actividades bactericidas da LL-37 esteróide catiónico CSA-13 e o péptido de catelicidina contra Helicobacter pylori em gástrico simulado juice

actividades bactericidas do esteróide catiónico CSA-13 e o péptido de catelicidina LL-37 contra a Helicobacter pylori
em suco gástrico simulado
Abstract
Fundo
a aparência mundial de cepas resistentes de H. pylori
motiva a busca de novos agentes com potencial terapêutico contra esta família de bactérias que coloniza o estômago, e está associada com o desenvolvimento de adenocarcinoma . Este estudo foi desenhado para avaliar in vitro of the anti-H. pylori
potencial da cathelicidin LL 37-peptídeo, que é naturalmente presente no suco gástrico, o seu WLBU2 análogo sintético otimizado, eo agente antibacteriano não peptídico ceragenin CSA-13.
Resultados
De acordo com estudos anteriores , foi observado um aumento da expressão de PACS-18 /LL-37 na mucosa gástrica obtida a partir de H. pylori
indivíduos infectados. MBC valores (concentração bactericida mínima) no intervalo determinado meio contendo nutrientes 100-800 ug /ml de LL-37, 17,8-142 ug /ml para WLBU2 e 0.275-8.9 ug /ml para ceragenin CSA-13. Estes dados indicam atividades antibacterianas substanciais, mas muito diferentes contra isolados clínicos de H. pylori
. Após incubação em suco gástrico simulado (pH baixo com presença de pepsina) CSA-13, mas não LL-37 ou WLBU2, reteve actividade antibacteriana. Em comparação com LL-37 e WLBU2 péptidos, CSA-13 actividade foi também mais resistente à inibição por mucinas gástricas isoladas do hospedeiro.

Conclusão Estes dados indicam que os agentes antimicrobianos à base de ácido eólico, tais como CSA-13 são resistentes à degradação proteolítica e inibição por mucina e têm potencial para o tratamento de H. pylori
infecções, incluindo as causadas pelas estirpes de claritromicina e /ou metronidazole-resistente.
fundo
Helicobacter pylori
é realizado por mais de metade da população adulta do mundo [1]. Pode cronicamente colonizar a mucosa gástrica humana, em que é encontrado na camada de muco e é feita aderir a células epiteliais [2]. Embora a maioria dos indivíduos infectados permanecem assintomáticos, a infecção com H. pylori
pode promover gastrite grave [3] e aumentar significativamente o risco de doenças malignas gástricas [4, 5]. Em alguns estudos epidemiológicos, H. pylori
erradicação foi demonstrado ser eficaz na prevenção do cancro gástrico [6, 7]. Além disso, H. pylori
erradicação foi encontrada para diminuir a incidência ea gravidade das lesões com potencial carcinogénico em modelos animais [8, 9]. mecanismos naturais que protejam o hospedeiro contra infecções por H. pylori
dependem da função do sistema de defesa inata em que os péptidos antibacterianos, tais como catelicidina LL-37 [10, 11] e O-glicanos de mucina gástrica [12] desempenham um papel chave.
LL-37 é um péptido processado proteoliticamente derivado do domínio C-terminal de catelicidina humana (PACS-18 /ll-37) que é constitutivamente libertado para o espaço extracelular por granulócitos fagocitárias e células epiteliais [13] . Das funções atribuídas à LL-37 incluem a prevenção do crescimento bacteriano [14], a neutralização da molécula bacteriana parede bioactividade [15], e a activação de células hospedeiras através da ligação de receptores específicos da membrana celular [16-18]. H. pylori
regula positivamente a produção de LL-37 /hCAP18 pelo epitélio gástrico, sugerindo que cathelicidin ou seus derivados LL-37 contribui para determinar o equilíbrio entre a defesa da mucosa host e H. pylori
mecanismos de sobrevivência que regem crônica infecção com este patógeno gástrico [10, 11].
catiônicos peptídeos antibacterianos (CAPs), incluindo LL-37 têm sido amplamente estudados como uma fonte potencial de novas moléculas antibacterianas. O péptido WLBU2 engenharia cujos resíduos são dispostos para formar uma estrutura helicoidal anfipática com carga óptima e densidade hidrofóbico, supera algumas limitações de LL-37 natural, tal como a sensibilidade à Mg 2+ ou Ca 2+ e inactivação pelo sangue soro [19]. Portanto WLBU2 poderia tratar infecções onde LL-37 é ineficaz. A fim de gerar moléculas capazes de mimetizar a capacidade das tampas para comprometer a integridade da membrana bacteriana, ceragenins não peptídicos com catiónico, estruturas facialmente anfifílicos característicos da maior parte dos péptidos antimicrobianos foram desenvolvidos. Ceragenins tais como CSA-13 reproduzir a morfologia PAC necessário usar um andaime de ácidos biliares e os grupos de amina [20] anexas. Eles são bactericidas contra ambos os organismos Gram-positivos e Gram-negativas, incluindo as bactérias resistentes a drogas, tais como clinicamente relevante meticilina Staphylococcus aureus resistente à
(MRSA), e um estudo anterior demonstrou que a susceptibilidade CSA-13 tem uma MIC 50 /MBC 50 proporção de 1 [21, 22]. Neste estudo que compara a potência bactericida de LL-37, WLBU2 e CSA-13 contra isolados clínicos de H. pylori
. Os resultados sugerem que imita à base de ácido eólico de péptido antimicrobiano tal como CSA-13 têm potencial para o tratamento da infecção por H. pylori
, incluindo as causadas pelas estirpes de claritromicina e /ou metronidazole-resistente
. Resultados
imuno-sondagem de secções mucosas gástricas humanas com anti-PACS-18 /ll-37 anticorpo
As imagens microscópicas de biópsias da mucosa após a avaliação imuno-histoquímica com o anticorpo anti-PACS-18 /ll-37 estão apresentados na Figura 1. A DAB- coloração positiva indica a presença do péptido LL-37 e /ou a sua proteína parental PACS-18. coloração DAB alta intensidade (indicado pela cor marrom) nas células epiteliais produtoras de muco e glândulas fúndicas indica uma alta acumulação de péptido PACS-18 /ll-37 provavelmente conduzido por LL-37 da interacção específica com mucina, que foi relatada em estudos anteriores [23, 24]. A distribuição de PACS-18 /LL-37 na população de células epiteliais mais diferenciada da mucosa gástrica difere do encontrado para humano-defensina β 2 [10] ou lisozima [25], mas é semelhante à observada no cólon [26 ]. biópsias da mucosa gástrica de pacientes infectados com H. pylori
mostrar maior intensidade de coloração DAB comparados com os obtidos a partir de indivíduos não infectados. De acordo com relatórios anteriores, este resultado indica uma resposta de defesa do hospedeiro para H. pylori
[11], que é parcialmente baseado no aumento da expressão de HCAP-18 /LL-37 por células epiteliais gástricas. Figura 1 Presença de PACS-18 /ll-37 péptido em biópsias de mucosas do estômago humano detectada utilizando análise imuno-histoquímica com anticorpos monoclonais a CAP-18 humana /LL-37. As amostras A /B e C /D representam as amostras obtidas de indivíduos infectados não infectados e H. pylori
respectivamente. Os dados apresentados são representativos de cinco experiências.
Actividade bactericida de LL-37, WLBU-2 péptidos e ceragenin CSA-13 contra diferentes estirpes de H. pylori
Para identificar estirpes resistentes, isolados clínicos de H. pylori
foram submetidos a avaliação de MIC (Tabela 1) com vários antibióticos actualmente utilizados no tratamento clínico da infecção por H. pylori
. Entre sete isolados testados obtidos de indivíduos diferentes, a estirpe 4 foi resistente ao metronidazol e linhagens 5, 6, 7 foram resistentes tanto metronidazol e claritromicina. Todos os isolados foram sensíveis à amoxicilina e tetraciclina. Consistente com relatórios anteriores sobre os efeitos do HBD-1, H-BD-2 e LL-37 peptídeos contra H. pylori
[10, 11] todas as estirpes isoladas de H. pylori
foram mortos após 6 horas de incubação com LL-37, WLBU2 e CSA-13 com MBC média (ug /ml) Os valores de 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 e 0,31 ± 0,25 quando MBC foi avaliada em tampão de HEPES, ou de 300 ± 232, 53 ± 41 e 2,98 ± 3,11 quando MBC foi avaliada em caldo Brucella lingote, respectivamente (Figura 2). Avaliação dos valores MBC em tampão HEPES com adição de 2 mM MgCl 2 para H. pylori ATCC 43504
revelou um aumento de oito vezes por LL-37, e um aumento de quatro vezes para ambos WLBU2 e CSA-13 (dados não mostrar). A actividade bactericida Figura 2 contra H. pylori. concentração bactericida mínima (MBC) de LL-37 (coluna branca), WLBU2 (coluna de cinza) e CSA-13 (coluna preta) contra o H. pylori
(ATCC 43504 tensão e sete isolados clínicos obtidos a partir de amostras de mucosa de diferentes disciplinas ) avaliada em HEPES (painel a) ou Caldo de Brucella Bulion (painel B). MBC indica concentrações em que os compostos erradicar completamente um inóculo de H. pylori
.
Tabela 1 Avaliação da sensibilidade das estirpes clínicas de H. pylori
aos antibióticos.
H. pylori
estirpes

Antibióticos
AMX
CLR
TET
Metronidazol
ATCC 43504
0,016
0,094
0,25
64,0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0,25
64,0 ®
1.0
96,0 ®
6
0,032
1,5 ®
1,5
32,0 ®
7
0,047
1,5 ®
2.0
48,0 ®
valores da CIM (ug /ml) (AMX-amoxicilina, CLR-claritromicina, TET-tetraciclina)
atividade antibacteriana de LL-37, WLBU2 e CSA-13 após a pré-incubação em pH baixo com pepsina ou mucina
Além de inibição conhecida de CAPs atividade antibacteriana por cátions bivalentes, como Mg 2 + e Ca 2 +, a actividade proteolítica de pepsina pode também comprometer a função CAPs no ambiente de suco gástrico com a presença de mucinas, e baixo pH. Para abordar esta possibilidade foi avaliada a actividade antibacteriana contra a Escherichia coli MG1655
após 3 horas de pré-incubação de LL-37, WLBU2 e CSA-13 em suco gástrico simulado, em comparação com a actividade após a sua pré-incubação em PBS a pH 7,4 . Antes de realizar o ensaio de morte, o pH das amostras com pH baixo e a pH baixo /pepsina foi ajustado para 7,4. A actividade antibacteriana dos péptidos LL-37 e WLBU2 contra E. coli MG1655
não foi significativamente alterado após a pré-incubação, a pH ~ 1,5, mas perdeu-se após pré-incubação a pH ~ 1,5, na presença de pepsina (Figura 3A e 3B). Em contraste, a actividade antibacteriana de CSA-13 não foi alterada pelo pré-incubação a pH ~ 1,5 com ou sem pepsina (Figura 3C). Por outro lado, as actividades bactericidas de todos os componentes foram comprometidas em várias extensões, quando testado utilizando um ensaio de morte bacteriana na presença de mucina gástrica purificada. Em estreita concordância com os resultados obtidos a partir deste E. coli
estudo MG1655, valores MBC de LL 37-peptídeo avaliada após 1H pré-incubação com tampão a pH baixo contendo pepsina ou mucina foi aumentada, mas as de CSA-13 eram quase inalterada (Figura 3D). Todos os agentes avaliadas perdeu actividade antibacteriana em PBS suplementado com 10% de bílis humana (uma concentração que não interfira com E. coli MG1655
crescimento - dados não mostrados). Este resultado sugere que as propriedades físico-químicas das moléculas antibacterianas promover a sua inserção na lipoproteína de bílis, limitando desse modo a sua interacção com a parede bacteriana. Não houve nenhum estudo para avaliar a actividade antibacteriana de tampões em suco duodenal, mas estes resultados indicam que o refluxo biliar para o estômago pode interferir com a actividade CAPS. Figura 3 A actividade antibacteriana contra E. coli MG1655 e H. pylori ATCC 43504. estirpe A actividade antibacteriana de LL-37 (painel A), WLBU2 (painel B) e CSA-13 (painel C) contra E. coli MG1655 após
de pré-incubação (3 h a 37 ° C) em PBS (círculos abertos), suco gástrico simulado a pH ~ 1,5 (quadrados), suco gástrico simulado com pepsina (losangos), suco gástrico simulado com mucina (triângulos) e PBS com humanos biliar (10%) obtida a partir da vesícula biliar (círculo a cheio). Os dados mostrados são médias ± DP de três a quatro experiências. MBC de LL-37 (coluna branca) e CSA-13 (coluna preta) (painel D) contra H. pylori
(ATCC 43504) após pré-incubação (1 h a 37 ° C) em suco gástrico simulado a pH ~ 1.5 (a), o suco gástrico simulado com pepsina (B) e na presença de mucina (C) a caracterização analítica
de LL-37 e CSA-13 após incubação com pepsina
análise de espectrometria de massa (Figura 4) revela que três horas de incubação com pepsina resulta em degradação extensa de LL-37. No entanto, a pH baixo, a digestão com pepsina é altamente específica e LL-37 de clivagem do péptido está limitada ao local com os aminoácidos hidrofóbicos. potenciais locais de clivagem previsto por PeptideCutter http software caracterização:.. //kr ExPASy org /ferramentas /peptidecutter /, sugerem que a LL-37 digestão com pepsina em nossas condições experimentais deve liberar 11 produtos, incluindo 3 peptídeos mais curtos (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD e LVPRTES). Estas previsões são consistentes com a análise de espectro de massa, que não mostra a presença de qualquer LL-37 intacta remanescente após incubação com pepsina a pH baixo, mas não revelam o aparecimento de novos picos múltiplos com diferentes tempos de retenção. A actividade antibacteriana restante de LL-37 a seguir ao tratamento com pepsina (Figura 3A e 3D) nos ensaios de morte provavelmente representa a actividade residual destes fragmentos de LL-37. Ao contrário do que a degradação observada de LL-37, 13-CSA caracterização analítica não foi alterada depois da incubação com pepsina a um pH baixo. Figura 4 Análise de espectrometria de massa. A análise de espectrometria de massa de LL-37 (painel A) e CSA-13 (painel B) em PBS (curva 1) tampão de pH baixo (curva 2) e tampão de pH baixo, com presença de pepsina (curva 3). O cromatograma iónico total (TIC) são apresentadas para cada condição de amostra com uma ampliação de massa-para-carga (m /z) os espectros que mostra a intensidade dos picos TIC encaixotados. O peso molecular de LL-37 intacto é 4494, o que pode ser observado com diversas cargas (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 PM = 900, etc) no modo de iões positivos. O peso molecular de CSA13 é 678, que pode ser observada directamente e com cargas múltiplas. Os dados de uma experiência são mostrados.
Toxicidade de LL-37, WLBU2 e CSA-13 contra glóbulos vermelhos e as células de adenocarcinoma humano
inserção não-específico de péptidos antibacterianos e suas mímicas para as membranas das células hospedeiras pode causar toxicidade. permeabilização da membrana da célula hospedeira pode ser medida pela libertação de proteínas tais como hemoglobina e LDH a partir do citosol para o espaço extracelular. Ao avaliar a hemoglobina e a libertação de LDH (Figura 5A e 5B), que não mostram significativa permeabilização da membrana por quaisquer moléculas testadas no intervalo em que eles têm actividade bactericida em tampões salinos (Figura 2A, Figura 3). Esta constatação foi confirmada por análise microscópica da morfologia celular de adenocarcinoma mostrando nenhuma diferença visível entre as células de controlo e as tratadas com 10 ug /ml de LL-37, WLBU2 ou CSA-13 (Figura 5C). No entanto, um aumento nos níveis de hemoglobina e de libertação de LDH foi observada com o aumento da concentração. Entre as três moléculas testadas, WLBU2 foi o agente mais forte hemolítica, mas todos eles apresentam capacidade semelhante para comprometer a integridade da membrana celular de adenocarcinoma (Figura 5B e 5C). CSA-13 As concentrações bactericidas contra H. pylori
e E. coli MG1655
(Figuras 2A, 2B e 3C) avaliada em solução salina de tampão, bem como de nutrientes contendo estavam abaixo da sua concentração hemolítico mínimo e abaixo das concentrações que causam disfunção de adenocarcinoma membranas celulares. Figura 5 Avaliação da toxicidade celular. A hemoglobina e LDH de libertação a partir de células vermelhas do sangue humano e células de adenocarcinoma gástrico humano (painel A e B, respectivamente) após a adição de LL-37 (círculos), WLBU2 (losangos), e CSA-13 (triângulos), seguido por incubação durante 1 h a 37 ° C. Os dados mostrados são médias ± DP de três experiências. Morfologia das células humanas de adenocarcinoma gástrico antes (controle) e após a LL-37, WLBU2 e tratamento CSA-13 foi avaliada por microscopia de contraste de fase (painel C). Os dados de uma experiência representativa são mostrados. Dois outros experimentos revelaram resultados semelhantes.
Discussão
A taxa de sucesso do tratamento de H. pylori
infecção estomacal, conseguido com terapias de combinação de dois antibióticos e um inibidor de bomba de protões diminuiu de mais de 90% a cerca de 80 % durante a última década [27]. Além disso, o custo desta terapia é significativo, e, por conseguinte, uma necessidade de meios mais amplamente disponíveis para tratar ou prevenir a infecção por H. pylori
ainda existe [28]. Novos agentes para o tratamento de infecções de H. pylori Quais são necessárias também devido ao aumento dos problemas de resistência a drogas causadas por uso extensivo de antibióticos [29] e os mecanismos de sobrevivência adaptativas de bactérias patogênicas para neutralizar agentes antimicrobianos usados ​​atualmente. Por exemplo, H. pylori
estirpes resistentes à amoxicilina, metronidazole e claritromicina foram relatados [30, 31]. Métodos para melhorar tratamentos para H. pylori
pode ser guiada por uma visão sobre os mecanismos naturais pelos quais infectados pacientes respondem a esta bactéria e as razões pelas quais os mecanismos normais de acolhimento de defesa falhar.
Este estudo confirma um relatório anterior do aumentou PACS-18 /ll-37 de expressão em mucosa gástrica de pacientes infectados com H. pylori
[11]. Esta descoberta sugere que o aumento da produção do péptido bactericida LL-37 pode desempenhar um papel chave na defesa do hospedeiro contra o H. pylori
[11]. No entanto, esta resposta bactericida em algumas disciplinas é insuficiente e infecção por H. pylori
ainda pode chegar a uma fase crônica. A falta de função bactericida de LL-37 nesta configuração tem sugerido que a expressão aumentada de PACS-18 /ll-péptido 37 no muco gástrico de indivíduos infectados podem ter funções adicionais como um agente anti-inflamatório e estimular o crescimento. De facto, demonstrou-se recentemente que a cicatrização da úlcera gástrica em ratos é promovida pela transactivação mediada por catelicidina de receptores do factor de crescimento epidérmico (EGFR) por meio do factor de crescimento transformante alfa (TGFa) via de sinalização [32]. Em alternativa, perda de defesa contra H. pylori
pode ser devido à perda da função antibacteriana de LL-37 no meio da mucosa gástrica. Consequentemente, o design de agentes antimicrobianos que são mais eficazes neste cenário pode ser benéfico.
Motivado por resultados imuno-histológicos, a atividade de LL-37 contra isolados clínicos de H. pylori
e E. coli
MG1655 sob biologicamente condições relevantes foi comparado com o do péptido sintético WLBU2 e o ceragenin CSA-13. Este estudo mostra que o CSA-13, ao contrário da LL-37 e os péptidos WLBU2, mantém uma forte actividade bactericida na presença de mucina e após pré-incubação com pepsina a um pH baixo. Estas condições representam desafios relacionados com H. pylori
tratamento, uma vez que estas bactérias no estômago são protegidos do ambiente ácido por uma camada de muco espesso e a eficácia de várias drogas antimicrobianas é grandemente diminuída a pH ácido [31]. Por conseguinte, a primeira terapia eficaz para a infecção por H. pylori
foi uma combinação de drogas antimicrobianas relativamente insensível ao pH, tais como bismuto, metronidazole e tetraciclina [33]. Além disso, como o estômago esvazia periodicamente o seu conteúdo (terapia tópica tende a ser diluído e lavou-se para fora) a descoberta de que a CSA-13 possui uma actividade bactericida em muito baixa concentração em seguida, LL-37, após o mesmo tempo de incubação (3-6 horas) [11], sugere que a CSA-13 podem ter um potencial terapêutico para o tratamento da infecção por H. pylori
. A actividade antibacteriana de CSA-13, que tem uma carga líquida mais pequeno e uma distribuição única desta carga ao longo de um andaime de esteróide, quando comparado com o LL-37 e WLBU2 péptidos, também se verificou ser menos inibido, pela mucina isolado a partir de mucosa gástrica. O potencial terapêutico baseado na capacidade de CSA-13 para erradicar H. pylori
também é suportado por relatado anteriormente actividade antibacteriana contra outras estirpes bacterianas, incluindo isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa
[21] e de S. aureus
[22]. capacidade única de CSA-13 para comprometer a integridade da membrana bacteriana e a natureza química deste composto de baixo peso molecular em massa, que se traduz em menores custos de síntese em comparação com péptidos antibacterianos catiónicos sugerem que o CSA-13 ou talvez outros ceragenins têm potencial para o tratamento de H. pylori
infecção, incluindo as causadas pelas suas estirpes resistentes.

Conclusão a actividade bactericida da ceragenin CSA-13 é mantida após a pré-incubação em suco gástrico simulado e na presença de mucina. Essa avaliação in vitro
indica um potencial significativo desta molécula no tratamento da infecção da mucosa do estômago.
Métodos
agentes antibacterianos
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) e WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) peptídeos foram adquiridos de Bachem (king of Prussia, PA). CSA-13 foi preparado como previamente descrito [34]. Amoxicilina (AMX), claritromicina (CLR), tetraciclina (TET) e metronidazol foram adquiridos da Sigma.
Recolha de amostras de mucosa e biliares gástricas
Durante gastroscopia, realizado com ou um GIF V2 ou Q145 gastroscópio (Olympus), várias fatias da mucosa gástrica foram tomadas a partir das regiões prepyloric e corpos do estômago. A infecção por H. pylori
foi estabelecido nas amostras de biópsia, utilizando um teste da urease (CLO-teste). biliar humana foi obtida a partir da vesícula biliar dos pacientes submetidos a colecistectomia. As amostras foram filtro-esterilizado através de uma membrana de 0,45 um, antes de ser diluída em PBS (1: 1) e misturou-se com agentes antibacterianos utilizados em ensaios de morte de bactérias. Os estudos foram aprovados pela Universidade de Medicina da Comissão de Ética Bialystok para pesquisa em seres humanos e animais, e todos os pacientes deram consentimento informado escrito para participação no estudo.
Estudos imunohistoquímicos
Estudos imunohistoquímicos foram realizados em fixado em formol e incluídas em parafina secções embebidas humanos da mucosa gástrica utilizando um anti-LL-37 anticorpo de coelho (H-075-06, utilizado na diluição 1: 100; Phoenix Pharamceuticals Inc.). materiais embebidos em parafina foram seccionados com a espessura de 5 um e flutuou na água destilada a 45 ° C. As secções foram então montadas em lâminas e colocado em 57 ° C forno durante a noite. Os cortes foram desparafinados de acordo com procedimentos padrão e extinguiu-se com peróxido de hidrogénio a 0,9% em metanol durante 30 minutos. As secções foram incubadas com anticorpo primário a 37 ° C durante 60 minutos, lavou-se com 1% de PBSA (1% BSA em PBS), e submetido a ligação com o anticorpo secundário (de cabra biotinilado anti-IgG de coelho, 1: 400 de diluição). A amplificação foi realizada com um estojo Vectastain ABC, e um sistema de detecção de HRP foi utilizado para colocalize actividade da peroxidase com um substrato DAB. As secções foram contrastadas com hematoxilina. As amostras foram vistos com um Nikon Eclipse 80 microscópio sob ampliação de 40 ×.
Avaliação do MIC e MBC
A concentração inibitória mínima (CIM) dos antibióticos convencionais contra sete isolados clínicos diferentes de H. pylori
(9 × 10 8 UFC /ml) foi determinada usando Muller-Hinton (MH) contendo 5% de sangue de ovelha. A incubação foi continuada durante 4 dias a 35 ° C em condições microaerofílicas mantidas com o uso de um kit de geração de gás BR60 Gas Pack-Campylobacter. Os isolados clínicos de H. pylori
foram consideradas resistentes a antibióticos respectivas quando os valores de MIC eram superiores a 4 ug /mL para AMX, 1 ug /ml para CLR e 16 ug /ml para TET e Metronidazol. A concentração bactericida mínima (MBC) de agentes antibacterianos foi avaliada utilizando um inoculo a 10 8 UFC /ml. Após uma incubação de seis horas a 37 ° C, aliquotas de 10 ul das suspensões foram manchados em agar Columbia suplementadas com sangue de ovelha (5%).
Matar bactérias ensaio
As actividades bactericidas de LL-37, péptidos WLBU2 e ceragenin CSA-13 contra E. coli MG1655
na presença de mucina ou pepsina de muco porcino (Sigma) e bílis humana foram medidos como descrito anteriormente [35]. As bactérias foram crescidas até à fase mid-log a 37 ° C (controlado por avaliação da densidade óptica a 600 nm) e ressuspensas em tampão PBS (pH = 7,4). As suspensões de bactérias foram então diluídas 10 vezes em 100 ul de soluções contendo agentes antibacterianos por si só ou com mucina (1000 ug /ml), ou biliar (os últimos 1:10 biliares diluição simula o ambiente do intestino delgado superior no qual é biliar secretada [36] (pH = 7,4)). Num outro conjunto de experiências, foi determinada a actividade antibacteriana desses componentes após a sua pré-incubação em suco gástrico simulado [36, 37], a pH ~ 1,5 com e sem pepsina (0,5 mg /ml). Após incubação de bactérias com moléculas antibacterianas por uma hora a 37 ° C, as suspensões bacterianas foram colocadas em gelo e diluiu-se a 10- 1000- dobra. Alíquotas de cada diluição (10 ul) foram vistos em placas de agar LB da cultura durante a noite a 37 ° C. O número de colónias em cada diluição foi contado na manhã seguinte. As unidades formadoras de colónias (CFU /ml) de amostras individuais foram determinados a partir do factor de diluição. A espectrometria de massa

caracterização analítica foi realizada sobre as suspensões CSA-13 e MI-37 após incubação 3H com pepsina (0,5 mg /ml) a um pH baixo (~ 1,5) a 37 ° C, utilizando o Shimadzu (Columbia, MD) instrumento (o sistema de LC-MS consistia de um sistema de distribuição de solvente LC-20AB e SIL-20A amostrador automático acoplado a duplo comprimento de onda do detector UV-Vis e um único espectrómetro de massa de quadrupolo LCMS 2010EV), acoplado a uma coluna Shimadzu Premier C18 (150 mm x 4,6 mm Dl, 5 um de tamanho de partícula). O caudal da fase móvel foi de 1 ml /min com uma proporção a partir de 90% de fase móvel A (água) e 10% de fase móvel B (acetonitrilo), ambos com 0,1% (v /v) de ácido fórmico. O método analítico consistiu nos seguintes passos: (i) injecção da amostra e segurando a 10% de B durante 5 min, (II) gradiente linear de 10% a 90% de B ao longo de 15 minutos, (iii) que prende a 90% de B durante 5 minutos, (iv) o passo isocrático a 10% de B e mantendo durante 5 minutos antes da injecção da amostra seguinte. A espectrometria de massa foi realizada no eluente que utiliza ionização por electropulverização (ESI) no modo ião positivo com uma gama de m /z 160-2000 digitalizada.
lise de glóbulos vermelhos
A actividade hemolítica de LL-37, WLBU-2 e CSA-13 (0-200 μ
g /ml), contra as células vermelhas do sangue humano (RBC) foi testada utilizando eritrócitos em suspensão em PBS. RBC preparado a partir de sangue fresco (hematócrito ~ 5%) foram incubadas durante 1 h a 37 ° C após a adição de moléculas de ensaio. concentração de hemoglobina Relativa nos sobrenadantes após centrifugação a 2000 x g foi monitorizada através da medição da absorvância a 540 nm. 100% de hemólise foi feita a partir de amostras em que a 2% foi adicionado Triton X-100
cultura celular
células de adenocarcinoma gástrico humano. (ATCC; CRL-1739) foram mantidas em DMEM cultura (BioWhittaker) suplementado com 10% de calor -inactivated soro bovino fetal (Hyclone) a 37 ° C e 5% de CO 2. Para ensaio de libertação de LDH e células de avaliação do microscópio foram plaqueadas em placas de 24 poços e crescidas até à confluência. Em todas as experiências, o meio foi mudado para meio isento de soro ~ 12 h antes do tratamento com célula de LL-37, WLBU2 e CSA-13 (0-200 ug /ml) em poços individuais, durante 1 hora. meio de cultura celular foi então recolhido, centrifugado (10 min, 5000 rpm, RT) e submetido a uma avaliação de LDH (LDH-citotoxicidade Assay Kit; BioVision Inc.)
declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo NIH conceder HL067286 e da Universidade de Medicina de Bialystok concede 3-22458F e 3-18714L
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Dr P. Savage é um consultor pago para Ceragenix Pharmaceuticals, Inc. imunitário inatas, e WittyCell. Nenhuma das pesquisas relatadas neste trabalho foi apoiado por Ceragenix Pharmaceuticals ou por qualquer outra entidade corporativa. Outros autores: none para declarar
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