Bakterizide Aktivitäten des kationischen Steroids CSA-13 und dem cathelicidin Peptid LL-37 gegen Helicobacter pylori in simulierten Magensaft

Bakterizide Aktivitäten des kationischen Steroids CSA-13 und dem cathelicidin Peptid LL-37 gegen Helicobacter pylori
in simulierten Magensaft
Zusammenfassung
Hintergrund
Der weltweite Auftreten von arzneimittelresistenten Stämmen von H. pylori
motiviert die Suche nach neuen Wirkstoffen mit therapeutisches Potential gegen diese Familie von Bakterien, die den Magen kolonisiert, und ist mit einem Adenokarzinom Entwicklung verbunden. Diese Studie wurde konzipiert in vitro
der anti-H zu beurteilen. pylori
Potential von cathelicidin LL-37 Peptid, das natürlich im Magensaft, die optimierte synthetische Analog WLBU2, und die Nicht-Peptid antibakterieller Wirkstoff ceragenin CSA-13.
Ergebnis einschränken In Übereinstimmung mit früheren Studien , erhöhte Expression von hCAP-18 /LL-37 wurde in der Magenschleimhaut, erhalten von H. pylori
infizierten Patienten beobachtet. MBC (minimale bakterizide Konzentration) Werte in nährstoffhaltigen Medien Bereich von 100 bis 800 &mgr; g /ml für LL-37 bestimmt, 17,8-142 ug /ml für WLBU2 und 0,275 bis 8,9 ug /ml für ceragenin CSA-13. Diese Daten zeigen erhebliche, aber sehr unterschiedliche antibakterielle Wirksamkeit gegen klinische Isolate von H. pylori
. Nach der Inkubation in simulierten Magensaft (niedriger pH-Wert mit Anwesenheit von Pepsin) CSA-13, aber nicht LL-37 oder WLBU2, behielt die antibakterielle Aktivität. Im Vergleich zu LL-37 und WLBU2 Peptide, CSA-13-Aktivität war auch resistent gegen Hemmung durch isolierte Wirtsmagen Mucinen.
Schlussfolgerung
Diese Daten zeigen, dass Cholsäure basierende antimikrobielle Mittel wie CSA-13 proteolytischem Abbau wider und die Hemmung von Mucin und haben das Potenzial für die Behandlung von H. pylori
Infektionen, einschließlich solcher, die durch die Clarithromycin und /oder Metronidazol-resistente Stämme.
Hintergrund Helicobacter pylori und Videos mehr als die Hälfte getragen wird der erwachsenen Bevölkerung der Welt [1]. Es kann chronisch den menschlichen Magenschleimhaut kolonisieren, wo es in der Schleimschicht gefunden wird und an Epithelzellen anhaften [2]. Obwohl die meisten infizierten Patienten asymptomatisch bleiben, eine Infektion mit H. pylori
schweren Gastritis fördern kann [3] und deutlich das Risiko von Magen-malignen Erkrankungen erhöhen [4, 5]. In einigen epidemiologischen Studien wurde H. pylori-Eradikation
bei Magenkrebs Prävention als wirksam erwiesen [6, 7]. Zusätzlich wurde H. pylori-Eradikation
fand die Häufigkeit und die Schwere der Läsionen, die mit krebserzeugendes Potential in Tiermodellen [8, 9] zu verringern. Natürliche Mechanismen, die den Wirt von H. pylori-Infektionen
sind abhängig von der Funktion des angeborenen Abwehrsystems in denen antibakterielle Peptide wie cathelicidin LL-37 [10, 11] und O-Glykane im Magen-Mucin [12] spielen eine schützen Schlüsselrolle.
LL-37 ist ein proteolytisch prozessiert Peptid aus der C-terminalen Domäne von humanem Cathelicidin abgeleitet (hCAP-18 /LL-37), die konstitutiv von phagozytischen Granulozyten und Epithelzellen zu den extrazellulären Raum freigesetzt wird [13] . Funktionen LL-37 zugeschrieben sind: Verhinderung des Bakterienwachstums [14], Neutralisation der Bakterienwand Molekül Bioaktivität [15], und die Aktivierung der Wirtszellen durch spezifische Zellmembranrezeptoren bindenden [16-18]. H. pylori
upregulates die Herstellung von LL-37 /hCAP18 durch den Magen-Epithel, was darauf hindeutet, dass cathelicidin oder dessen Derivat LL-37 trägt, um die Balance zwischen dem Host-Schleimhaut Verteidigung zu bestimmen und H. pylori
Überlebensmechanismen, die chronische regieren Infektionen mit diesem Pathogen Magen [10, 11].
Kationische antibakterielle Peptide (CAPs) einschließlich LL-37 wurden als potentielle Quelle neuer antibakterieller Moleküle umfassend untersucht. Hochentwickeltes WLBU2 Peptid, dessen Reste sind so angeordnet, eine amphipathische Helixstruktur mit einer optimalen Ladung und hydrophobe Dichte zu bilden, überwindet einige Einschränkungen der natürlichen LL-37 wie Empfindlichkeit gegenüber Mg 2+ oder Ca 2 + und Inaktivierung durch Blut Serum [19]. Daher könnte WLBU2 Infektionen zu behandeln, wo LL-37 unwirksam ist. Um Moleküle zu erzeugen vermag CAPs die Fähigkeit zu imitieren bakterielle Membran Integrität, Nicht-Peptid ceragenins mit kationischen, facially amphiphilen Strukturen charakteristisch für die meisten antimikrobiellen Peptide zu Kompromissen entwickelt. Ceragenins wie CSA-13 reproduzieren die erforderliche CAP Morphologie eine Gallensäure Gerüst und die anhängenden Amingruppen unter Verwendung von [20]. Sie sind bakterizid gegen sowohl Gram-positive und Gram-negative Organismen, einschließlich arzneimittelresistenten Bakterien, wie klinisch relevante Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus
(MRSA) und einer vorherigen Suszeptibilität Studie zeigte, dass CSA-13 ein MIC /MBC 50-Verhältnis von 1 [21, 22]. In dieser Studie vergleichen wir die bakterizide Wirksamkeit von LL-37, WLBU2 und CSA-13 gegen klinische Isolate von H. pylori
. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cholsäure-basierte Mimetika von antimikrobiellen Peptids wie CSA-13 Potenzial für die Behandlung von H. pylori-Infektion
, verursacht einschließlich solcher, die Clarithromycin und /oder Metronidazol-resistente Stämme.
Ergebnisse
immunhistochemische der menschlichen Magenschleimhaut Schnitte mit anti-hCAP-18 Sondieren /LL-37-Antikörper
Mikroskopische Aufnahmen von Schleimhautbiopsien nach immunhistochemischen Auswertung mit anti-hCAP-18 /LL-37-Antikörper in Figur gezeigt sind 1. Die DAB- positive Färbung zeigt die Anwesenheit von LL-37 Peptid und /oder seine Ausgangsprotein hCAP-18. Hohe Intensität DAB-Färbung (mit brauner Farbe gekennzeichnet) an den Schleim produzierenden Epithelzellen und Fundus Drüsen zeigt eine hohe Akkumulation von hCAP-18 /LL-37 Peptid höchstwahrscheinlich angetrieben von LL-37 spezifische Wechselwirkung mit Mucin, die in früheren Studien berichtet wurde, [23, 24]. Die Verteilung der hCAP-18 /LL-37 in der differenzierten epithelialen Zellpopulation der Magenschleimhaut unterscheidet sich von dem für den menschlichen β-Defensin 2 [10] oder Lysozym gefunden [25], ist aber ähnlich wie im Darm beobachtet [26 ]. Magenschleimhaut Biopsien von Patienten mit H. pylori infiziert
zeigen höhere Intensität der DAB-Färbung im Vergleich zu denen von nicht-infizierten Probanden erhalten. Gemäß früheren Berichten, zeigt dieses Ergebnis eine Abwehrreaktion gegen H. pylori
[11], die auf einer erhöhten Expression von hCAP-18 /LL-37 von Magenepithelzellen teilweise basiert. Abbildung 1 Presence of hCAP-18 /LL-37 Peptid in Schleimhautbiopsien aus dem menschlichen Magen nachgewiesen unter Verwendung von immunhistochemischer Analyse mit monoklonalen Antikörpern gegen humanen CAP-18 /LL-37. Die Proben A /B und C /D repräsentieren die erhaltenen Proben von nicht-infizierten und H. pylori
infizierten Patienten sind. Die gezeigten Daten sind repräsentativ für fünf Experimente.
Die bakterizide Aktivität von LL-37, WLBU-2-Peptide und ceragenin CSA-13 gegen verschiedene Stämme von H. pylori
Um resistente Stämme zu identifizieren, klinische Isolate von H. pylori
auf MIC Auswertung (Tabelle 1) mit mehreren Antibiotika in der klinischen Behandlung von H. pylori-Infektion
verwendet ausgesetzt waren. Unter sieben getesteten Isolate aus verschiedenen Themen erhalten, Stamm 4 war resistent gegen Metronidazol und Stämme 5, 6, 7 wurden sowohl resistent gegen Metronidazol und Clarithromycin. Alle Isolate waren anfällig für Amoxicillin und Tetracyclin. In Übereinstimmung mit früheren Berichten über die Wirkungen von hBD-1, h-BD-2 und LL-37-Peptide gegen H. pylori
[10, 11] allen isolierten Stämmen von H. pylori
wurden nach 6 Stunden Inkubation getötet mit LL-37, WLBU2 und CSA-13 mit durchschnittlich MBC (ug /ml) Werte 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 und 0,31 ± 0,25 bei MBC in HEPES-Puffer wurde ausgewertet oder 300 ± 232 53 ± 41 und 2,98 ± 3,11 bei MBC in Brucella-Bouillon Anlage ausgewertet wurde jeweils (Abbildung 2). Auswertung von MBC-Werte in HEPES mit Zusatz von 2 mM MgCl puffern 2 für H. pylori
ATCC 43504 zeigte eine achtfache Zunahme für LL-37 und einen vierfachen Anstieg sowohl WLBU2 und CSA-13 (data nicht zeigen). Abbildung 2 Die bakterizide Aktivität gegen H. pylori. Die minimalen bakteriziden Konzentration (MBC) von LL-37 (weiße Säule), WLBU2 (graue Säule) und CSA-13 (schwarze Säule) gegen H. pylori
(ATCC 43504 Stamm und sieben klinische Isolate von Schleimhautproben aus verschiedenen Themen erhalten ) in HEPES (Feld A) oder Brucella-Bouillon Bulion (Panel B ausgewertet). MBC zeigt Konzentrationen, bei denen Verbindungen vollständig ein Inokulum von H. pylori
auszurotten.
Tabelle 1 Bewertung der Empfindlichkeit der klinischen Stämme von H. pylori
gegen Antibiotika.
H. pylori-Stämme

Antibiotika
AMX
CLR
TET
Metronidazol
ATCC 43504
0,016
0.094
0,25
64,0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0.25
64,0 ®
1.0
96,0 ®
6 0,032
1.5 ®
1.5
32,0 ®
7
0,047
1.5 ®
2.0
48,0 ®
MIC-Werte (ug /ml) (AMX-Amoxicillin, CLR-Clarithromycin, TET-Tetracyclin)
Die antibakterielle Aktivität von LL-37, WLBU2 und CSA-13 nach Vorinkubation bei niedrigem pH-Wert mit Pepsin oder Mucin
Neben bekannten Hemmung der CAPs antibakterielle Aktivität durch zweiwertige Kationen wie Mg 2 + und Ca 2 +, die Aktivität proteolytischen kann auch CAPs Funktion im Magensaft-Umgebung mit der Anwesenheit von Mucinen und niedrigem pH-Wert von Pepsin kompromittieren. Um diese Möglichkeit zu adressieren werteten wir die antibakterielle Wirkung gegen Escherichia coli
MG1655 nach 3 Stunden Vorinkubation von LL-37, WLBU2 und CSA-13 in simulierten Magensaft im Vergleich zur Aktivität nach ihrer Vorinkubation in PBS bei pH 7,4 . Vor der Tötung Assay Durchführung der pH-Wert der Proben mit niedrigem pH und niedriger pH /Pepsin wurde auf 7,4 eingestellt. Die antibakterielle Aktivität von LL-37 und WLBU2 Peptide gegen E. coli MG1655
wurde bei pH-Wert nach der Vorinkubation nicht signifikant verändert ~ 1.5, jedoch wurde nach der Vorinkubation bei pH ~ 1,5 in Gegenwart von Pepsin (3A verloren und 3B). Im Gegensatz dazu war die antibakterielle Aktivität von CSA-13 unverändert durch Vorinkubation bei pH ~ 1,5 mit oder ohne Pepsin (3C). Auf der anderen Seite wurden die bakteriziden Aktivitäten aller Komponenten in unterschiedlichem Ausmaß beeinträchtigt bei Verwendung eines Bakterientötungsassay in Gegenwart von gereinigtem Magen Mucin getestet. In enger Abstimmung mit den Ergebnissen aus diesem E. coli
MG1655 Studie, MBC-Werte von LL-37 Peptid nach 1H Präinkubation mit Puffer bei niedrigem pH-Wert enthält, Pepsin oder Mucin wurde bewertet, erhalten erhöht, aber die von CSA-13 waren nahezu unverändert (Figur 3D). Alle untersuchten Mittel verloren antibakterielle Aktivität in PBS mit 10% der menschlichen Galle ergänzt (eine Konzentration, die mit E. coli nicht
MG1655 Wachstum stören - Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die physikalisch-chemischen Eigenschaften antibakterieller Moleküle ihre Insertion in bile Lipoprotein fördern, wodurch ihre Interaktion mit der Bakterienwand zu begrenzen. Es hat in Duodenalsaft keine Studie zu bewerten, antibakterielle Aktivität von CAPs, aber diese Ergebnisse zeigen, dass Galle Reflux in den Magen mit CAPs Aktivität stören können. Abbildung 3 Die antibakterielle Aktivität gegen E. coli MG1655 und H. pylori-Stamm ATCC 43504. Die antibakterielle Aktivität von LL-37 (Feld A), WLBU2 (Feld B) und CSA-13 (Panel C) gegen E. coli
MG1655 nach Vorinkubation (3 h bei 37 ° C) in PBS (offene Kreise), künstlichem Magensaft bei pH ~ 1,5 (Quadrate), simulierte Magensaft mit Pepsin (Rauten), künstlichem Magensaft mit Mucin (Dreiecke) und PBS mit humanem Galle (10%), erhalten aus der Gallenblase (ausgefüllter Kreis). Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SD von drei bis vier Experimenten. MBC von LL-37 (weiße Säule) und CSA-13 (schwarze Säule) (Panel D) gegen H. pylori
(ATCC 43504) nach Vorinkubation (1 h bei 37 ° C) in künstlichem Magensaft bei pH ~ 1,5 (A), künstlichem Magensaft mit Pepsin (B) und in Gegenwart von Mucin (C)
Analytische Charakterisierung von LL-37 und CSA-13 nach Inkubation mit Pepsin
Massenspektrometrische Analyse (Abbildung 4) zeigt, dass 3 Stunden Inkubation mit Pepsin führt zu umfangreichen Abbau von LL-37. Aber bei niedrigen pH ist Pepsinverdau hochspezifisch und LL-37 Peptidspaltung mit hydrophoben Aminosäuren an den Ort begrenzt. Mögliche Schnittstellen von PeptideCutter Charakterisierung Software http vorhergesagt:.. //Kr ExPASy org /tools /peptidecutter /, legen nahe, dass LL-37 Verdauung mit Pepsin in unseren experimentellen Bedingungen sollten 11 Produkte freigesetzt, darunter 3 kürzere Peptide (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD und LVPRTES). Diese Vorhersagen stimmen mit Massenspektralanalyse, das zeigt nicht das Vorhandensein eines intakten LL-37 verbleibenden nach Inkubation mit Pepsin bei einem niedrigen pH, aber nicht offenbaren die Entstehung mehrere neue Peaks mit unterschiedlichen Retentionszeiten. Die verbleibende antibakterielle Aktivität von LL-37 nach der Behandlung mit Pepsin (3A und 3D) in der Tötung Assays stellt wahrscheinlich die Restaktivität dieser LL-37 Fragmente. Im Gegensatz zu der beobachteten Abbau von LL-37, CSA-13-analytische Charakterisierung wurde nicht nach der Inkubation mit Pepsin bei einem niedrigen pH verändert. Abbildung 4 Massenspektrometrie-Analyse. Massenspektrometrie-Analyse von LL-37 (Panel A) und CSA-13 (Feld B) in PBS (Kurve 1) Puffer mit niedrigem pH (Kurve 2) und niedrigem pH-Puffer mit der Anwesenheit von Pepsin (Kurve 3). Die Gesamt (TIC) für jede Probe Zustand mit einem Einsatz von Masse zu Ladung (m /z) Spektren Intensität für die boxed TIC Spitzen dargestellt. Das Molekulargewicht des intakten LL-37 ist 4494, die mit mehreren Ladungen (m /z = 4 MW = 1124 m /z = 5 MW = 900, usw.) beobachtet werden kann, in positiver Ionenmodus. Das Molekulargewicht von CSA13 ist 678, die direkt und mit mehreren Ladungen beobachtet werden können. Daten aus einem Experiment gezeigt.
Toxizität von LL-37, WLBU2 und CSA-13 gegen RBC und menschliche Adenokarzinomzellen
Unspezifische Insertion von antibakterieller Peptide und ihre Nachahmer in Wirtszellmembranen können Toxizität führen. Wirtszelle Membranpermeabilisierung kann durch die Freisetzung von Proteinen wie Hämoglobin und LDH aus dem Cytosol zu den extrazellulären Raum gemessen werden. Durch die Auswertung von Hämoglobin und LDH-Freisetzung (5A und 5B), zeigen wir keine signifikante Membranpermeabilisierung durch irgendwelche getesteten Moleküle im Bereich, in dem sie die bakterizide Aktivität in Salzpuffern (2A, Abbildung 3). Dieser Befund wurde durch mikroskopische Auswertung der Adenokarzinom-Zellmorphologie bestätigt keinen sichtbaren Unterschied zwischen den Kontrollzellen und die Behandlung mit 10 ug /ml LL-37, WLBU2 oder CSA-13 (5C) zeigt. Eine Erhöhung Hämoglobin und LDH-Freisetzung wurde mit zunehmender Konzentration beobachtet. Unter den drei Molekülen getestet, war das stärkste WLBU2 hämolytische Mittel, aber alle von ihnen zeigten eine ähnliche Fähigkeit Adenokarzinom Zellmembranintegrität (5B und 5C) zu kompromittieren. CSA-13 bakteriziden Konzentrationen gegen H. pylori
und E. coli MG1655
(Figuren 2A, 2B und 3C) in Kochsalzlösung untersucht sowie Nährstoff enthaltenden Puffer wurden unter seine minimal hämolytische Konzentration und unterhalb Konzentrationen Dysfunktion des Adenokarzinoms Verursachung Zellmembranen. Figur 5 Bewertung der Zelltoxizität. Hämoglobins und LDH-Freisetzung aus humanen roten Blutzellen und menschlichen Magen-Adenokarzinom-Zellen (Tafel A bzw. B) nach Zugabe von LL-37 (Kreise), WLBU2 (Rauten) und CSA-13 (Dreiecke), gefolgt von einer Inkubation für 1 h bei 37 ° C. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SD von drei Experimenten. Morphologie von menschlichen Zellen Adenokarzinom des Magens vor (Kontrolle) und nach der LL-37, wurde durch Phasenkontrastmikroskopie (Panel C) ausgewertet WLBU2 und CSA-13-Behandlung. Daten aus einem repräsentativen Experiment gezeigt. Zwei weitere Experimente ergaben ähnliche Ergebnisse.
Diskussion
Die Rate der erfolgreichen Behandlung von H. pylori
Mageninfektion, erreicht mit Kombinationstherapien von zwei Antibiotika und einem Protonenpumpenhemmer wurde von über 90% auf etwa 80 gesunken % während der letzten zehn Jahre [27]. Außerdem sind die Kosten dieser Therapie signifikant, und daher ein Bedarf an weiter verbreitet Mittel zur Behandlung oder Prävention existiert H. pylori-Infektion noch
[28]. Neue Mittel H. pylori
Infektionen erforderlich sind auch wegen der zunehmenden Resistenzprobleme durch extensive Einsatz von Antibiotika [29] und die adaptive Überlebensmechanismen der pathogenen Bakterien entgegenzuwirken derzeit verwendeten antimikrobiellen Mitteln verursacht werden. Zum Beispiel H. pylori
Stämme resistent gegen Amoxicillin, Metronidazol und Clarithromycin berichtet worden [30, 31]. Methoden Behandlungen für H. pylori zu verbessern und Videos Einblick in die natürlichen Mechanismen geführt werden könnten, durch die Patienten auf dieses Bakterium und die Gründe reagieren infiziert, warum die normalen Wirtsabwehrmechanismen versagen.
Diese Studie einen früheren Bericht bestätigt, von erhöht hCAP-18 /LL-37 Expression in der Magenschleimhaut von Probanden mit H. pylori infiziert
[11]. Dieser Befund legt nahe, dass eine Erhöhung der Produktion der bakteriziden Peptid LL-37 kann eine Schlüsselrolle bei der Verteidigung des Wirts gegen H. pylori
[11] spielen. Allerdings ist diese bakterizide Reaktion in einigen Fächern ist unzureichend und H. pylori-Infektion
kann immer noch eine chronische Stadium erreichen. Das Fehlen der bakteriziden Funktion von LL-37 in dieser Einstellung hat vorgeschlagen, daß LL-37 Peptid im Magenschleim von infizierten Probanden Expression hCAP-18 /erhöht zusätzliche Funktionen aufweisen kann als entzündungshemmendes und Wachstum stimulierendes Mittel. Tatsächlich wurde kürzlich gezeigt, dass Magengeschwür Heilung bei Ratten durch cathelicidin-vermittelte Trans des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) über die transformierende Wachstumsfaktor alpha (TGF α) Signalweg [32] gefördert wird. Alternativ Verlust der Verteidigung gegen H. pylori
durch den Verlust der antibakterielle Funktion von LL-37 in das Milieu der Magenschleimhaut sein kann. Folglich Design von antimikrobiellen Mitteln, die effektiver in dieser Einstellung sind von Vorteil sein kann. Durch immunhistologische Ergebnisse Motiviert
, die Aktivität von LL-37 gegen klinische Isolate von H. pylori
und E. coli
MG1655 unter biologisch relevanten Bedingungen wurde mit der des synthetischen Peptids WLBU2 und dem ceragenin CSA-13 verglichen. Diese Studie zeigt, dass die CSA-13, im Gegensatz zu LL-37 und WLBU2 Peptide in Gegenwart von Mucin und nach Vorinkubation mit Pepsin bei einem niedrigen pH starke bakterizide Aktivität beibehält. Diese Bedingungen stellen einzigartige Herausforderungen im Zusammenhang mit H. pylori
Behandlung, da diese Bakterien im Magen vor der sauren Umgebung von einer dicken Schleimschicht geschützt sind und die Wirksamkeit vieler antimikrobieller Arzneimittel stark bei sauren pH vermindert [31]. Dementsprechend pylori die erste wirksame Therapie für H.
Infektion eine Kombination aus relativ pH-unempfindlichen antimikrobiellen Wirkstoffen wie Wismut, Tetracyclin und Metronidazol [33] war. Zusätzlich kann, wie der Magen periodisch entleert seinen Inhalt (topische Therapie neigt verdünnt werden und ausgewaschen), um die Feststellung, dass CSA-13 bakterizide Aktivität bei viel niedrigeren Konzentration dann LL-37 nach der gleichen Inkubationszeit ist (3-6 Stunden) [11] legt nahe, dass CSA-13 therapeutisches Potential
Infektion zur Behandlung von H. pylori aufweisen. Die antibakterielle Aktivität von CSA-13, die eine kleinere Nettoladung und eine einzigartige Verteilung dieser Ladung über einen Steroidgerüst hat im Vergleich mit LL-37 und WLBU2 Peptide, wurde auch von Mucin isoliert von Magenschleimhaut weniger gehemmt gefunden. Therapeutisches Potential auf der Grundlage der Fähigkeit der CSA-13 H. pylori auszurotten
wird auch unterstützt durch die zuvor antibakterielle Aktivität berichtet gegen andere Bakterienstämme, einschließlich der klinischen Isolate von Pseudomonas aeruginosa
[21] und S. aureus
[22]. CSA-13 Die einzigartige Fähigkeit von Bakterienmembranintegrität und die chemische Natur dieser niedrigmolekularen Verbindung zu kompromittieren, die Kosten für die Synthese im Vergleich zur kationischen antibakterielle Peptide zu senken übersetzt legen nahe, dass CSA-13 oder vielleicht anderen ceragenins zur Behandlung von H. Potenzial pylori
Infektion, einschließlich jene, die durch ihre resistente Stämme.
Schlussfolgerung
bakteriziden Wirkung ceragenin CSA-13 nach Vorinkubation in simuliertem Magensaft, gehalten wird und in Gegenwart von Mucin. Diese In-vitro-
Auswertung zeigt ein erhebliches Potential dieses Moleküls in der Behandlung von Magen-Schleimhaut-Infektion.
Methoden
Keimhemmende Mittel
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) und WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) Peptide wurden von Bachem (King of Prussia, PA) gekauft. CSA-13 wurde hergestellt, wie zuvor beschrieben [34]. Amoxicillin (AMX), Clarithromycin (CLR), Tetracyclin (TET) und Metronidazol wurden von Sigma bezogen.
Sammlung der Magenschleimhaut und Gallenproben
Während Gastroskopie, entweder mit einem GIF-V2 oder Q145 (Olympus) Gastroskop durchgeführt, mehrere Magenschleimhaut Scheiben wurden aus den präpylorischen und Corpus Regionen des Magen eingenommen wird. H.-pylori-Infektion
wurde in den Biopsieproben unter Verwendung eines Urease-Test (CLO-Test) etabliert. Menschliche Galle wurde aus der Gallenblase von Patienten, die sich Cholezystektomie erhalten. (1: 1) und mit antibakterieller Mittel verwendet in Bakterienabtötungstests Proben wurden zuvor in PBS verdünnt, durch einen 0,45 um Membranfilter sterilisiert. Die Untersuchungen wurden von der Medizinischen Universität Bialystok Ethikkommission für Forschung am Menschen und Tiere zugelassen, und alle Patienten gaben Zustimmung zur Teilnahme an der Studie eine schriftliche.
Immunhistochemischen Studien
immunhistochemischen Untersuchungen an Formalin-fixierten durchgeführt wurden, Paraffin- eingebettete menschliche Magenschleimhaut Abschnitte einen Kaninchen-Anti-LL-37-Antikörper unter Verwendung von (H-075 bis 06, verwendet in 1: 100 Verdünnung; Phoenix Pharamceuticals Inc.). Paraffin eingebettete Materialien wurden zu 5 &mgr; m Dicke geschnitten und schwamm auf destilliertem Wasser bei 45 ° C. Die Schnitte wurden dann auf Objektträger aufgebracht und in 57 ° C warmen Ofen über Nacht platziert. Die Schnitte wurden nach Standardverfahren entparaffiniert und mit 0,9% Wasserstoffperoxid in Methanol 30 Minuten lang gequencht. Die Schnitte wurden für 60 Minuten mit primären Antikörpern bei 37 ° C inkubiert, mit 1% PBSA (1% BSA in PBS) gewaschen und zogen mit sekundärem Antikörper (biotinylierter Ziege-anti-Kaninchen-IgG, 1: 400 Verdünnung) zu binden. Die Amplifizierung wurde mit einem Vectastain ABC-Kit durchgeführt, und ein HRP-Detektionssystem verwendet wurde Peroxidase-Aktivität mit einem Substrat DAB kolokalisiert. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Proben wurden unter 40-facher Vergrößerung mit einem Nikon Eclipse-80 Mikroskop betrachtet.
Bewertung von MIC und MBC
Die minimale Hemmkonzentration (MIC) von herkömmlichen Antibiotika gegen sieben verschiedene klinische Isolate von H. pylori
(9 × 10 8 KBE /ml) wurde bestimmt unter Verwendung von Müller-Hinton-Agar (MH) mit 5% Schafblut. Die Inkubation wurde in mikroaerophilen Bedingungen bei 35 ° C für 4 Tage fortgesetzt, unter Verwendung eines Gas aufrechterhalten Pack Campylobacter Gaserzeugungssatz BR60. Klinische Isolate von H. pylori
waren resistent angesehen jeweiligen Antibiotika, wenn die MIC-Werte oberhalb waren 4 &mgr; g /ml für AMX, 1 &mgr; g /ml für CLR und 16 &mgr; g /ml für TET und Metronidazol. Die minimale bakterizide Konzentration (MBC) von Antibiotika wurde unter Verwendung eines Inokulums bei 10 8 KBE /ml bewertet. Nach einer 6-stündigen Inkubation bei 37 ° C, 10 &mgr; l Aliquots der Suspensionen wurden auf Columbia-Agar mit Schafblut (5%) ergänzt gesichtet.
Bakterien Test
Die bakterizide Aktivitäten von LL-37, WLBU2 Peptide zu töten und ceragenin CSA-13 gegen E. coli MG1655
in Gegenwart von Mucin oder Pepsin aus Schweine Schleim (Sigma) und menschlichen Galle wurden gemessen, wie zuvor beschrieben [35]. Die Bakterien wurden pelletiert und in PBS-Puffer (pH = 7,4) bei 37 ° C (durch die Auswertung der optischen Dichte bei 600 nm kontrolliert) bis zur mittleren logarithmischen Phase gezüchtet. Die Bakteriensuspensionen wurden verdünnt, dann 10-mal in 100 &mgr; l von Lösungen, die antibakterielle Mittel allein oder mit Mucin (1000 &mgr; g /ml) oder Galle (die letzten 01.10 Gallenverdünnungs ahmt die Umgebung des oberen Dünndarm, in die Galle sezerniert [36] (pH = 7,4)). In einer anderen Versuchsreihe antibakterielle Aktivität dieser Komponenten wurde nach ihrer Vorinkubation in simuliertem Magensaft bestimmt [36, 37] bei pH ~ 1,5 mit und ohne Pepsin (0,5 mg /ml). Bakterien mit antibakterieller Moleküle für eine Stunde bei 37 ° C, die Bakteriensuspensionen wurden auf Eis gestellt und verdünnt 10- bis 1000- fachen Nach Inkubation. Aliquots jeder Verdünnung (10 ul) wurden bei 37 ° C auf LB-Agar-Platten für Nacht-Kultur entdeckt. Die Anzahl der Kolonien auf jeder Verdünnung wurde am nächsten Morgen gezählt. Die koloniebildenden Einheiten (KBE /ml) der einzelnen Proben wurden aus dem Verdünnungsfaktor bestimmt.
Massenspektrometrie
analytische Charakterisierung wurde mit Pepsin auf die CSA-13 und LL-37-Suspensionen nach 3H Inkubation durchgeführt (0,5 mg /ml) bei niedrigem pH-Wert (~ 1,5) bei 37 ° C, die Shimadzu (Columbia, MD) instrument (die LC-MS-System bestand aus einem LC-20AB Lösungsmittelabgabesystem und SIL-20A auto-sampler Verwendung gekoppelt Zweiwellenlängen-UV-Vis-Detektor und ein LCMS 2010EV Single-Quadrupol-Massenspektrometer), gekoppelt mit einem Shimadzu Premier C18-Säule (150 mm × 4,6 mm ID, 5 um Teilchengrße). Die mobile Phase Fließgeschwindigkeit betrug 1 ml /min mit einem Ausgangsverhältnis von 90% mobiler Phase A (Wasser) und 10% mobile Phase B (Acetonitril), beide mit 0,1% (v /v) Ameisensäure. Das Analyseverfahren bestand aus den folgenden Schritten: (i) Injektionsprobe und für 5 min bei 10% B hält, (ii) einem linearen Gradienten von 10% bis 90% B über 15 Minuten, (iii) bei 90% B Halten für 5 Minuten, (iv) isokratisch Schritt bis 10% B und 5 Minuten vor der nächsten Probeninjektions halten. Die Massenspektrometrie wurde aus 160-2000 auf dem Elutionsmittel Elektrospray-Ionisation (ESI) im Positiv-Ionen-Modus mit einem gescannten m /z-Bereich durchgeführt.
Rote Blutkörperchen Lyse
die hämolytische Aktivität von LL-37, WLBU-2 und CSA-13 (0-200 μ
g /ml) gegen menschliche rote Blutzellen (RBC) wurde unter Verwendung von Erythrocyten in PBS suspendiert getestet. RBC aus frischem Blut (Hämatokrit ~ 5%) wurden nach Zugabe von Testmolekülen bei 37 ° C für 1 h inkubiert. Relative Hämoglobinkonzentration im Überstand nach der Zentrifugation bei 2000 × g wurde durch Messung der Extinktion bei 540 nm überwacht. 100% Hämolyse wurde aus Proben, in denen 2% Triton X-100 zugegeben wurde genommen
Zellkultur
menschlichen Magen Adenokarzinomzellen. (ATCC; CRL-1739) wurden in DMEM (BioWhittaker) Kultur, ergänzt mit 10% Hitze beibehalten -inactivated fötalem Rinderserum (Hyclone) bei 37 ° C und 5% CO 2. Für LDH-Freisetzungstest und Mikroskop Auswertung wurden die Zellen in 24-Well-Platten plattiert und bis zur Konfluenz gezüchtet. In allen Experimenten wurde das Medium in serumfreies Medium gewechselt ~ 12 h vor der Behandlung mit LL-37 zur Zelle, WLBU2 und CSA-13 (0-200 &mgr; g /ml) in einzelnen Vertiefungen für 1 Stunde. Zellkulturmedium wurde dann gesammelt, zentrifugiert (10 min, 5000 rpm, RT) und einer LDH Bewertung (LDH-Zytotoxizität Assay Kit; BioVision Inc.)
Erklärungen
Danksagung
Diese Arbeit wurde von NIH unterstützt wurde gewähren HL067286 und der Medizinischen Universität Bialystok gewährt 3-22458F und 3-18714L
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Dr. P. Savage ist ein bezahlter Berater für Ceragenix Pharmaceuticals, Angeborene Immunsystem Inc., und WittyCell. Keiner der Forschung in diesem Papier berichtet, wurde von Ceragenix Pharmaceuticals oder von einer anderen Körperschaft unterstützt. Andere Autoren: keine zu erklären
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• Auswertung der Durchgang von Lactobacillus gasseri K7 und Bifidobakterien vom Magen zum Darm eines einzelnen Reaktormodells
• Ballon-Verschluss retrograden transvenösen Verödung für Magenvarizen: die Beziehung zwischen dem klinischen Ergebnis und gastro Shunt occlusion