attività battericida del cationico steroidi CSA-13 e LL-37 il peptide cathelicidin contro Helicobacter pylori nel succo gastrico simulato

attività battericida del cationico steroidi CSA-13 e il peptide cathelicidin LL-37 contro Helicobacter pylori
nel succo gastrico simulato
Abstract
sfondo
La comparsa a livello mondiale di ceppi farmaco-resistenti di H. pylori
motiva la ricerca di nuovi agenti con potenziale terapeutico contro questa famiglia di batteri che colonizza lo stomaco, ed è associata con lo sviluppo di adenocarcinoma. Questo studio è stato progettato per valutare in vitro
anti-H. pylori
potenziale di cathelicidin LL-37 peptide, che è naturalmente presente nel succo gastrico, la sua ottimizzato WLBU2 analogo sintetico, e l'agente antibatterico non-peptidico ceragenin CSA-13.
Risultati
in accordo con gli studi precedenti , aumentata espressione di HCAP-18 /LL-37 è stata osservata in mucosa gastrica ottenuto da H. pylori
soggetti infetti. I valori MBC (minima concentrazione battericida) determinato gamma di supporti di nutrienti che contiene 100-800 mg /ml per LL-37, 17,8-142 mg /ml per WLBU2 e 0.275-8.9 mcg /ml per ceragenin CSA-13. Questi dati indicano sostanziali, ma molto diverse attività antibatterica contro isolati clinici di H. pylori
. Dopo l'incubazione nel succo gastrico simulato (basso pH con presenza di pepsina) CSA-13, ma non LL-37 o WLBU2, trattenuto attività antibatterica. Rispetto a LL-37 e WLBU2 peptidi, CSA-13 attività era anche più resistente alla inibizione da parte di isolati ospitanti mucine gastriche.
Conclusione
Questi dati indicano che a base di acido colici agenti antimicrobici quali CSA-13 resistono alla degradazione proteolitica e l'inibizione da mucina e hanno il potenziale per il trattamento di infezioni da H. pylori
, comprese quelle causate da ceppi claritromicina e /o metronidazolo-resistenti.
Sfondo
Helicobacter pylori
è portato da oltre la metà della popolazione adulta del mondo [1]. Può cronicamente colonizzare la mucosa gastrica umana, dove si trova nello strato di muco e viene fatto aderire alle cellule epiteliali [2]. Sebbene la maggior parte soggetti infetti rimangono asintomatici, l'infezione da H. pylori
possono promuovere grave gastrite [3] e di aumentare in modo significativo il rischio di tumori gastrici [4, 5]. In alcuni studi epidemiologici, H. pylori
eradicazione ha dimostrato di essere efficace nella prevenzione del cancro gastrico [6, 7]. Inoltre, H. pylori
eradicazione è stato trovato per ridurre l'incidenza e la gravità delle lesioni con potenziale cancerogeno in modelli animali [8, 9]. meccanismi naturali che proteggono l'host da H. pylori
infezioni dipendono dalla funzione del sistema di difesa innato in cui peptidi antibatterici come cathelicidin LL-37 [10, 11] e O-glicani in mucina gastrica [12] svolgono un ruolo chiave.
LL-37 è un peptide proteolytically trasformate ottenute dal dominio C-terminale di cathelicidin umana (HCAP-18 /LL-37) che è costitutivamente rilasciato nello spazio extracellulare dai granulociti fagocitosi e cellule epiteliali [13] . Le funzioni attribuite a LL-37 includono la prevenzione della crescita batterica [14], la neutralizzazione di batteri bioattività molecola parete [15], e l'attivazione delle cellule ospiti legandosi recettori di membrana delle cellule specifiche [16-18]. H. pylori
fa aumentare la produzione di LL-37 /hCAP18 dal dell'epitelio gastrico, suggerendo che cathelicidin o suoi derivati ​​LL-37 contribuisce a determinare l'equilibrio tra difesa della mucosa host e H. pylori
meccanismi di sopravvivenza che governano cronica l'infezione da questo patogeno gastrica [10, 11].
cationici peptidi antibatterici (CAP) tra cui LL-37 sono stati ampiamente studiati come una potenziale fonte di nuove molecole antibatteriche. Il peptide WLBU2 ingegnerizzato cui residui sono predisposti per formare una struttura elicoidale amphipathic con carica ottimale e la densità idrofobico, supera alcune limitazioni naturale LL-37 come la sensibilità di Mg 2 + o Ca 2 + e inattivazione dal sangue siero [19]. Pertanto WLBU2 potrebbe trattare le infezioni in cui LL-37 è inefficace. Al fine di generare molecole in grado di mimare la capacità caps 'compromettere l'integrità della membrana batterica, ceragenins non-peptidico con cationico, sono state sviluppate strutture facciale anfifiliche caratteristica della maggior parte dei peptidi antimicrobici. Ceragenins quali CSA-13 riproducono la morfologia PAC desiderata con un ponteggio acidi biliari e gruppi amminici allegate [20]. Sono battericida contro entrambi gli organismi Gram-positivi e Gram-negativi, tra cui i batteri resistenti ai farmaci come clinicamente rilevante meticillino-resistente Staphylococcus aureus
(MRSA), e uno studio della suscettibilità precedente dimostrato che CSA-13 ha una MIC 50 /MBC 50 rapporto di 1 [21, 22]. In questo studio si confronta la potenza battericida di LL-37, WLBU2 e CSA-13 contro isolati clinici di H. pylori
. I risultati suggeriscono che colici imita a base di acido di peptidi antimicrobici, come CSA-13 hanno un potenziale per il trattamento di H. pylori
infezioni, comprese quelle causate da ceppi claritromicina e /o metronidazolo-resistenti.
Risultati
immunoistochimica sondaggio di sezioni umani mucosa gastrica con anti-HCAP-18 /LL-37 anticorpi
immagini microscopiche di biopsie della mucosa dopo la valutazione immunoistochimica con l'anti-HCAP-18 /LL-37 anticorpi sono mostrati in Figura 1. Il DAB- colorazione positiva indica la presenza di LL-37 peptide e /o la sua proteina genitore HCAP-18. Ad alta intensità DAB colorazione (indicata dal colore marrone) ai cellule epiteliali che producono muco e le ghiandole fundica indica elevato accumulo di peptide HCAP-18 /LL-37 molto probabilmente guidata da LL-37 specifica interazione con mucina, che è stato riportato in studi precedenti [23, 24]. La distribuzione di HCAP-18 /LL-37 nella popolazione di cellule epiteliali più differenziato della mucosa gastrica differisce da quella trovata per 2 umano [10] o lisozima β-defensine [25], ma è simile a quello osservato nel colon [26 ]. Gastrico biopsie della mucosa di pazienti con infezione da H. pylori
mostrare maggiore intensità di colorazione DAB rispetto a quelli ottenuti da soggetti non infetti. Secondo i rapporti precedenti, questo risultato indica una risposta di difesa host per H. pylori
[11], che è in parte basata su una maggiore espressione di HCAP-18 /LL-37 da parte delle cellule epiteliali gastriche. Figura 1 Presenza di HCAP-18 /LL-37 peptide in biopsie della mucosa dello stomaco umano rilevato utilizzando l'analisi immunoistochimica con anticorpi monoclonali per CAP-18 umano /LL-37. I campioni A /B e C /D rappresentano i campioni ottenuti rispettivamente da soggetti non infetti da HIV e da H. pylori
. I dati indicati sono rappresentativi di cinque esperimenti.
L'attività battericida di LL-37, WLBU-2 peptidi e ceragenin CSA-13 contro diversi ceppi di H. pylori
per identificare i ceppi resistenti, isolati clinici di H. pylori
sono stati sottoposti a valutazione MIC (Tabella 1) con diversi antibiotici attualmente utilizzati nel trattamento clinico di H. pylori
infezione. Tra sette isolati testati prelevati da soggetti diversi, ceppo 4 era resistente al metronidazolo e ceppi 5, 6, 7 sono stati resistenti sia metronidazolo e claritromicina. Tutti gli isolati erano sensibili alla amoxicillina e tetraciclina. In linea con precedenti relazioni sugli effetti di hBD-1, H-BD-2 e LL-37 peptidi contro H. pylori
[10, 11] tutti i ceppi isolati di H. pylori
sono stati uccisi dopo 6 ore di incubazione con LL-37, WLBU2 e CSA-13 con media MBC (mg /ml) valori 8.9 ± 4.03; 5.23 ± 2.7 e 0.31 ± 0.25 quando MBC stata valutata in tampone HEPES, o 300 ± 232, 53 ± 41 e 2.98 ± 3.11 quando MBC è stata valutata in Brucella Broth Bullion rispettivamente (Figura 2). La valutazione dei valori di MBC in tampone HEPES con l'aggiunta di 2 mM MgCl 2 per H. pylori
ATCC 43504 ha rivelato un aumento di otto volte per LL-37, e un quattro volte maggiore per entrambi WLBU2 e CSA-13 (dati non mostrare). Figura 2 attività battericida contro H. pylori. concentrazione minima battericida (MBC) di LL-37 (colonna bianca), WLBU2 (colonna grigia) e CSA-13 (colonna nera) contro H. pylori
(ATCC 43504 ceppo e sette isolati clinici ottenuti da campioni di mucosa da soggetti diversi ) valutata in HEPES (pannello a) o Brucella brodo Bulion (pannello B). MBC indica concentrazioni alle quali composti sradicare completamente un inoculo di H. pylori
.
Tabella 1 Valutazione della sensibilità dei ceppi clinici di H. pylori
agli antibiotici.
H. pylori
ceppi

Antibiotici
AMX
CLR
TET
Metronidazolo
ATCC 43504
0,016 0,094

0.25
64,0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0.25
64,0 ®
1.0
96,0 ®
6
0.032
1.5 ®
1.5
32,0 ®
7
0.047
1.5 ®
2,0
48,0 ®
valori di MIC (mcg /ml) (AMX-amoxicillina, claritromicina CLR-, TET-tetraciclina)
attività antibatterica di LL-37, WLBU2 e CSA-13 dopo il pre-incubazione a pH basso con la pepsina o mucina
Oltre all'inibizione nota di tappi attività antibatterica da cationi bivalenti come ad esempio Mg 2 + e Ca 2 +, l'attività proteolitica di pepsina può anche compromettere la funzione CAP nell'ambiente succo gastrico con la presenza di mucine e basso pH. Per affrontare questa possibilità abbiamo valutato l'attività antibatterica contro Escherichia coli
MG1655 dopo 3 ore pre-incubazione di LL-37, WLBU2 e CSA-13 nel succo gastrico simulato rispetto all'attività dopo la pre-incubazione in PBS a pH 7,4 . Prima di eseguire il test uccisione, il pH dei campioni con pH basso e basso pH /pepsina fu regolato a 7,4. L'attività antibatterica di peptidi LL-37 e WLBU2 contro E. coli
MG1655 non era significativamente modificata dopo pre-incubazione a pH ~ 1,5, ma è stato perso dopo pre-incubazione a pH ~ 1,5 in presenza di pepsina (Figura 3A e 3B). Al contrario, l'attività antibatterica di CSA-13 era invariata pre-incubazione a pH ~ 1,5 con o senza pepsina (Figura 3C). D'altro canto, attività battericida di tutti i componenti sono stati compromessi in varia misura durante il test usando un test battericida in presenza di purificato mucina gastrica. In stretto accordo con i risultati ottenuti da questo studio E. coli
MG1655, valori MBC di LL-37 peptide valutato dopo 1H pre-incubazione con tampone a pH basso contenente pepsina o mucina è stata aumentata ma quelli di CSA-13 erano quasi invariato (Figura 3D). Tutti gli agenti valutati persi attività antibatterica in PBS supplementato con 10% bile umana (una concentrazione che non interferisce con E. coli
MG1655 crescita - dati non mostrati). Questo risultato suggerisce che le proprietà fisico-chimiche delle molecole antibatteriche promuovere il loro inserimento nella bile lipoproteine, limitando così la loro interazione con la parete batterica. Non c'è stato alcun studio per valutare l'attività antibatterica di tappi nel succo duodenale, ma questi risultati indicano che il reflusso di bile nello stomaco può interferire con l'attività CAPS. Figura 3 attività antibatterica contro E. coli MG1655 e H. pylori ceppo ATCC 43504. L'attività antibatterica di LL-37 (pannello A), WLBU2 (pannello B) e CSA-13 (pannello C) contro E. coli
MG1655 dopo pre-incubazione (3 ore a 37 ° C) in PBS (cerchi aperti), succo gastrico simulato a pH ~ 1,5 (quadrati), succo gastrico simulato con pepsina (diamanti), succo gastrico simulato con mucina (triangoli) e PBS con umana bile (10%) ha ottenuto dalla colecisti (cerchio pieno). I dati indicati sono mezzi ± SD di tre o quattro esperimenti. MBC di LL-37 (colonna bianca) e CSA-13 (colonna nera) (pannello D) contro H. pylori
(ATCC 43504) dopo il pre-incubazione (1 ora a 37 ° C) nel succo gastrico simulato a pH ~ 1.5 (a), succo gastrico simulato con pepsina (B) ed in presenza di mucina (C)
caratterizzazione analitica di LL-37 e CSA-13 dopo incubazione con pepsina
spettrometria di massa (figura 4) rivela che tre ore di incubazione con risultati pepsina in una eccessiva degradazione di LL-37. Tuttavia, a pH basso, digestione con pepsina è altamente specifica e LL-37 peptide scissione è limitato al sito con amminoacidi idrofobici. siti potenziali scissione previsto dal PeptideCutter software caratterizzazione http:.. //kr ExPASy org /strumenti /peptidecutter /, suggeriscono che LL-37 digestione con pepsina nelle nostre condizioni sperimentali dovrebbe rilasciare 11 prodotti, tra cui 3 peptidi più corti (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD e LVPRTES). Queste previsioni sono coerenti con l'analisi spettrale di massa, che non mostra la presenza di eventuali intatta LL-37 residua dopo incubazione con pepsina a pH basso, ma non rivelano l'emergere di molteplici nuovi picchi con differenti tempi di ritenzione. L'attività antibatterica rimanente LL-37 dopo il trattamento con pepsina (Figura 3A e 3D) nei saggi uccisione probabilmente rappresenta l'attività residua di questi LL-37 frammenti. Contrariamente alla degradazione osservata di LL-37, CSA-13 caratterizzazione analitica non è stato modificato dopo incubazione con pepsina a pH basso. Figura 4 Mass spettrometria. analisi Spettrometria di massa di LL-37 (pannello A) e CSA-13 (pannello B) in PBS (curva 1) tampone di pH basso (curva 2) e tampone di basso pH con presenza di pepsina (curva 3). Il cromatogramma ionico totale (TIC) è presentato per ciascuna condizione campione con un inserto di massa-carica (m /z) spettri mostrando intensità dei picchi TIC scatola. Il peso molecolare di intatto LL-37 è 4494, che può essere osservata con più oneri (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 MW = 900, ecc) in modalità ioni positivi. Il peso molecolare di CSA13 è 678, che può essere osservato direttamente e con cariche multiple. I dati di un esperimento sono mostrati
. Tossicità dei LL-37, WLBU2 e CSA-13 contro RBC e cellule di adenocarcinoma umano
inserimento Non specifici di peptidi antibatterici e loro imita nelle membrane cellulari host può causare tossicità. permeabilizzazione della membrana della cellula ospite può essere misurata dal rilascio di proteine ​​come emoglobina e LDH dal citosol allo spazio extracellulare. Valutando emoglobina e rilascio di LDH (Figura 5A e 5B), si visualizza alcun significativo permeabilizzazione della membrana con qualsiasi molecole testate nell'intervallo in cui hanno attività battericida nei buffer saline (Figura 2A, Figura 3). Questo risultato è stato confermato mediante valutazione microscopica della morfologia cellulare adenocarcinoma mostrando alcuna differenza visibile tra le cellule di controllo e quelli trattati con 10 ug /ml LL-37, WLBU2 o CSA-13 (Figura 5C). Tuttavia un aumento di emoglobina e LDH rilascio è stato osservato con l'aumentare della concentrazione. Tra le tre molecole testate, WLBU2 era l'agente emolitica più forte, ma tutti mostrato simile capacità di compromettere l'integrità della membrana cellulare adenocarcinoma (Figura 5B e 5C). CSA-13 concentrazioni battericida contro H. pylori
ed E. coli
MG1655 (figure 2A, 2B e 3C) valutata in soluzione fisiologica, così come tampone nutriente contenente erano sotto la sua concentrazione emolitica minima e al di sotto delle concentrazioni che causano la disfunzione di adenocarcinoma membrane cellulari. Figura 5 Valutazione della tossicità cellulare. L'emoglobina e LDH liberazione dai globuli rossi umani e le cellule di adenocarcinoma gastrico umane (pannello A e B, rispettivamente) dopo l'aggiunta di LL-37 (cerchi), WLBU2 (diamanti) e CSA-13 (triangoli), seguita da incubazione per 1 ora a 37 ° C. I dati indicati sono mezzi ± SD di tre esperimenti. Morfologia delle cellule umane di adenocarcinoma gastrico prima (controllo) e dopo LL-37, WLBU2 e CSA-13 trattamento è stata valutata mediante microscopia a contrasto di fase (pannello C). I dati di un esperimento rappresentativo sono mostrate. Altri due esperimenti hanno rivelato risultati simili.
Discussione
Il tasso di successo del trattamento di H. pylori
infezione allo stomaco, ottenuto con terapie di combinazione di due antibiotici e un inibitore della pompa protonica è diminuito da oltre il 90% a circa 80 % negli ultimi dieci anni [27]. Inoltre, il costo di questa terapia è significativo, e quindi la necessità di mezzi più ampiamente disponibili per curare o prevenire H. pylori
infezione esiste ancora [28]. Nuovi agenti per il trattamento di H. pylori
infezioni sono necessari anche a causa di crescenti problemi di droga-resistenza causati da un uso estensivo di antibiotici [29] e dei meccanismi di sopravvivenza di adattamento dei batteri patogeni per contrastare antimicrobici attualmente in uso. Ad esempio, H. pylori
ceppi resistenti ad amoxicillina, metronidazolo e claritromicina sono stati riportati [30, 31]. I metodi per migliorare i trattamenti per H. pylori
potrebbe guidare dalla comprensione dei meccanismi naturali con cui infettati pazienti rispondono a questo batterio e le ragioni per cui i normali meccanismi di host-difesa non riescono.
Questo studio conferma una precedente relazione di aumento HCAP-18 /LL-37 espressione nella mucosa gastrica di soggetti con infezione da H. pylori
[11]. Questa scoperta suggerisce che l'aumento della produzione del battericida peptide LL-37 può giocare un ruolo chiave nella difesa dell'ospite contro H. pylori
[11]. Tuttavia, questa risposta battericida in alcuni soggetti è insufficiente e H. pylori
infezione può ancora raggiungere una fase cronica. La mancanza di funzione battericida di LL-37 in questo contesto ha suggerito che aumentata espressione di HCAP-18 /LL-37 peptide nel muco gastrico di soggetti infetti possono avere funzioni aggiuntive come un agente anti-infiammatorio e la crescita stimolante. Infatti, è stato recentemente dimostrato che la guarigione delle ulcere gastriche nei ratti è promosso da transattivazione cathelicidin mediata di recettori del fattore di crescita epidermico (EGFR) tramite il fattore di crescita trasformante alfa (TGFα) via di segnalazione [32]. In alternativa, la perdita di difesa contro H. pylori
può essere dovuto alla perdita di funzione antibatterica di LL-37 nel milieu della mucosa gastrica. Di conseguenza, la progettazione di agenti antimicrobici che sono più efficaci in questa impostazione può essere utile.
Motivato da risultati immunoistologici, l'attività di LL-37 contro isolati clinici di H. pylori
e E. coli
MG1655 sotto biologicamente relative condizioni è stato confrontato con quello del WLBU2 peptide sintetico e la ceragenin CSA-13. Questo studio dimostra che CSA-13, contrariamente a LL-37 e peptidi WLBU2, mantiene forte attività battericida in presenza di mucina e dopo preincubazione con pepsina a pH basso. Queste condizioni rappresentano sfide uniche legate alla H. pylori
trattamento, in quanto questi batteri nello stomaco sono protette dall'ambiente acido da uno strato di muco denso e l'efficacia di molti farmaci antimicrobici è notevolmente diminuita a pH acido [31]. Di conseguenza, la prima terapia efficace per l'infezione da H. pylori
era una combinazione di farmaci antimicrobici relativamente pH-sensibili, come bismuto, tetraciclina e metronidazolo [33]. Inoltre, come lo stomaco si svuota periodicamente il contenuto (terapia topica tende ad essere diluito e lavato) la constatazione che CSA-13 ha attività battericida a concentrazioni molto più basso quindi LL-37, dopo lo stesso tempo di incubazione (3-6 ore) [11], suggerisce che CSA-13 può avere un potenziale terapeutico per il trattamento di H. pylori
infezione. L'attività antibatterica di CSA-13, che ha una carica netta più piccola e una distribuzione unica di questa carica su uno scaffold steroide rispetto LL-37 e WLBU2 peptidi, è risultata essere meno inibiti dalla mucina isolato dalla mucosa gastrica. Potenziale terapeutico basato sulla capacità di CSA-13 per sradicare H. pylori
è supportato anche dalla riportato in precedenza attività antibatterica contro altri ceppi di batteri, tra cui isolati clinici di Pseudomonas aeruginosa
[21] e S. aureus
[22]. capacità unica di CSA-13 di compromettere l'integrità della membrana batterica e la natura chimica di questo composto a basso peso molecolare massa che traduce per abbassare il costo della sintesi rispetto a peptidi antibatterici cationici suggerire che CSA-13 o forse altre ceragenins hanno il potenziale per il trattamento di H. pylori
infezione, comprese quelle causate dai ceppi resistenti.
Conclusione
attività battericida di ceragenin CSA-13 è mantenuta dopo preincubazione nel succo gastrico simulato e in presenza di mucina. Questa valutazione in vitro
indica un significativo potenziale di questa molecola nel trattamento delle infezioni dello stomaco mucosa.
Metodi
agenti antibatterici
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) e WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) peptidi sono stati acquistati da Bachem (king of Prussia, PA). CSA-13 è stato preparato come precedentemente descritto [34]. Amoxicillina (AMX), claritromicina (CLR), tetraciclina (TET) e metronidazolo sono stati acquistati dalla Sigma.
La raccolta dei campioni della mucosa gastrica e biliari
Durante gastroscopia, eseguita sia con un GIF V2 o Q145 gastroscopio (Olympus), qualche fetta della mucosa gastrica sono state prese dalle regioni prepyloric e corpus dello stomaco. H. pylori
infezione è stata fondata nei campioni bioptici utilizzando un test dell'ureasi (CLO-test). bile umana è stato ottenuto dalla cistifellea dei pazienti sottoposti a colecistectomia. I campioni sono stati sterilizzata per filtrazione attraverso una membrana da 0,45 micron prima di essere diluito in PBS (1: 1) e mescolato con agenti antibatterici usati in saggi uccidere i batteri. Gli studi sono stati approvati dalla University Medical di Bialystok Comitato Etico per la Ricerca sugli esseri umani e animali, e tutti i pazienti hanno dato il consenso informato scritto per la partecipazione allo studio.
Studi di immunoistochimica
studi di immunoistochimica sono stati condotti su fissati in formalina, paraffinato incorporati sezioni umani mucosa gastrica con un coniglio anti-LL-37 anticorpi (H-075-06, usato in diluizione 1: 100; Phoenix Pharamceuticals Inc.). materiali inclusi in paraffina sono stati sezionati a spessore 5 micron e galleggiare su acqua distillata a 45 ° C. Le sezioni sono state poi montate su vetrini e posti in 57 ° C overnight forno. Le sezioni sono state deparaffinate secondo le procedure standard e temprati con perossido di idrogeno 0,9% in metanolo per 30 minuti. Le sezioni sono state incubate con l'anticorpo primario a 37 ° C per 60 minuti, lavati con 1% PBSA (1% BSA in PBS), e sottoposti al legame con l'anticorpo secondario (capra biotinilato anti-IgG di coniglio, 1: 400 diluizione). Amplificazione è stata eseguita con un kit Vectastain ABC, e un sistema di rilevazione HRP è stato usato per colocalize attività perossidasica con un substrato DAB. Le sezioni sono state contrastate con ematossilina. I campioni sono stati osservati con una Nikon Eclipse 80 microscopio sotto 40 × ingrandimento.
Valutazione del MIC e MBC
La minima concentrazione inibente (MIC) di antibiotici convenzionali contro sette diversi isolati clinici di H. pylori
(9 × 10 8 CFU /ml) è stata determinata utilizzando Muller-Hinton agar (MH) contenente il 5% di sangue di pecora. L'incubazione è stata continuata per 4 giorni a 35 ° C in condizioni microaerofili mantenuto con l'uso di un gas Pack-Campylobacter generatrice gas kit BR60. isolati clinici di H. pylori
sono stati considerati resistenti ai rispettivi antibiotici quando i valori di MIC erano al di sopra 4 mg /ml per AMX, 1 mg /ml per CLR e 16 ug /ml per TET e metronidazolo. La minima concentrazione battericida (MBC) di agenti antibatterici è stata valutata utilizzando un inoculo a 10 8 UFC /ml. Dopo una incubazione per 6 ore a 37 ° C, 10 aliquote microlitri delle sospensioni sono stati visti di Columbia agar addizionato con sangue di montone (5%).
Uccidere i batteri saggio
Le attività battericida di LL-37, peptidi WLBU2 e ceragenin CSA-13 contro E. coli
MG1655 in presenza di mucina o pepsina da muco suini (Sigma) e bile umana sono stati misurati come precedentemente descritto [35]. I batteri sono stati coltivati ​​a fase mid-log a 37 ° C (controllata dalla valutazione della densità ottica a 600 nm) e risospese in tampone PBS (pH = 7,4). Le sospensioni batteriche sono state poi diluiti 10 volte in 100 ml di soluzioni contenenti agenti antibatterici da soli o con mucina (1000 mg /ml), o la bile (gli ultimi 1:10 biliari diluizione imita l'ambiente del piccolo intestino superiore in cui la bile è secreta [36] (pH = 7,4)). In un'altra serie di esperimenti attività antibatterica di questi componenti è stato determinato seguendo la preincubazione nel succo gastrico simulato [36, 37] a pH ~ 1,5 con e senza pepsina (0,5 mg /ml). Dopo incubazione batteri con molecole antibatteriche per un'ora a 37 ° C, le sospensioni batteriche sono stati posti su ghiaccio e diluiti 10 ai 1000- piega. Aliquote di ogni diluizione (10 ml) sono stati avvistati su piastre di agar LB per cultura durante la notte a 37 ° C. Il numero di colonie ad ogni diluizione è stato contato la mattina seguente. Le unità formanti colonia (CFU /ml) dei singoli campioni sono stati determinati dal fattore di diluizione
. Spettrometria di massa
caratterizzazione analitica è stata effettuata sulle sospensioni CSA-13 e LL-37 dopo 3H incubazione con pepsina (0,5 mg /ml) a basso pH (~ 1,5) a 37 ° C, utilizzando la Shimadzu (Columbia, MD) strumento (sistema LC-MS consisteva in un sistema di erogazione di solvente LC-20AB e SIL-20A autocampionatore accoppiato doppia lunghezza d'onda del rivelatore UV-Vis e uno spettrometro di massa a quadrupolo singolo LCMS 2010EV), accoppiato ad una colonna Shimadzu Premier C18 (150 mm × 4,6 mm di diametro, 5 micron dimensione delle particelle). Il flusso della fase mobile era 1 ml /min con un rapporto di partenza del 90% fase mobile A (acqua) e il 10% fase mobile B (acetonitrile) sia con 0,1% (v /v) di acido formico. Il metodo analitico comprendeva le seguenti fasi: (i) di iniezione del campione e mantenimento a 10% B per 5 minuti, (ii) gradiente lineare dal 10% al 90% B in 15 minuti, (iii) mantenimento a 90% B per 5 minuti, (iv) passo isocratica al 10% B e tenendo premuto per 5 minuti prima della successiva iniezione del campione. La spettrometria di massa è stata eseguita su dell'eluente utilizzando Elettrospray (ESI) in modalità ioni positivi con un range m /z digitalizzata 160-2000.
lisi dei globuli rossi
L'attività emolitica di LL-37, WLBU-2 e CSA-13 (0-200 μ
g /ml), contro i globuli rossi umani (RBC) è stato testato utilizzando eritrociti sospese in PBS. RBC preparato da sangue fresco (ematocrito ~ 5%) sono stati incubati per 1 ora a 37 ° C dopo l'aggiunta di molecole di test. concentrazione di emoglobina relativa in surnatanti dopo centrifugazione a 2000 × g è stata monitorata misurando l'assorbanza a 540 nm. 100% emolisi è stata presa da campioni in cui il 2% è stato aggiunto Triton X-100

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