Bakteereja tappava toiminta kationisen steroidi CSA-13 ja cathelicidin peptidi LL-37 vastaan ​​helikobakteeri simuloidussa mahanesteessä

Bakteereja tappava toiminta kationisen steroidi CSA-13 ja cathelicidin peptidi LL-37 vastaan ​​helikobakteeri
simuloidussa mahanesteessä
tiivistelmä
tausta
maailmanlaajuinen ulkonäkö lääkkeille vastustuskykyisten kantojen helikobakteeri
motivoi etsimään uusia aineita, joilla terapeuttista potentiaalia vastaan ​​tämän perheen bakteerien colonizes mahassa, ja liittyy adenokarsinooma kehitykseen. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida in vitro of the anti-H. pylori
potentiaali cathelicidin LL-37-peptidi, joka on luontaisesti mahanesteessä, optimoidun synteettinen analogi WLBU2, ja ei-peptidi bakteerilääke ceragenin CSA-13.
Tulokset
suostumuksella aiemmissa tutkimuksissa , lisääntynyt ilmentyminen hCAP-18 /LL-37 havaittiin mahan limakalvoa saatu helikobakteeri
infektion saaneilla. MBC (pienin bakterisidinen pitoisuus) arvoja määritetään ravinteiden sisältävässä väliaineessa alueella 100-800 ug /ml LL-37, 17,8-142 ug /ml WLBU2 ja 0,275-8,9 ug /ml ceragenin CSA-13. Nämä tulokset osoittavat merkittävää, mutta hyvin erilaisia ​​antibakteerisia vaikutuksia kliinisiä kantoja H. pylori
. Inkuboinnin jälkeen simuloidussa mahanesteessä (alhainen pH läsnäolo pepsiiniä) CSA-13, mutta ei LL-37 tai WLBU2, säilytti antibakteerista aktiivisuutta. Verrattuna LL-37 ja WLBU2 peptidit, CSA-13-aktiivisuus oli myös vastustuskykyisempiä inhibitiolle eristetty isäntä mahalaukun musiinien.
Päätelmä
Nämä tiedot osoittavat, että koolihapon-pohjainen antimikrobisia aineita, kuten CSA-13 vastustaa proteolyyttisen hajoamisen ja inhibitiota musiinin ja on potentiaalia hoidettaessa H. pylori
infektioita, mukaan lukien aiheuttama klaritromysiinin ja /tai metronidatsoli-resistentit kannat.
tausta
Helicobacter pylori
suoritetaan yli puoli maailman aikuisväestöstä [1]. Se voi kroonisesti kolonisoida ihmisen mahalaukun limakalvo, jossa se löytyy Limakerroksen ja on kiinnitetty epiteelisoluihin [2]. Vaikka useimmat tartunnan saaneet kohteet pysyvät oireettomia, infektio helikobakteeri
voi edistää vakavia gastriitti [3] ja merkittävästi lisätä riskiä mahasyöpäriskiin [4, 5]. Joissakin epidemiologisissa tutkimuksissa, helikobakteeri
hävittämiseksi osoitettiin olevan tehokkaita mahalaukun syövän ehkäisyä [6, 7]. Lisäksi Helikobakteeri
hävittämiseksi havaittiin vähentävän ja vaurioiden vakavuuden kanssa karsinogeenisuudesta eläinmalleissa [8, 9]. Luonnollinen mekanismeja, jotka suojaavat isäntää Helikobakteeri
infektioita riippuvat toiminta luontaisen puolustusjärjestelmän, jossa antibakteerinen peptidit, kuten cathelicidin LL-37 [10, 11] ja O-glykaanien mahalaukun musiinia [12] pelata keskeinen rooli.
LL-37 on proteolyyttisesti peräisin olevan peptidin C-terminaalisen domeenin ihmisen cathelicidin (hCAP-18 /LL-37), joka on konstitutiivisesti vapautuu solunulkoiseen tilaan fagosyyttisten granulosyyttien ja epiteelisolut [13] . Toiminnot katsoneet LL-37 kuuluu ehkäisy bakteerien kasvua [14], neutralointi bakteerin seinämän molekyylin biologinen aktiivisuus [15], ja aktivoituminen isäntäsolujen sitoutumalla erityisiä solukalvoreseptorien [16-18]. Helikobakteeri
ylössäätelee tuotantoa LL-37 /hCAP18 jota mahalaukun epiteelin, mikä viittaa siihen, että cathelicidin tai sen johdannaisen LL-37 lasketaan mukaan tasapaino isännän limakalvon läpi ja H. pylori
selviytymisen ohjaavien mekanismien krooninen infektio tämä mahalaukun taudinaiheuttajan [10, 11].
Kationiset antibakteerinen peptidejä (CAPS) hoitoon lukien LL-37 on tutkittu laajasti mahdollisena uusia antibakteerisia molekyylejä. Rakennettujen WLBU2 peptidi joiden jäämät järjestetty muodostamaan amfipaattisen kierteisen rakenteen optimaalisen latauksen ja hydrofobinen tiheys, voittaa joitakin rajoituksia luonnon LL-37, kuten herkkyys Mg 2+ tai Ca 2+ ja inaktivointia veren seerumin [19]. Siksi WLBU2 voisi infektioiden hoitoon, jossa LL-37 on tehoton. Jotta saadaan aikaan molekyylejä, jotka kykenevät jäljittelemään CAP- kykyä tehdä kompromisseja bakteerimembraania eheys, ei-peptidi-ceragenins kationisten, fasiaalisesti amfifiiliset rakenteet ominaista kaikkein antimikrobiset peptidit kehitettiin. Ceragenins kuten CSA-13 toistaa tarvittava CAP morfologia käyttäen sappihappoja rakennustelineet ja liitteenä amiiniryhmät [20]. Ne ovat bakterisidisen sekä gram-positiivisia ja gram-negatiivisia organismeja, kuten lääkkeille vastustuskykyisten bakteerien kuten kliinisesti merkittäviä MRSA
(MRSA), ja aiemman alttius tutkimus osoitti, että CSA-13 on MIC 50 /MBC 50 suhde 1 [21, 22]. Tässä tutkimuksessa verrataan bakterisidinen teho LL-37, WLBU2 ja CSA-13 kliinisiä kantoja vastaan ​​helikobakteeri
. Tulokset viittaavat siihen, että koolihapon-pohjainen jäljittelee antimikrobisen peptidin, kuten CSA-13 on potentiaalia hoidettaessa H. pylori
-infektion, mukaan lukien aiheuttama klaritromysiinin ja /tai metronidatsoli-resistentit kannat.
Tulokset
immunohistokemiallinen hyvää ihmisen mahan limakalvon osien anti-hCAP-18 /LL-37-vasta-aineen
mikroskooppinen kuvia limakalvon biopsiat jälkeen immunohistokemiallinen arviointi anti-hCAP-18 /LL-37-vasta-aine on esitetty kuviossa 1. DAB- positiivista värjäytymistä osoittaa läsnäolon LL-37-peptidin ja /tai sen emoproteiinin hCAP-18. Korkean intensiteetin DAB värjäyksen (merkitty ruskea väri) on limaa tuottavien epiteelisolujen ja fundic rauhaset osoittaa kertyy runsaasti hCAP-18 /LL-37 peptidi todennäköisimmin ohjaavat LL-37 erityinen vuorovaikutus musiinin, joka oli raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa [23, 24]. Jakauma hCAP-18 /LL-37 on eriytetympää epiteelisolujen väestöstä mahalaukun limakalvon eroaa löytynyt ihmisen β-defensiini 2 [10] tai lysotsyymin [25], mutta on samanlainen kuin paksusuolessa [26 ]. Mahalaukun limakalvon koepaloja saaneiden potilaiden helikobakteeri
osoittavat suurempi intensiteetti DAB värjäyksen verrattuna saatujen ei-tartunnan aiheista. Aiempien raporttien, tämä tulos osoittaa isännän puolustuksen vastaus helikobakteeri
[11], joka perustuu osittain lisääntyneen ekspression hCAP-18 /LL-37 mahalaukun epiteelisolujen. Kuvio 1 läsnäolo hCAP-18 /LL-37 peptidi limakalvon koepalat ihmisen mahalaukussa havaittiin käyttäen immunohistokemiallista analyysiä, jossa monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen CAP-18 /LL-37. Näytteet A /B ja C /D edustavat näytteet on saatu ei-tartunnan ja helikobakteeri
infektion saaneilla vastaavasti. Esitetyt tiedot edustavat viisi koetta.
Bakterisidinen LL-37, WLBU-2-peptidien ja ceragenin CSA-13 eri kantoja vastaan ​​H. pylori
tunnistamiseksi resistenttien kantojen, kliinisestä isolaatista H. pylori
alistettiin MIC arviointi (taulukko 1), jossa on useita antibiootteja käytetään tällä hetkellä kliinisessä hoidossa H. pylori
infektio. Niistä seitsemän testatuista isolaateista saatu eri aiheista, kanta 4 oli resistentti metronidatsoli ja kantoja 5, 6, 7 olivat resistenttejä sekä metronidatsolille ja klaritromysiini. Kaikki isolaatit olivat herkkiä amoksisilliini ja tetrasykliiniä. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien vaikutuksista HBD-1, h-BD-2 ja LL-37 peptidejä vastaan ​​helikobakteeri
[10, 11] kaikki eristetty kantoja H. pylori
tapettiin 6 tunnin kuluttua inkubaation LL-37, WLBU2 ja CSA-13 keskimääräinen MBC (ug /ml) arvot 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 ja 0,31 ± 0,25, kun MBC arvioitiin HEPES-puskurissa, tai 300 ± 232, 53 ± 41 ja 2,98 ± 3,11, kun MBC arvioitiin Brucella liemi Jalometalliharkot vastaavasti (kuva 2). Arviointi MBC arvojen HEPES-puskurissa, johon on lisätty 2 mM MgCI 2 Helikobakteeri
ATCC 43504 paljasti kahdeksan kertainen lisäys LL-37, ja nelinkertainen nousu sekä WLBU2 ja CSA-13 (data näy). Kuvio 2 bakterisidinen vaikutus H. pylori. Pienin bakterisidinen pitoisuus (MBC) LL-37 (valkoinen pylväs), WLBU2 (harmaa sarake) ja CSA-13 (musta pylväs) vastaan ​​helikobakteeri
(ATCC 43504 -kanta ja seitsemän kliinisten isolaattien saatu limakalvonäytteistä eri aiheista ) arvioitiin HEPES (paneeli A) tai Brucella liemi Bulion (paneeli B). MBC osoittaa pitoisuudet, mitkä yhdisteet täysin poistaa inokulaatin helikobakteeri
.
Taulukko 1 Arvio herkkyys kliinisiä kantoja H. pylori
antibiooteille.
H. pylori
kannat
Antibiootit
AMX
CLR
TET
Metronidatsoli
ATCC 43504
0,016
0,094
0,25
64.0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0,25
64,0 ®
1.0
96,0 ®
6
0,032
1,5 ®
1,5
32,0 ®
7
0,047
1,5 ®
2,0
48,0 ®
MIC-arvot (ug /ml) (AMX-amoksisilliini, CLR-klaritromysiini, TET-tetrasykliini) B Antibakteerinen aktiivisuus LL-37, WLBU2 ja CSA-13 jälkeen preinkubointi alhaisessa pH pepsiinillä tai musiinituoton
lisäksi tunnettujen esto CAPS antibakteerista aktiivisuutta kaksiarvoiset kationit kuten Mg 2+ ja Ca 2+, proteolyyttisen aktiivisuuden pepsiiniä voivat myös heikentää CAP- toiminto mahanesteessä ympäristön läsnäollessa musiinien, ja alhainen pH. Käsitellä tätä mahdollisuutta arvioimme antibakteerinen vaikutus Escherichia coli
MG1655 3 tunnin esi-inkubaatio LL-37, WLBU2 ja CSA-13 simuloidussa mahanesteessä verrattuna toimintaan sen jälkeen, kun esi-inkubaatio PBS: ssä pH: ssa 7,4 . Ennen suorittaa tappaminen määrityksessä, näytteiden pH on alhainen pH: ssa ja alhaisen pH: n /pepsiini säädettiin 7,4. Antibakteerinen aktiivisuus LL-37 ja WLBU2 peptidejä vastaan ​​E. coli
MG1655 ei muuttunut merkittävästi sen jälkeen, kun esi-inkubaatio pH ~ 1,5, mutta hävisi, kun esi-inkubaatio pH ~ 1,5, kun läsnä on pepsiiniä (kuvio 3A ja 3B). Sen sijaan, antibakteerinen aktiivisuus CSA-13 pysyi ennallaan esi-inkubointi pH ~ 1,5 tai ilman pepsiiniä (kuvio 3C). Toisaalta, bakteereja tappava toiminta kaikki komponentit olivat vaarassa eri laajuudessa, kun sitä testataan käyttäen bakteerien tappaminen määritys läsnä puhdistetun mahan musiinia. Läheisessä kanssa saadut tulokset tästä E. coli
MG1655 tutkimus, MBC arvot LL-37 peptidi arvioidaan jälkeen 1H preinkubointi puskurilla alhaisessa pH sisältävä pepsiiniä tai mukiinia nostettiin vaan ne CSA-13 oli lähes ennallaan (Kuva 3D). Kaikki arvioitiin aineet menettäneet antibakteerinen aktiivisuus PBS: ssä, jota oli täydennetty 10% ihmisen sappeen (pitoisuus, joka ei häiritse E. coli
MG1655 kasvu - tietoja ei ole esitetty). Tämä tulos viittaa siihen, että fysikaalis-kemialliset ominaisuudet antibakteerisia molekyylien edistävät ne liitetään sapen lipoproteiini, mikä rajoittaa niiden vuorovaikutusta bakteerien seinämän. Ei ole tutkimus, jossa arvioidaan antibakteerivaikutukseen maaottelua pohjukaissuolen mehua, mutta nämä tulokset osoittavat, että sapen refluksi vatsaan voi häiritä korkit aktiivisuutta. Kuvio 3 antibakteerinen vaikutus E. coli MG1655 ja helikobakteeri ATCC 43504. Antibakteerinen aktiivisuus LL-37 (paneeli A), WLBU2 (paneeli B) ja CSA-13 (paneeli C) vastaan ​​E. coli
MG1655 jälkeen esihaudonta (3 h 37 ° C) PBS: ssä (avoimet ympyrät), simuloitua mahanestettä pH ~ 1,5 (neliöt), simuloitua mahanestettä pepsiinillä (timantit), simuloitua mahanestettä kanssa mukiinia (kolmiot) ja PBS ihmisen sapen (10%) on saatu sappirakon (ympyrä). Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta neljään kokeissa. MBC LL-37 (valkoinen pylväs) ja CSA-13 (musta pylväs) (paneeli D) vastaan ​​helikobakteeri
(ATCC 43504) jälkeen preinkubointi (1 h 37 ° C: ssa) simuloidussa mahanesteessä, jonka pH ~ 1,5 (A), simuloitua mahanestettä pepsiinillä (B) ja läsnä ollessa musiinia (C) B-Analyyttinen karakterisointi LL-37 ja CSA-13 inkuboinnin jälkeen pepsiinillä
Massaspektrometria-analyysi (kuvio 4) osoittaa, että kolmen tunnin inkubointi pepsiinillä aiheuttaa laajaa hajoamista LL-37. Kuitenkin, alhaisessa pH: ssa, pepsiinidigestiolla on erittäin spesifinen ja LL-37-peptidin lohkaisu on rajoitettu sivuston hydrofobiset aminohapot. Mahdolliset katkaisukohdat ennustaa PeptideCutter luonnehdinta ohjelmiston http: //kr. Expasy. Org /tools /peptidecutter /, viittaavat siihen, että LL-37 pilkkomalla pepsiinin meidän koeolosuhteissa pitäisi vapauttaa 11 tuotteita, kuten 3 lyhyempiä peptidejä (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD ja LVPRTES). Nämä ennusteet ovat yhdenmukaisia ​​massaspektrianalyysin joka ei osoita, että läsnä tahansa ehjä LL-37 jäljellä inkuboinnin jälkeen pepsiinillä matalassa pH: ssa, mutta ei paljasta syntyminen useita uusia huippuja eri retentioaikojen. Jäljellä oleva antibakteerinen aktiivisuus LL-37 käsittelyn jälkeen pepsiinillä (kuvio 3A ja 3D) tappaminen määrityksissä todennäköisesti edustaa jäljellä oleva aktiivisuus näiden LL-37-fragmentteja. Toisin kuin havaittu hajoaminen LL-37, CSA-13 analyyttistä luonnehdintaa ei muuttunut inkubaation jälkeen pepsiinillä alhaisella pH. Kuvio 4 Massaspektrometria-analyysi. Massaspektrometria-analyysi LL-37 (paneeli A) ja CSA-13 (paneeli B) PBS: ssä (käyrä 1) alhaisen pH-puskuria (käyrä 2) ja matala pH puskuri läsnäolo pepsiiniä (käyrä 3). Yhteenlaskettu ioni kromatogrammi (TIC) on esitetty kunkin näytteen kunnossa upotettavat massa-to-maksu (m /z) spektri osoittaa intensiteetti boxed TIC huiput. Molekyylipaino ehjä LL-37 on 4494, joka voidaan havaita useita maksut (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 MW = 900, jne) on positiivinen ioni-tilassa. Molekyylipaino CSA13 on 678, joka voidaan havaita suoraan ja useita maksuja. Tulokset yhdestä kokeesta esitetään.
Myrkyllisyys LL-37, WLBU2 ja CSA-13 vastaan ​​RBC ja ihmisen adenokarsinoomasolua
Epäspesifisiä lisääminen antibakteerisia peptidejä ja niiden jäljittelee isäntäsolun kalvot voi aiheuttaa myrkyllisyyttä. Isäntäsolun kalvon läpäiseväksi voidaan mitata julkaisun proteiinien, kuten hemoglobiinin ja LDH sytosolista solunulkoiseen tilaan. Arvioimalla hemoglobiini ja LDH: n vapautuminen (kuvio 5A ja 5B), emme osoita mitään merkittävää kalvon läpäiseväksi mikään testattu molekyylien alueella, jolla ne ovat bakterisidiaktiivisuus suolaliuoksessa puskureissa (kuvio 2A, kuvio 3). Tämä havainto vahvistettiin mikroskooppinen arviointi adenokarsinoomasolulinjaan morfologia osoittaa mitään näkyvää eroa ohjaus solujen ja niitä käsiteltiin 10 ug /ml LL-37, WLBU2 tai CSA-13 (kuvio 5C). Kuitenkin hemoglobiini ja LDH: n vapautuminen havaittiin kasvava konsentraatio. Niistä kolme molekyylien testattu, WLBU2 oli voimakkainta hemolyyttis agentti, mutta ne kaikki osoittivat samanlaisia ​​kyky tehdä kompromisseja adenokarsinooma solukalvon eheyden (kuvio 5B ja 5C). CSA-13 bakterisidinen pitoisuudet vastaan ​​helikobakteeri
ja E. coli
MG1655 (kuviot 2A, 2B ja 3C) arvioitiin suolaliuosta sekä ravinteiden sisältävässä puskurissa olivat alle sen minimaalinen hemolyyttis keskittyminen ja alle pitoisuuksien aiheuttaa toimintahäiriöitä adenokarsinooma solukalvot. Kuvio 5 arviointi solun myrkyllisyyttä. Hemoglobiini ja LDH: n vapautuminen ihmisen punasoluja ja ihmisen mahalaukun adenokarsinooman soluja (paneeli A ja B) lisäämisen jälkeen LL-37 (ympyrät), WLBU2 (timantit), ja CSA-13 (kolmiot), minkä jälkeen inkuboidaan 1 h 37 ° C: ssa. Esitetyt tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta kokeesta. Morfologia ihmisen mahalaukun adenokarsinoomasoluil- ennen (kontrolli) ja sen jälkeen LL-37, WLBU2 ja CSA-13 hoito arvioitiin faasikontrastimikroskopiaan (paneeli C). Tulokset yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty. Kaksi muuta kokeet osoittivat samanlaisia ​​tuloksia.
Keskustelu
nopeus onnistuneen hoidon helikobakteeri
vatsa-infektio, saavutetaan yhdistelmäterapioihin kahden antibioottien ja protonipumpun estäjä on laskenut yli 90%: sta noin 80 % viimeisen kymmenen vuoden aikana [27]. Lisäksi kustannukset tämä hoito on merkittävä, ja siksi tarvitaan laajemmin saatavilla keinoja hoitoon tai ehkäisyyn helikobakteeri
infektio on edelleen olemassa [28]. Uusi hoitava helikobakteeri
infektiot ovat tarpeen myös lisääntyvän lääkeresistenssideterminantit aiheuttamat ongelmat laajaa antibioottien [29] ja adaptiivista selviytymistä mekanismeja patogeenisten bakteerien torjumiseksi nykyisin käytössä mikrobilääkkeitä. Esimerkiksi helikobakteeri
vastustuskykyisten kantojen amoksisilliini, metronidatsoli ja klaritromysiini on raportoitu [30, 31]. Menetelmät parantaa hoitoja helikobakteeri
voidaan ohjata käsityksen luonnon mekanismeja, joilla tartunnan potilaat reagoivat tämän bakteerin ja miksi normaali isännän puolustusmekanismeja epäonnistua.
Tutkimus vahvistaa aiemman raportin lisääntynyt hCAP-18 /LL-37 ilmentyminen mahalaukun limakalvon aiheiden tartunnan helikobakteeri
[11]. Tämä havainto viittaa siihen, että lisäämällä tuotantoa bakterisidinen peptidin LL-37 voi olla keskeinen rooli isännän puolustuksessa vastaan ​​helikobakteeri
[11]. Kuitenkin tämä bakterisidinen vaste joillakin potilailla on riittämätön ja helikobakteeri
infektio voi vielä nousta krooninen vaihe. Puute bakterisidinen funktio LL-37 tämä asetus on ehdottanut, että lisääntyneen ekspression hCAP-18 /LL-37-peptidin mahalaukun limaan-tartunnan saaneilla potilailla voi olla muita toimintoja, kuten tulehdusta ja kasvua stimuloivan aineen. Itse asiassa se on äskettäin osoitettu, että mahahaavan paranemista rotilla edistävät cathelicidin-välitteisen transaktivaation epidermaalisen kasvutekijän reseptoreita (EGFR) kautta transformoivan kasvutekijä alfa (TGFa) signalointireitin [32]. Vaihtoehtoisesti menetys puolustuslinja helikobakteeri
voi johtua menetys antibakteerinen toiminta LL-37 miljöössä mahalaukun limakalvon. Näin ollen suunnittelu mikrobilääkkeiden, jotka ovat tehokkaampia tässä tilanteessa voi olla hyödyllistä.
Motivoi immunohistologisilla tuloksia, aktiivisuutta LL-37 kliinisiä kantoja vastaan ​​helikobakteeri
ja E. coli
MG1655 alla biologisesti relevantteja olosuhteissa verrattiin synteettisen peptidin WLBU2 ja ceragenin CSA-13. Tämä tutkimus osoittaa, että CSA-13, toisin kuin LL-37 ja WLBU2 peptidejä, on vahvat bakterisidinen vaikutus, kun läsnä on musiinin ja esi-inkuboinnin jälkeen pepsiinillä matalassa pH: ssa. Nämä olosuhteet ovat ainutlaatuisia haasteita, jotka liittyvät H. pylori
hoitoon, koska nämä bakteerit mahassa ovat suojassa happamassa ympäristössä, jonka paksua limaa kerroksen ja tehokkuutta monien mikrobilääkkeiden on suuresti vähentynyt happamassa [31]. Näin ollen ensimmäinen tehokas hoito helikobakteeri
infektio oli yhdistelmä suhteellisen pH-herkkä mikrobilääkkeiden kuten vismuttia, tetrasykliini ja metronidatsoli [33]. Lisäksi kuten mahalaukun määräajoin tyhjentää sisältönsä (paikalliseen hoitoon yleensä laimentaa ja pestä pois) havainto, että CSA-13 on bakterisidinen aktiivisuus paljon alhaisempi pitoisuus sitten LL-37, kun samaan inkubointiajan (3-6 tuntia) [11], viittaavat siihen, että CSA-13 voi olla terapeuttista potentiaalia hoidettaessa H. pylori
infektio. Antibakteerinen aktiivisuus CSA-13, joka on pienempi nettovaraus ja ainutlaatuinen jakelu tämän maksun yli steroidi telineen verrattuna LL-37 ja WLBU2 peptidejä, havaittiin myös olevan vähemmän inhiboi musiini eristettiin mahan limakalvon. Terapeuttinen potentiaali perustuu kykyyn CSA-13 hävittämiseksi H. pylori
tukevat myös aiemmin raportoitu antibakteerinen vaikutus muiden bakteerien kantoja, mukaan lukien kliinisiä isolaatteja Pseudomonas aeruginosa
[21] ja S. aureus
[22]. CSA-13: n ainutlaatuinen kyky tehdä kompromisseja bakteerimembraania eheys ja kemiallisen luonteen tämän pienen molekyylipainon massa yhdiste, joka muuntaa alentamaan kustannuksia synteesin verrattuna kationisen antibakteerisia peptidejä, viittaavat siihen, että CSA-13 tai ehkä muitakin ceragenins on potentiaalia hoidettaessa H. pylori
infektio, mukaan lukien aiheuttanut sen resistentit kannat.
Päätelmä
bakterisidinen ceragenin CSA-13 pidetään esi-inkuboinnin jälkeen simuloidussa mahanesteessä ja läsnä ollessa musiinia. Tämä in vitro
arvioinnissa todetaan merkittävä potentiaali tämän molekyylin hoidossa mahalaukun limakalvon infektio. Tool Menetelmät
Bakteerilääkkeiden
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) ja WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) peptidit hankittiin Bachem (king of Prussia, PA). CSA-13 valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [34]. Amoksisilliini (AMX), klaritromysiini (CLR), tetrasykliiniä (TET) ja metronidatsolin hankittiin Sigmalta.
Kokoelma mahalaukun limakalvon ja sappi näytteet
aikana gastroskopialla, käyttää joko GIF V2 tai Q145 (Olympus) gastroscope, useita mahalaukun limakalvon siivuja otettiin prepyloric ja corpus alueilla vatsaan. Helikobakteeri
infektio perustettiin biopsianäytteistä käyttäen ureaasin testi (CLO-testi). Ihmisen sappea saatiin sappirakon olevia potilaita kolekystektomia. Näytteet suodatinsteriloitua 0,45 um kalvon ennen kuin se laimennettiin PBS: ään (1: 1) ja sekoitettiin antibakteerisia aineita, joita käytetään bakteerien tappaminen määrityksissä. Tutkimukset hyväksyi Medical University of Bialystok eettinen komitea tutkimus- ihmisissä ja eläimet, ja kaikki potilaat antoivat tietoisen kirjallisen suostumuksensa tutkimukseen osallistumisesta.
Immunohistokemialliset tutkimukset
immunohistokemialliset tutkimukset tehtiin formaliinilla kiinnitetyt, paraffiini- upotettu ihmisen mahalaukun limakalvon osiin käyttäen kanin anti-LL-37-vasta-ainetta (H-075-06, käytettiin 1: 100 laimennos, Phoenix Pharamceuticals Inc.). Parafinoidut materiaalit leikattiin 5 um paksuus ja kellumaan tislattua vettä 45 ° C: ssa. Sitten leikkeitä kiinnitetty dioja ja sijoitettiin 57 ° C uuniin yön yli. Osat poistettiin parafiini standardimenetelmien mukaisesti ja sammutettiin 0,9% vetyperoksidia metanolissa 30 minuuttia. Leikkeet inkuboitiin primaarisen vasta-aineen 37 ° C: ssa 60 minuutin ajan, pestiin 1% PBSA (1% BSA PBS: ssä), ja sille suoritettiin sitomalla sekundaarista vasta-ainetta (vuohen biotinyloitua anti-kani IgG: tä, 1: 400 laimennos). Monistaminen suoritettiin Vectastain ABC-kitti, ja HRP havaitsemisjärjestelmä käytettiin colocalize peroksidaasin kanssa DAB-substraatti. Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Näytteet suhtautua Nikon Eclipse 80 mikroskoopin alle 40-kertainen suurennus.
Arviointi MIC ja MBC
minimaalinen estävä pitoisuus (MIC) tavanomaisille antibiooteille seitsemää eri kliinisiä isolaatteja H.pylorin
(9 × 10 8 CFU /ml) määritettiin käyttäen Muller-Hinton agar (MH), joka sisälsi 5% lampaan verta. Inkubaatiota jatkettiin 4 päivän ajan 35 ° C: ssa mikroaerofiilisissä olosuhteissa ylläpidetään käyttämällä Gas Pack-Campylobacter kaasuntuotto- kit BR60. Kliiniset isolaatit Helikobakteeri
pidettiin bakteerikantaa antibioottien MIC-arvot olivat yli 4 ug /ml AMX, 1 ug /ml CLR ja 16 ug /ml TET ja metronidatsoli. Pienimmät bakterisidiset pitoisuus (MBC) Bakteerilääkkeiden arvioitiin käyttämällä ymppiä 10 8 CFU /ml. Sen jälkeen 6 tunnin inkubaation jälkeen 37 ° C: ssa, 10 ul: n suspensiot täpliksi Columbia agarilla, johon lampaan verta (5%).
Bakteerit tappomääritys
bakterisidinen toimintaa LL-37, WLBU2 peptidit ja ceragenin CSA-13 E. colia vastaan ​​
MG1655 läsnäollessa limaa tai pepsiiniä sian limaa (Sigma) ja ihmisen sapessa mitattiin, kuten aiemmin on kuvattu [35]. Bakteerit kasvatettiin mid-log-vaiheeseen lämpötilassa 37 ° C (ohjataan arviointi optinen tiheys 600 nm: ssä) ja suspendoitiin uudelleen PBS-puskurissa (pH = 7,4). Bakteerit suspensiot laimennettiin sitten 10 kertaa 100 ui liuoksia, jotka sisälsivät antibakteerisia aineita itse tai mukiinia (1000 ug /ml), tai sappeen (lopullinen 01:10 sapen laimennuksen jäljittelee ympäristöä ohutsuolen yläosassa, johon sappi erittyy [36] (pH = 7,4)). Toisessa koesarjassa antibakteerivaikutukseen näiden komponenttien määritettiin seuraavat heidän esi-inkubointi simuloidussa mahanesteessä [36, 37] pH ~ 1,5 ja ilman pepsiiniä (0,5 mg /ml). Kun oli inkuboitu bakteereiden kanssa antibakteerinen molekyylien yhden tunnin ajan 37 ° C: ssa, bakteeri-suspensioita sijoitettiin jäille ja laimennettiin 10- 1000- kertaiseksi. Alikvootit kutakin laimennosta (10 ui) täplitettiin LB-agar-levyillä yli yön viljelmää 37 ° C: ssa. Pesäkkeiden lukumäärä jokaisessa laimennuksessa laskettiin seuraavana aamuna. Pesäkkeitä muodostavaa yksikköä (CFU /ml) yksittäisistä näytteistä määritettiin laimennuskerroin.
Massaspektrometria
Analyyttinen karakterisointi suoritettiin CSA-13 ja LL-37 suspensiot jälkeen 3H inkuboinnin pepsiinillä (0,5 mg /ml) alhaisessa pH: ssa (~ 1,5) 37 ° C: ssa, käyttäen Shimadzu (Columbia, MD) väline (LC-MS-järjestelmä koostui LC-20AB liuottimen annostelujärjestelmä ja SIL-20A automaattinen näytteenottolaite, joka on kytketty dual aallonpituus UV-Vis-detektori ja LCMS 2010EV yhden kvadrupolin massaspektrometri), joka on kytketty Shimadzu Premier C18 (150 mm x 4,6 mm id, 5 um partikkelikoko). Liikkuvan faasin virtausnopeus oli 1 ml /min, jossa lähtöaineena suhde 90% liikkuvaa faasia A (vesi) ja 10% liikkuvaa faasia B (asetonitriili), sekä 0,1% (v /v) muurahaishappoa. Analyysimenetelmä koostui seuraavista vaiheista: (i) näytteen injektion ja pitämällä 10% B 5 min, (ii) lineaarinen gradientti 10%: sta 90% B: tä 15 minuutin ajan, (iii), jolla on 90% B 5 minuuttia, (iv) isokraattinen vaihe 10% B ja pitämällä 5 minuuttia ennen seuraavaa näytettä injektion. Massaspektrometria suoritettiin eluentti käyttäen sähkösumutusionisaatiota (ESI) positiivisessa ionimuodossa skannattu m /z-alue 160-2000.
Punasolujen hajoamista
hemolyyttinen aktiivisuus LL-37, WLBU-2 ja CSA-13 (0-200 μ
g /ml), ihmisen punasoluja (RBC) testattiin käyttämällä punasolujen suspendoitiin PBS: ään. RBC valmistettu tuoreesta verestä (Hematokriitti ~ 5%), inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa lisäämisen jälkeen testin molekyylejä. Suhteellinen hemoglobiinin supernatanteissa sen jälkeen, kun oli sentrifugoitu 2000 x g seurattiin mittaamalla absorbanssi 540 nm: ssä. 100% hemolyysin otettiin näytteitä joista 2% Triton X-100 lisättiin.
Soluviljely
Ihmisen mahalaukun adenokarsinooman-solut (ATCC, CRL-1739) pidettiin DMEM: ssä (BioWhittaker) kulttuuri täydennetty 10% lämmöllä -inactivated naudan sikiön seerumia (Hyclone), 37 ° C: ssa ja 5% CO 2. LDH vapautumisen määrityksellä ja mikroskooppia arviointi solut maljattiin 24-kuoppalevyille ja kasvatettiin täysiksi. Kaikissa kokeissa, väliaine vaihdettiin ja seerumittomassa alustassa ~ 12 h ennen solujen käsittelyä, jossa LL-37, WLBU2 ja CSA-13 (0-200 ug /ml), yksittäisissä kuopissa 1 tunnin ajan. Soluviljelyelatusainetta kerättiin sitten, sentrifugoitiin (10 min, 5000 rpm, RT) ja alistettiin LDH arviointi (LDH-sytotoksisuus Assay Kit; BioVision Inc.) B-ilmoitukset
Kiitokset
työtä tukivat NIH myöntää HL067286 ja Medical University of Bialystok myöntää 3-22458F ja 3-18714L
kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkkejä kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 12866_2009_858_MOESM1_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 12866_2009_858_MOESM2_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 12866_2009_858_MOESM3_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 12866_2009_858_MOESM4_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 4 12866_2009_858_MOESM5_ESM.pdf Kirjoittajien alkuperäisen tiedoston luku 5 Kilpailevat edut
Dr P. Savage on maksettu konsultti Ceragenix Pharmaceuticals, synnynnäisen immuniteetin Inc., ja WittyCell. Yksikään tutkimuksen raportoitu tässä asiakirjassa tukivat Ceragenix Pharmaceuticals tai muulla yritystoimija. Muut kirjoittajat: none julistaa.

• Arviointi kulkua Lactobacillus gasseri K7 ja bifidobakteerien mahasta suolistossa yhdellä reaktorimalli
• Balloon-tukittiin perääntyminen transvenous obliteration mahalaukun laskimolaajentumia: suhde kliinisen tuloksen ja gastrorenal shuntti occlusion