
overlevelse mekanismer som styrer kronisk infeksjon med denne mage patogen [10, 11].
Kationiske antibakterielle peptider (CAPS) inkludert LL-37 har blitt grundig undersøkt som en potensiell kilde til nye antibakterielle molekyler. Den konstruerte WLBU2 peptid som rester er arrangert for å danne en amfipatisk spiralstruktur med optimal kostnad og hydrofobe tetthet, overvinner noen begrensninger naturlig LL-37 som følsomhet for Mg 2 + eller Ca 2 + og inaktivering av blod serum [19]. Derfor kan WLBU2 behandle infeksjoner der LL-37 er ineffektiv. For å generere molekyler i stand til å etterligne CAPS evne til å inngå kompromisser bakteriemembranen integritet, ikke-peptid ceragenins med kationiske, ble facially amfifile strukturer som kjennetegner de fleste antimikrobielle peptider utviklet. Ceragenins som CSA-13 reprodusere den nødvendige CAP morfologi ved hjelp av en gallesyre stillas og vedlagte amingrupper [20]. De er bakteriedrepende mot både Gram-positive og Gram-negative organismer, inklusive medikamentresistente bakterier slik som klinisk relevante meticillin-resistente Staphylococcus aureus plakater (MRSA), og en tidligere mottakelighet studien viste at CSA-13 har en MIC 50 /MBC 50 forhold på 1 [21, 22]. I denne studien sammenligner vi bakteriedrepende potens av LL-37, WLBU2 og CSA-13 mot kliniske isolater av H. pylori
. Resultatene tyder på at cholsyre-baserte etterligner av antimikrobielt peptid som CSA-13 har potensiale for behandling av H. pylori-infeksjon
, inkludert de som er forårsaket av klaritromycin og /eller metronidazol-resistente stammer.
Resultater
immunhistokjemisk sondering av human gastrisk mucosa seksjoner med anti-hCAP-18 /LL-37-antistoff
mikroskopiske bilder av slimhinne biopsier etter immunhistokjemisk vurdering med anti-hCAP-18 /LL-37-antistoff er vist i figur 1. Den DAB- positiv farging indikerer tilstedeværelse av LL-37 peptid og /eller dets utgangsproteinet hCAP-18. Høy intensitet DAB-farging (indikert med brun farge) ved mucus-produserende epitelceller og fundisk kjertler indikerer høy akkumulering av hCAP-18 /LL-37 peptid mest sannsynlig drevet av LL-37 spesifikk interaksjon med mucin, som ble rapportert i tidligere studier [23, 24]. Fordelingen av hCAP-18 /LL-37 på mer differensiert epiteliale cellepopulasjon av mageslimhinnen er forskjellig fra det man finner for human β-defensin 2 [10] eller lysozym [25], men er lik den som er observert i tykktarmen [26 ]. Gastrisk slimhinne biopsier fra pasienter infisert med H. pylori
viser høyere intensitet av DAB-farging sammenlignet med dem som ble oppnådd fra ikke-infiserte individer. I henhold til tidligere rapporter, indikerer dette resultatet en vertens forsvar respons på H. pylori product: [11], som er delvis basert på økt ekspresjon av hCAP-18 /LL-37 av magesaft-epitelceller. Figur 1 Forekomst av hCAP-18 /LL-37 peptid i slimhinne biopsier fra menneskelige magen oppdaget ved hjelp av immunhistokjemisk analyse med monoklonale antistoffer mot humant CAP-18 /LL-37. Prøver A /B og C /D representerer prøvene hentet fra ikke-infiserte og H. pylori
infiserte forsøks hhv. Viste data er representative for fem forsøk.
Bakteria aktivitet av LL-37, WLBU-2 peptider og ceragenin CSA-13 mot forskjellige stammer av H. pylori
å identifisere resistente stammer, kliniske isolater av H. pylori
ble underkastet MIC evaluering (Tabell 1) med flere antibiotika for tiden benyttes i klinisk behandling av H. pylori-infeksjon
. Blant syv testede isolater oppnådd fra forskjellige fag, stamme 4 var resistent overfor metronidazol og stammer 5, 6, 7 ble motstandsdyktig mot både metronidazol og clarithromycin. Alle isolater var følsomme for amoksicillin og tetracyklin. I samsvar med tidligere rapporter om virkningene av HBD-1, H-BD-2 og LL-37 peptider mot H. pylori product: [10, 11] alle isolerte stammer av H. pylori
ble drept etter 6 timer inkubasjon med LL-37, WLBU2 og CSA-13 med gjennomsnittlig MBC (mikrogram /ml) verdier 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 og 0,31 ± 0,25 når MBC ble evaluert i HEPES-buffer, eller 300 ± 232 53 ± 41 og ± 2,98 3,11 når MBC ble evaluert i Brucella-Broth Bullion henholdsvis (figur 2). Evaluering av MBC verdier i HEPES buffer med tillegg av 2 mM MgCl 2 for H. pylori
ATCC 43504 avslørte en åtte ganger økning for LL-37, og en fire ganger økning for både WLBU2 og CSA-13 (data ikke vis). Figur 2 baktericid aktivitet mot H.pylori. Minimum bakteriekonsentrasjon (MBC) av LL-37 (hvit kolonne), WLBU2 (grå kolonne) og CSA-13 (svart kolonne) mot H. pylori plakater (ATCC 43504 belastning og syv kliniske isolater hentet fra slimhinneprøver fra ulike fag ) evaluert i HEPES (panel A) eller Brucella Broth Bulion (panel B). MBC viser konsentrasjoner på hvilke forbindelser helt utrydde et inokulum av H. pylori
.
Tabell 1 Evaluering av følsomhet av kliniske stammer av H. pylori
mot antibiotika.
H. pylori
stammer Book Antibiotika
AMX
CLR
TET
metronidazol
ATCC 43504
0,016
0,094
0,25
64,0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0,25
64,0 ®
1,0
96,0 ®
6
0,032
1,5 ®
1,5
32,0 ®
7
0,047
1,5 ®
2.0
48,0 ®
MIC-verdier (mg /ml) (AMX-amoxicillin, CLR-klaritromycin, TET-tetracyklin)
Antibakteriell aktivitet av LL-37, WLBU2 og CSA-13 etter pre-inkubasjon ved lav pH med pepsin eller mucin
i tillegg til kjente hemming av caps antibakteriell aktivitet ved toverdige kationer som Mg 2 + og Ca 2 +, den proteolytiske aktiviteten pepsin kan også svekke caps funksjon i magesaften miljø med tilstedeværelse av slimstoffer, og lav pH. For å løse denne muligheten vi har evaluert antibakteriell aktivitet mot Escherichia coli
MG1655 etter 3 timers preinkubasjon av LL-37, WLBU2 og CSA-13 i simulert magesaft i forhold til aktivitet etter deres pre-inkubering i PBS ved pH 7,4 . Før gjennomføring av dreping analysen, pH til prøver med lav pH og lav pH /pepsin ble justert til 7,4. Den antibakterielle aktivitet av LL-37 og WLBU2 peptider mot E. coli
MG1655 ble ikke vesentlig endret etter pre-inkubering ved pH ~ 1,5, men gikk tapt etter pre-inkubering ved pH ~ 1,5, i nærvær av pepsin (figur 3A og 3B). I motsetning til den antibakterielle aktivitet av CSA-13 ble ikke endret ved pre-inkubering ved pH ~ 1,5 med eller uten pepsin (figur 3C). På den annen side, ble bakteriedrepende virkninger av alle komponenter kompromittert i varierende grad når de ble testet ved hjelp av en bakteriedrep assay i nærvær av renset gastrisk mucin. I nært avtale med resultater hentet fra denne E. coli
MG1655 studie, MBC verdier av LL-37 peptid evalueres etter 1 H pre-inkubasjon med buffer ved lav pH som inneholder pepsin eller mucin ble økt, men de av CSA-13 var nesten uendret (Figur 3D). Alle evaluerte midler tapt antibakteriell aktivitet i PBS supplert med 10% humangalle (en konsentrasjon som ikke forstyrrer med E. coli
MG1655 vekst - data ikke vist). Dette resultatet tyder på at fysisk-kjemiske egenskaper av antibakterielle molekyler fremme deres innsetting i gallen lipoprotein, og dermed begrense deres interaksjon med bakterieveggen. Det har ikke vært noen studie for å evaluere antibakteriell aktivitet av caps i duodenal juice, men disse resultatene indikerer at galle reflux i magen kan forstyrre CAPS aktivitet. Figur 3 Antibakteriell aktivitet mot E. coli MG1655 og H. pylori stamme ATCC 43504. Antibakteriell aktivitet av LL-37 (panel A), WLBU2 (panel B) og CSA-13 (panel C) mot E. coli
MG1655 etter pre-inkubering (3 timer ved 37 ° C) i PBS (åpne sirkler), simulert magesaft ved pH ~ 1,5 (firkanter), simulert magesaft med pepsin (romber), simulert magesaft med mucin (trekanter) og PBS med human galle (10%) oppnådd fra galleblæren (fylt sirkel). Data som vises er midler ± SD av tre til fire eksperimenter. MBC av LL-37 (hvit kolonne) og CSA-13 (sort kolonne) (panel D) mot H. pylori plakater (ATCC 43504) etter pre-inkubering (1 time ved 37 ° C) i simulert magesaft ved pH ~ 1,5 (A), simulert magesaft med pepsin (B) og i nærvær av mucin (C)
Analytisk karakterisering av LL-37 og CSA-13 etter inkubering med pepsin
Massespektrometri analyse (figur 4) viser at tre timer inkubasjon med pepsin resulterer i omfattende nedbrytning av LL-37. Imidlertid, ved lav pH, er pepsin fordøyelse meget spesifikk og LL-37 peptid spaltning er begrenset til området med hydrofobe aminosyrer. Potensielle spaltningsseter spådd av PeptideCutter karakterisering programvare http:.. //Kr expasy org /verktøy /peptidecutter /, tyder på at LL-37 fordøyelse med pepsin i våre eksperimentelle forhold bør løslate 11 produkter, inkludert 3 kortere peptider (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD og LVPRTES). Disse forutsigelser er i overensstemmelse med massespektralanalyse, som ikke viser tilstedeværelse av en hvilken som helst intakt LL-37 gjenværende etter inkubasjon med pepsin ved lav pH, men avslører fremveksten av flere nye topper med forskjellige retensjonstider. Den gjenværende antibakterielle aktivitet av LL-37 etter behandling med pepsin (figur 3A og 3D) i draps analyser representerer sannsynligvis den gjenværende aktiviteten til disse LL-37 fragmenter. I motsetning til den observerte nedbrytning av LL-37, ble CSA-13 analytiske karakteriseringer ikke forandret seg etter inkubasjon med pepsin ved lav pH. Figur 4 Massespektrometri analyse. Massespektrometrianalyse av LL-37 (panel A) og CSA-13 (panel B) i PBS (kurve 1) buffer med lav pH (kurve 2) og lav pH buffer med tilstedeværelsen av pepsin (kurve 3). Den totale ion-kromatogrammet (TIC) blir presentert for hver prøve tilstand med en innsats masse-til-ladning (m /z) spektra som viser intensiteten for den eske TIC topper. Molekylvekten av intakt LL-37 er 4494, noe som kan observeres med flere belastninger (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 MW = 900, etc.) i positiv ionemodus. Molekylvekten av CSA13 er 678, som kan observeres direkte, og med flere kostnader. Data fra ett eksperiment er vist
. Toksisitet av LL-37, WLBU2 og CSA-13 mot RBC og menneske adenokarcinomceller
Ikke-spesifikk innsetting av antibakterielle peptider og deres etterligner i vertscellemembraner kan føre til forgiftning. Vertscellemembran permeabilization kan måles ved frigjøringen av proteiner, slik som hemoglobin og LDH fra cytosol til det ekstracellulære rom. Ved å evaluere hemoglobin og LDH-frigjøring (figur 5A og 5B), vi viser ingen signifikant membran permeabilization ved noen testet molekyler i området hvor de har baktericid aktivitet i saltvann buffere (figur 2A, Figur 3). Dette funn ble bekreftet ved mikroskopisk evaluering av adenokarsinom cellemorfologi og viser ingen synlig forskjell mellom kontrollcellene og de som ble behandlet med 10 ug /ml LL-37, WLBU2 eller CSA-13 (figur 5C). Men en økning i hemoglobin og LDH meldingen ble observert med økende konsentrasjon. Blant de tre molekylene testet, WLBU2 var den sterkeste hemolytisk agent, men alle av dem viste lignende evne til å inngå kompromisser adenokarsinom cellemembran integritet (figur 5B og 5C). CSA-13 bakteriedrepende konsentrasjoner mot H. pylori Hotell og E. coli
MG1655 (2A, 2B og 3C) evaluert i saltvann samt nærings inneholder buffer var under sin minimal hemolytisk konsentrasjon og under konsentrasjoner forårsaker dysfunksjon av adenokarsinom cellemembraner. Figur 5 Evaluering av celletoksisitet. Hemoglobin og LDH-frigivelse fra humane røde blodceller og humane adenokarsinom-celler (panel A og B henholdsvis) etter tilsetning av LL-37 (sirkler), WLBU2 (romber) og CSA-13 (triangler), etterfulgt av inkubasjon i 1 time ved 37 ° C. Data som vises er midler ± SD av tre forsøk. Morfologi av menneskelige mage adenokarcinomceller før (kontroll) og etter LL-37, ble WLBU2 og CSA-13 behandling evaluert av fasekontrastmikroskopi (panel C). Data fra en representant eksperimentet er vist. To andre eksperimenter viste lignende resultater.
Diskusjon
Satsen for vellykket behandling av H. pylori
mageinfeksjon, oppnådd med kombinasjonsterapier av to antibiotika og en protonpumpehemmer har gått ned fra over 90% til 80 % i løpet av de siste ti årene [27]. I tillegg er kostnadene ved denne behandlingen er betydelig, og derfor et behov for mer allment tilgjengelige midler for behandling eller forhindring av H. pylori-infeksjon
fremdeles eksisterer [28]. Nye midler til behandling av H. pylori
infeksjoner er nødvendige også på grunn av økende resistens problemer som skyldes utstrakt bruk av antibiotika [29] og de adaptive overlevelsesmekanismer hos patogene bakterier for å motvirke dag brukes antibiotika. For eksempel, er H. pylori
stammer som er resistente overfor amoxicillin, metronidazol og clarithromycin blitt rapportert [30, 31]. Metoder for å bedre behandlinger for H. pylori
kan bli veiledet av innsikt i de naturlige mekanismer som infiserte pasienter svare på denne bakterien, og årsakene til at de vanlige vertsforsvarsmekanismer svikter.
Denne studien bekrefter en tidligere rapport fra økt hCAP-18 /LL-37 uttrykk i mageslimhinnen av personer infisert med H. pylori product: [11]. Dette funnet tyder på at økt produksjon av bakteriedrepende peptid LL-37 kan spille en nøkkelrolle i vertens forsvar mot H. pylori product: [11]. Men dette er bakteriedrepende reaksjon i enkelte fag utilstrekkelig og H. pylori
infeksjon kan fortsatt nå et kronisk stadium. Mangelen på bakteriedrepende funksjon av LL-37 i denne innstilling er foreslått at økt ekspresjon av hCAP-18 /LL-37 peptid i gastrisk slim fra infiserte individer kan ha flere funksjoner som en anti-inflammatorisk og vekststimulerende middel. Ja, det ble nylig vist at magesår helbredelse hos rotter er fremmet av cathelicidin-mediert trans av epidermal vekstfaktor reseptorer (EGFR) via transformerende vekstfaktor alfa (TGFa) signalveien [32]. Alternativt kan tap av forsvaret mot H. pylori
kan skyldes tap av antibakteriell funksjon av LL-37 i det miljø i mageslimhinnen. Følgelig kan utformingen av antimikrobielle midler som er mer effektive i denne sammenheng være fordelaktig.
Motivert av immunohistologiske resultater, aktiviteten av LL-37 mot kliniske isolater av H. pylori
og E. coli
MG1655 henhold biologisk relevante forhold ble sammenlignet med den til det syntetiske peptid WLBU2 og den ceragenin CSA-13. Denne studien viser at CSA-13, i motsetning til LL-37 og WLBU2 peptider, opprett sterk baktericid aktivitet i nærvær av mucin og etter preinkubasjon med pepsin ved lav pH. Disse forholdene representerer spesielle utfordringer knyttet til H. pylori
behandling, da disse bakteriene i magen er beskyttet fra det sure miljøet av en tykk slimlaget og effektiviteten av mange antimikrobielle midler er sterkt redusert ved sur pH [31]. Følgelig er den første effektiv terapi for H. pylori-infeksjon
var en kombinasjon av relativt pH-ufølsomme antimikrobielle legemidler, slik som vismut, tetracyklin og metronidazol [33]. I tillegg, som i magesekken periodisk tømmer sitt innhold (lokal terapi har en tendens til å bli fortynnet og vasket ut) det funn at CSA-13 har baktericid aktivitet ved meget lavere konsentrasjon deretter LL-37, etter den samme inkubasjonstid (3-6 timer) [11], tyder på at CSA-13 kan ha terapeutisk potensiale for behandling av H. pylori-infeksjon
. Den antibakterielle aktivitet av CSA-13, som har en mindre nettoladning og en unik distribusjon av denne ladning i løpet av et steroid stillas sammenlignet med LL-37 og WLBU2 peptider, ble også funnet å være mindre hemmet av mucin isolert fra gastrisk mucosa. Terapeutiske potensialet basert på evnen av CSA-13 for å utrydde H. pylori
er også støttet av tidligere rapportert antibakteriell aktivitet mot andre bakteriestammer, inkludert kliniske isolater av Pseudomonas aeruginosa product: [21] og S. aureus
[22]. CSA-13 unike evne til å gå på akkord bakteriemembranintegritet og den kjemiske natur av dette med lav molekylmasse forbindelsen som oversetter for å redusere kostnadene for syntese i forhold til kationiske antibakterielle peptider antyder at CSA-13 eller kanskje andre ceragenins har potensiale for behandling av H. pylori
infeksjon, inkludert de som er forårsaket av dens resistente stammer.
Konklusjon
baktericide aktivitet av ceragenin CSA-13 opprettholdes etter preinkubering i simulert magesaft og i nærvær av mucin. Denne in vitro
evalueringen viser et betydelig potensial for dette molekylet i behandling av mage mucosal infeksjon.
Metoder
Antibakterielle midler
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) og WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) peptider ble kjøpt fra Bachem (King of Prussia, PA). CSA-13 ble fremstilt som tidligere beskrevet [34]. Amoxicillin (AMX), klaritromycin (CLR), tetracyklin (TET) og metronidazol ble kjøpt fra Sigma.
Innsamling av mage slimhinne og galleprøver
Under gastroskopi, utført med enten en GIF V2 eller Q145 (Olympus) gastroscope, flere gastrisk slimhinne skiver ble tatt fra prepyloric og korpus regioner av magen. H. pylori
infeksjon ble etablert i lige snitt bruker en urease test (CLO-test). Human galle ble oppnådd fra galleblæren av pasienter som gjennomgår cholecystectomy. Prøvene ble filtersterilisert gjennom et 0,45 um membran før den ble fortynnet i PBS (1: 1) og blandet med antibakterielle midler som anvendes i bakteriedrepende analysene. Studiene ble godkjent av Medical University of Bialystok etiske komité for forskning på mennesker og dyr, og alle pasienter ga informert skriftlig samtykke til deltakelse i studien.
Immunohistokjemiske studier
Immunohistokjemiske studiene ble utført på formalinfiksert, parafin- innleiret human gastrisk slimhinne seksjoner ved hjelp av et kanin anti-LL-37-antistoff (H-075-06, som ble brukt ved 1: 100 fortynning, Phoenix Pharamceuticals Inc.). Parafininnstøpte materialer ble seksjonert til 5 mikrometer tykkelse og fløt på destillert vann ved 45 ° C. Snittene ble deretter montert på objektglass og plassert i 57 ° C ovn over natten. Seksjonene ble deparaffinized i henhold til standardprosedyrer og undertrykket med 0,9% hydrogenperoksid i metanol i 30 minutter. Snittene ble inkubert med primært antistoff ved 37 ° C i 60 minutter, vasket med 1% PBSA (1% BSA i PBS), og underkastet binding med sekundært antistoff (biotinylert geit-anti-kanin IgG, 1: 400 fortynning). Amplifisering ble utført med et Vectastain ABC kit, og et HRP påvisningssystem ble anvendt for å colocalize peroksydase-aktivitet med en DAB-substrat. Seksjonene ble kontra med hematoksylin. Prøvene ble sett på med et Nikon Eclipse 80 mikroskop etter 40 × forstørrelse.
Evaluering av MIC og MBC
minimal hemmende konsentrasjon (MIC) av konvensjonelle antibiotika mot syv forskjellige kliniske isolater av H. pylori plakater (9 × 10 8 CFU /ml) ble bestemt ved anvendelse av Muller-Hinton-agar (MH) inneholdende 5% saueblod. Inkubasjonen ble fortsatt i 4 dager ved 35 ° C i mikroaerofile betingelser opprettholdes med bruk av et gass-Pack Campylobacter gassgenererende kit BR60. Kliniske isolater av H. pylori
ble ansett resistente mot respektive antibiotika da de MIC-verdiene var over 4 ug /ml for AMX, 1 ug /ml for CLR og 16 ug /ml for TET og metronidazol. Den minimale baktericide konsentrasjon (MBC) av antibakterielle midler ble evaluert ved hjelp av et inokulum på 10 8 CFU /ml. Etter en seks timers inkubasjon ved 37 ° C, ble 10 mL porsjoner av suspensjoner oppdaget på Columbia agar supplert med saueblod (5%).
Bakterier dreper analysen Bedrifter Den bakteriedrepende aktiviteter LL-37, WLBU2 peptider og ceragenin CSA-13 mot E. coli
MG1655, i nærvær av mucin eller pepsin fra svin slim (Sigma) og human galle ble målt som tidligere beskrevet [35]. Bakterier ble dyrket til midt-log fase ved 37 ° C (kontrollert ved evaluering av optisk tetthet ved 600 nm), og resuspendert i PBS-buffer (pH = 7,4). Bakteriesuspensjoner ble deretter fortynnet 10 ganger i 100 pl oppløsninger inneholdende antibakterielle midler i seg selv eller sammen med mucin (1000 ug /ml), eller galle (den endelige 1:10 fortynning galleetterligner omgivelse av den øvre del av tynntarmen inn i hvilken er galle utskilt [36] (pH = 7,4)). I et annet sett av eksperimenter antibakterielle aktiviteten til disse komponentene ble bestemt etter deres preinkubering i simulert magesaft [36, 37] ved pH ~ 1,5 med og uten pepsin (0,5 mg /ml). Etter inkubering bakterier med antibakterielle molekyler i en time ved 37 ° C, ble de bakterielle suspensjoner plassert på is og fortynnet 10 til 1000 ganger. Porsjoner av hver fortynning (10 ul) ble oppdaget på LB-agarplater for dyrking over natten ved 37 ° C. Antallet kolonier på hver fortynning ble tellet den følgende morgen. De kolonidannende enheter (CFU /ml) av de individuelle prøvene ble bestemt fra fortynningsfaktoren
. Massespektrometri
Analytisk karakterisering ble utført på CSA-13 og LL-37 suspensjoner etter 3H inkubering med pepsin (0,5 mg /ml) ved lav pH (~ 1,5) ved 37 ° C, ved hjelp av Shimadzu (Columbia, MD) instrument (LC-MS-system bestod av en LC-20AB løsningsmiddelavgivelsessystem og SIL-20A auto-sampler koplet til dobbelt bølgelengde UV-Vis detektor og en LCMS 2010EV enkelt quadrupole massespektrometer), koplet til en Shimadzu Premier C18-kolonne (150 mm x 4,6 mm iD, 5 um partikkelstørrelse). Den mobile fase Strømningshastigheten var 1 ml /min med et utgangsforhold på 90% mobil fase A (vann) og 10% mobilfase B (acetonitril) begge med 0,1% (v /v) maursyre. Analysemetoden bestod av de følgende trinn: (i) prøveinjeksjon og holding ved 10% B i 5 minutter, (ii) lineær gradient fra 10% til 90% B i løpet av 15 minutter, (iii) holding ved 90% B i 5 minutt, (iv) isokratisk trinn til 10% B og å holde i 5 minutter før den neste prøveinjeksjon. Massespektrometri ble utført på elueringsmiddel bruker electrospray ionisering (ESI) i positiv ion modus med et skannet m /z spekter 160-2000.
Red blodcellelyse
hemolytisk aktivitet av LL-37, WLBU-2 og CSA-13 (0-200 μ
g /ml) mot humane røde blodceller (RBC) ble testet ved anvendelse av erytrocytter suspendert i PBS. RBC fremstilt fra friskt blod (Hematokrit ~ 5%) ble inkubert i 1 time ved 37 ° C etter tilsetning av testmolekyler. Relativ hemoglobinkonsentrasjonen i supernatanten etter sentrifugering ved 2000 x g ble overvåket ved å måle absorbansen ved 540 nm. 100% hemolyse ble tatt fra prøver hvor 2% Triton X-100 ble tilsatt
Cellekultur
menneske med adenokarsinom i cellene. (ATCC, CRL-1739) ble holdt i DMEM (BioWhittaker) kultur supplert med 10% varme -inactivated føtalt bovint serum (Hyclone) ved 37 ° C og 5% CO 2. For LDH-frigivelse-analyse og evaluering mikroskop-celler ble sådd ut i 24 brønners plater og dyrket til konfluens. I alle forsøkene ble mediet skiftet til serumfritt medium ~ 12 timer før celle behandling med LL-37, WLBU2 og CSA-13 (0-200 pg /ml) i de enkelte brønner, i 1 time. Cellekulturmedium ble deretter samlet, sentrifugert (10 minutter, 5000 rpm, RT) og utsatt for LDH evaluering (LDH-cytotoksisitet Assay Kit; BioVision Inc.)
Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet av NIH gi HL067286 og Medical University of Bialystok gir 3-22458F og 3-18714L
Forfattere 'originale legges filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder. 12866_2009_858_MOESM1_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 1 12866_2009_858_MOESM2_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 2 12866_2009_858_MOESM3_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 3 12866_2009_858_MOESM4_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 4 12866_2009_858_MOESM5_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 5 konkurrerende interesser
Dr P. Savage er en betalt konsulent for Ceragenix Pharmaceuticals, medfødte immun Inc., og WittyCell. Ingen av forskningen rapportert i denne artikkelen ble støttet av Ceragenix Pharmaceuticals eller av noen annen bedriftsenhet. Andre forfattere: ingen å erklære
.

• Evaluering av passering av Lactobacillus gasseri K7 og bifidobakterier fra magen til tarmen ved hjelp av en enkelt reaktor modell
• Ballong-occluded retrograd transvenøs utslettelse for mage varicer: forholdet mellom den kliniske utfall og gastrorenal shunt okklusjon