La actividad bactericida del esteroide catiónico CSA-13 y el péptido catelicidina LL-37 contra el Helicobacter pylori en el jugo gástrico simulado

La actividad bactericida del esteroide catiónico CSA-13 y el péptido catelicidina LL-37 contra el Helicobacter pylori
en jugo gástrico simulado
Resumen Antecedentes
Francia El aspecto mundial de cepas resistentes a los medicamentos de H. pylori
motiva la búsqueda de nuevos agentes con potencial terapéutico contra esta familia de bacterias que coloniza el estómago, y se asocia con el desarrollo de adenocarcinoma. Este estudio fue diseñado para evaluar in vitro of the anti-H. pylori
potencial de catelicidina LL-37 péptido, que está naturalmente presente en el jugo gástrico, su optimizado WLBU2 análogo sintético, y el agente antibacteriano no peptídico ceragenin Resultados CSA-13.
acuerdo con estudios previos , no se observó aumento de la expresión de hCAP-18 /LL-37 en la mucosa gástrica obtenida a partir de H. pylori sujetos infectados
. (CBM valores mínimos de concentración bactericida) determinaron en el rango medio que contiene nutrientes, desde 100-800 mg /ml para LL-37, 17,8 a 142 mg /ml para WLBU2 y 0.275-8.9 g /ml para ceragenin CSA-13. Estos datos indican actividad antibacteriana sustanciales, pero muy diferentes en contra de los aislados clínicos de H. pylori
. Después de la incubación en jugo gástrico simulado (pH bajo con presencia de pepsina) CSA-13, pero no LL-37 o WLBU2, retenido actividad antibacteriana. En comparación con LL-37 y WLBU2 péptidos, actividad CSA-13 fue también más resistente a la inhibición por mucinas gástricas aisladas de acogida.
Conclusión
Estos datos indican que a base de ácido cólico agentes antimicrobianos tales como CSA-13 resisten la degradación proteolítica y la inhibición de la mucina y tiene potencial para el tratamiento de infecciones por H. pylori
, incluyendo las causadas por las cepas claritromicina y /o resistentes al metronidazol.
Antecedentes
Helicobacter pylori
se lleva más de la mitad de la población adulta del mundo [1]. Se puede colonizar crónicamente la mucosa gástrica humana, en el que se encuentra en la capa de moco y se adhiere a las células epiteliales [2]. Aunque la mayoría de los sujetos infectados permanecen asintomáticos, la infección con H. pylori
puede promover severa gastritis [3] y aumentar significativamente el riesgo de neoplasias gástricas [4, 5]. En algunos estudios epidemiológicos, H. pylori
erradicación ha demostrado ser eficaz en la prevención del cáncer gástrico [6, 7]. Además, se encontró H. pylori
erradicación para disminuir la incidencia y la gravedad de las lesiones con potencial carcinogénico en modelos animales [8, 9]. mecanismos naturales que protegen al huésped de las infecciones por H. pylori
dependen de la función del sistema de defensa innata en el que los péptidos antibacterianos tales como catelicidina LL-37 [10, 11] y O-glicanos en mucina gástrica [12] juegan un papel clave.
LL-37 es un péptido proteolíticamente procesados ​​derivado del dominio C-terminal de catelicidina humana (hCAP-18 /LL-37) que se libera de forma constitutiva en el espacio extracelular por granulocitos fagocíticas y células epiteliales [13] . Funciones atribuidas a LL-37 incluyen la prevención del crecimiento bacteriano [14], la neutralización de la bioactividad bacteriana molécula de pared [15], y la activación de las células huésped por receptores de membrana celular específicos [16-18] de unión. H. pylori
regula al alza la producción de LL-37 /hCAP18 por el epitelio gástrico, lo que sugiere que catelicidina o sus derivados LL-37 contribuye a determinar el equilibrio entre la defensa de la mucosa de acogida y H. pylori
mecanismos de supervivencia que rigen crónica la infección con este patógeno gástrico [10, 11].
péptidos antibacterianos catiónicos (CAP), incluyendo LL-37 han sido ampliamente investigados como una fuente potencial de nuevas moléculas antibacterianas. El péptido WLBU2 ingeniería cuyos residuos están dispuestos para formar una estructura helicoidal anfipática con carga óptima y la densidad hidrófobo, supera algunas limitaciones de LL-37 natural como la sensibilidad a Mg 2 + o Ca 2 + y la inactivación por la sangre suero [19]. Por lo tanto WLBU2 podían tratar infecciones donde LL-37 es ineficaz. Con el fin de generar moléculas capaces de imitar la capacidad CAP 'comprometer la integridad de la membrana bacteriana, ceragenins no peptídicos con catiónico, se desarrollaron estructuras facialmente anfifílicos característicos de la mayoría de péptidos antimicrobianos. Ceragenins como CSA-13 reproducen la morfología de la PAC requiere el uso de un andamio de ácidos biliares y grupos amina adjuntas [20]. Son bactericida contra ambos organismos Gram-positivas y Gram-negativas, incluyendo bacterias resistentes a los fármacos tales como clínicamente resistentes a la meticilina Staphylococcus aureus gratis (SARM) correspondiente, y un estudio de la susceptibilidad anterior demostrado que la CSA-13 tiene una MIC 50 /MBC 50 proporción de 1 [21, 22]. En este estudio se compara la potencia bactericida de LL-37, WLBU2 y CSA-13 frente a aislados clínicos de H. pylori
. Los resultados sugieren que imita a base de ácido cólico de péptidos antimicrobianos tales como CSA-13 tienen un potencial para el tratamiento de la infección por H. pylori
, incluyendo las causadas por las cepas claritromicina y /o resistentes al metronidazol
. Resultados
inmunohistoquímico de sondeo de secciones de mucosa gástrica humana con anti-hCAP-18 /LL-37 anticuerpo
imágenes microscópicas de biopsias de la mucosa después de la evaluación inmunohistoquímica con anticuerpos anti-hCAP-18 anticuerpo /LL-37 se muestran en la Figura 1. El DAB- tinción positiva indica la presencia del péptido LL-37 y /o su proteína parental hCAP-18. Alta intensidad de la tinción DAB (indicado por el color marrón) en las células epiteliales productoras de moco y las glándulas fúndica indica una alta acumulación de péptido hCAP-18 /LL-37 más probable es conducido por LL-37 interacción específica con mucina, que fue reportado en estudios previos [23, 24]. La distribución de hCAP-18 /LL-37 en la población de células epiteliales más diferenciado de la mucosa gástrica se diferencia de la que se encuentra para la β-defensin 2 [10] o la lisozima humana [25], pero es similar a la observada en el colon [26 ]. biopsias de la mucosa gástrica de pacientes infectados con H. pylori
muestran mayor intensidad de la tinción DAB en comparación con los obtenidos a partir de sujetos no infectados. De acuerdo con informes anteriores, este resultado indica una respuesta de defensa del huésped contra H. pylori
[11], que se basa en parte en el aumento de expresión de hCAP-18 /LL-37 por las células epiteliales gástricas. Figura 1 La presencia de péptido hCAP-18 /LL-37 en biopsias de la mucosa del estómago humano se detectó usando el análisis inmunohistoquímico con anticuerpos monoclonales frente a la PAC-18 humana /LL-37. Las muestras A /B y C /D representan las muestras obtenidas de sujetos infectados no infectados por H. pylori y
respectivamente. Los datos mostrados son representativos de cinco experimentos.
La actividad bactericida de LL-37, WLBU-2 péptidos y ceragenin CSA-13 contra diferentes cepas de H. pylori
para identificar las cepas resistentes a los aislados clínicos de H. pylori
fueron sometidos a evaluación MIC (Tabla 1) con varios antibióticos usados ​​actualmente en el tratamiento clínico de H. pylori
infección. Entre siete aislados ensayados obtenidos a partir de diferentes materias, la cepa 4 era resistente a metronidazol y cepas 5, 6, 7 fueron resistentes tanto a metronidazol y claritromicina. Todas las cepas fueron sensibles a la amoxicilina y la tetraciclina. De acuerdo con informes anteriores sobre los efectos de HBD-1, H-BD-2 y LL-37 péptidos contra H. pylori
[10, 11] todas las cepas aisladas de H. pylori
murieron después de 6 horas de incubación con LL-37, WLBU2 y CSA-13 con MBC promedio (g /ml) valores 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 y 0,31 ± 0,25 cuando MBC se evaluó en tampón HEPES, o 300 ± 232, 53 ± 41 y 2,98 ± 3,11 cuando MBC se evaluó en Brucella Broth lingotes respectivamente (Figura 2). Evaluación de los valores de MBC en tampón HEPES con la adición de MgCl 2 mM 2 para H. pylori ATCC 43504
reveló un incremento de ocho veces para LL-37, y un aumento de cuatro veces tanto para WLBU2 y CSA-13 (datos no mostrar). Figura 2 La actividad bactericida frente a H. pylori. concentración bactericida mínima (CBM) de LL-37 (columna blanca), WLBU2 (columna gris) y CSA-13 (columna negro) contra H. pylori gratis (ATCC 43504 y la cepa siete aislados clínicos obtenidos a partir de muestras de la mucosa de las diferentes materias ) evaluado en HEPES (panel a) o Brucella Broth Bulion (panel B). MBC indica concentraciones a las que los compuestos erradicar por completo un inóculo de H. pylori
.
Tabla 1 Evaluación de sensibilidad de las cepas clínicas de H. pylori a los antibióticos
.
H. pylori cepas


antibióticos
AMX
CLR
TET
metronidazol
ATCC 43504
0,016 0,094

0,25
64.0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ® página 5
0.25
64.0 ®
1.0
96,0 ® página 6
0,032
1.5 ®
1.5
32.0 ® página 7
0,047
1.5 ® 2.0

48.0 ®
valores de CIM (g /ml) (AMX-amoxicilina, claritromicina-CLR, TET-tetraciclina)
la actividad antibacteriana de LL-37, WLBU2 y CSA-13 después de la pre-incubación a pH bajo con pepsina o mucina
Además de la inhibición conocida de CAP actividad antibacteriana por cationes divalentes tales como Mg 2 + y Ca 2 +, la actividad proteolítica de pepsina también puede comprometer la función CAP en el entorno de jugo gástrico con la presencia de mucinas, y bajo pH. Para hacer frente a esta posibilidad se evaluó la actividad antibacteriana contra Escherichia coli MG1655
después de 3 horas de preincubación de LL-37, WLBU2 y CSA-13 en el jugo gástrico simulado en comparación con la actividad después de su pre-incubación en PBS a pH 7,4 . Antes de realizar el ensayo de matanza, el pH de las muestras con pH bajo y bajo pH /pepsina se ajustó a 7,4. La actividad antibacteriana de los péptidos LL-37 y WLBU2 contra E. coli MG1655
no cambió significativamente después de la pre-incubación a pH ~ 1.5, pero se perdió después de la pre-incubación a pH ~ 1,5 en presencia de pepsina (Figura 3A y 3B). Por el contrario, la actividad antibacteriana de CSA-13 se mantuvo sin cambios por la pre-incubación a pH ~ 1,5 con o sin pepsina (Figura 3C). Por otra parte, las actividades bactericidas de todos los componentes fueron comprometidos en diversos grados cuando se ensaya usando un ensayo de destrucción bacteriana en presencia de mucina gástrica purificada. En estrecha concordancia con los resultados obtenidos de este estudio de E. coli MG1655
, CBM valores de LL-37 péptido evaluado después de 1H pre-incubación con tampón a pH bajo que contiene pepsina o mucina se aumentó, pero los de CSA-13 eran casi sin cambios (Figura 3D). Todos los agentes evaluados perdieron actividad antibacteriana en PBS suplementado con bilis humana al 10% (una concentración que no interfiera con E. coli MG1655
crecimiento - datos no mostrados). Este resultado sugiere que las propiedades físico-químicas de las moléculas antibacterianas promueven su inserción en las lipoproteínas de la bilis, lo que limita su interacción con la pared bacteriana. No ha habido ningún estudio para evaluar la actividad antibacteriana de los casquillos en jugo duodenal, pero estos resultados indican que el reflujo de bilis hacia el estómago puede interferir con la actividad de CAP. Figura 3 Actividad antibacteriana contra E. coli MG1655 y H. pylori cepa ATCC 43504. La actividad antibacteriana de LL-37 (panel A), WLBU2 (panel B) y CSA-13 (panel C) contra E. coli MG1655
después de pre-incubación (3 horas a 37 ° C) en PBS (círculos abiertos), el jugo gástrico simulado a pH ~ 1,5 (cuadrados), jugo gástrico simulado con pepsina (diamantes), jugo gástrico simulado con mucina (triángulos) y PBS con humana biliar (10%) obtenido a partir de la vesícula biliar (círculo relleno). Los datos mostrados son la media ± SD de tres a cuatro experimentos. MBC de LL-37 (columna blanca) y CSA-13 (columna negro) (panel D) contra H. pylori
(ATCC 43504) después de la pre-incubación (1 h a 37 ° C) en el jugo gástrico simulado a pH ~ 1,5 (a), jugo gástrico simulado con pepsina (B) y en presencia de mucina (C)
Analytical caracterización de LL-37 y CSA-13 después de la incubación con pepsina
análisis de espectrometría de masas (Figura 4) revela que tres horas de incubación con resultados pepsina en una extensa degradación de LL-37. Sin embargo, a pH bajo, la digestión de la pepsina es altamente específico y LL-37 escisión del péptido se limita al sitio con aminoácidos hidrófobos. Los sitios potenciales de escisión predichos por PeptideCutter software de caracterización http:.. //KR ExPASy org /herramientas /peptidecutter /, sugieren que LL-37 de la digestión con pepsina en nuestras condiciones experimentales debe liberar 11 productos, entre ellos 3 péptidos cortos (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD y LVPRTES). Estas predicciones son consistentes con el análisis de espectro de masas, que no muestra la presencia de cualquier intacta LL-37 restante después de la incubación con pepsina a pH bajo, pero que revela la aparición de múltiples nuevos picos con tiempos de retención diferentes. La actividad antibacteriana restante de LL-37 después del tratamiento con pepsina (Figura 3A y 3D) en los ensayos de matanza probablemente representa la actividad residual de estos LL-37 fragmentos. Contrariamente a la degradación observada de LL-37, CSA-13 caracterización analítica no se cambió después de la incubación con pepsina a pH bajo. Figura 4 análisis de espectrometría de masas. análisis de espectrometría de masas de LL-37 (panel A) y CSA-13 (panel B) en PBS (curva 1) tampón de bajo pH (curva 2) y tampón de pH bajo con presencia de pepsina (curva 3). El cromatograma de iones totales (TIC) se presenta para cada condición de la muestra con una inserción relación masa-carga (m /z) espectros que muestra la intensidad de los picos de TIC en caja. El peso molecular de LL-37 intacta es 4494, que se puede observar con múltiples cargas (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 MW = 900, etc) en el modo de iones positivos. El peso molecular de CSA13 es 678, que puede ser observado directamente y con múltiples cargas. se muestran los datos de un experimento.
Toxicidad de LL-37, WLBU2 y CSA-13 en contra de glóbulos rojos y células de adenocarcinoma humano
inserción no específica de los péptidos antibacterianos y sus imitadores en las membranas de la célula huésped puede causar toxicidad. Host permeabilización de la membrana celular se puede medir mediante la liberación de proteínas tales como hemoglobina y LDH desde el citosol al espacio extracelular. Mediante la evaluación de la hemoglobina y la liberación de LDH (Figura 5A y 5B), que no muestran permeabilización de la membrana significativa por cualquier moléculas ensayadas en el rango en el que tienen actividad bactericida en tampones salinos (Figura 2, Figura 3). Este hallazgo fue confirmado por evaluación microscópica de la morfología celular de adenocarcinoma muestra ninguna diferencia visible entre las células de control y los tratados con 10 mg /ml LL-37, WLBU2 o CSA-13 (Figura 5C). Sin embargo, un aumento en la liberación de hemoglobina y LDH se observó con una concentración creciente. Entre las tres moléculas ensayadas, WLBU2 fue el agente hemolítico más fuerte, pero todos ellos mostró capacidad similar para poner en peligro la integridad de membrana de células de adenocarcinoma (Figura 5B y 5C). CSA-13 concentraciones bactericidas contra H. pylori
y E. coli MG1655
(Figuras 2A, 2B y 3C) evaluado en solución salina, así como tampón de nutriente que contiene estaban debajo de su concentración hemolítica mínima y por debajo de concentraciones que causan la disfunción de adenocarcinoma membranas celulares. Figura 5 Evaluación de la toxicidad celular. La hemoglobina y LDH liberación de las células rojas de la sangre humanas y células de adenocarcinoma gástrico humano (panel A y B, respectivamente) después de la adición de LL-37 (círculos), WLBU2 (diamantes), y CSA-13 (triángulos), seguido de incubación durante 1 h a 37 ° C. Los datos mostrados son la media ± SD de tres experimentos. Morfología de las células humanas de adenocarcinoma gástrico antes (control) y después de LL-37, WLBU2 y tratamiento CSA-13 se evaluó mediante microscopía de contraste de fases (panel C). Se muestran datos de un experimento representativo. Otros dos experimentos revelaron resultados similares.
Discusión
La tasa de éxito del tratamiento de H. pylori
infección de estómago, logrado con terapias de combinación de dos antibióticos y un inhibidor de la bomba de protones ha disminuido de más del 90% a aproximadamente 80 % durante la última década [27]. Además, el coste de esta terapia es significativa, y por lo tanto una necesidad de medios más ampliamente disponibles de tratamiento o prevención de H. pylori
infección todavía existe [28]. Los nuevos agentes para el tratamiento de las infecciones de H. pylori
también son necesarias debido al aumento de los problemas de resistencia a fármacos causadas por el uso extensivo de antibióticos [29] y los mecanismos de supervivencia de adaptación de las bacterias patógenas para contrarrestar los antimicrobianos utilizados en la actualidad. Por ejemplo, se ha informado de H. pylori
cepas resistentes a la amoxicilina, metronidazol y claritromicina [30, 31]. Métodos para mejorar los tratamientos para H. pylori
podría guiar por profundizar en los mecanismos naturales infectadas por el cual los pacientes responden a esta bacteria y los motivos por los mecanismos normales de defensa del huésped fallan.
Este estudio confirma un informe anterior de aumento de la expresión hCAP-18 /LL-37 en la mucosa gástrica de pacientes infectados con H. pylori
[11]. Este hallazgo sugiere que el aumento de la producción del péptido bactericida LL-37 puede jugar un papel clave en la defensa del huésped frente a H. pylori
[11]. Sin embargo, esta respuesta bactericida en algunos sujetos es insuficiente y la infección por H. pylori
todavía puede llegar a una etapa crónica. La falta de la función bactericida de LL-37 en esta configuración se ha sugerido que el aumento de expresión de péptido hCAP-18 /LL-37 en el moco gástrico de los sujetos infectados pueden tener funciones adicionales como un agente estimulador de anti-inflamatoria y crecimiento. De hecho, se ha demostrado recientemente que la curación de úlceras gástricas en ratas es promovido por la transactivación catelicidina mediada por los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) a través del factor de crecimiento transformante alfa (TGF?) Vía de señalización [32]. Alternativamente, la pérdida de defensa contra H. pylori
puede ser debido a la pérdida de la función antibacteriana de LL-37 en el medio de la mucosa gástrica. En consecuencia, el diseño de los agentes antimicrobianos que son más eficaces en este contexto puede ser beneficioso.
Motivados por los resultados inmunohistoquímico, la actividad de LL-37 frente a aislados clínicos de H. pylori
y E. coli MG1655 bajo
biológicamente condiciones pertinentes se comparó con la de la WLBU2 péptido sintético y el ceragenin CSA-13. Este estudio muestra que CSA-13, en contra de los péptidos WLBU2 LL-37 y, mantiene una fuerte actividad bactericida en presencia de mucina y después de la preincubación con pepsina a pH bajo. Estas condiciones representan desafíos únicos relacionados con H. pylori
tratamiento, ya que estas bacterias en el estómago están protegidos del entorno ácido por una capa de moco espeso y la eficacia de muchos fármacos antimicrobianos disminuye en gran medida a pH ácido [31]. En consecuencia, la primera terapia eficaz para la infección por H. pylori
era una combinación de medicamentos antimicrobianos relativamente insensible al pH, tales como bismuto, tetraciclina y metronidazol [33]. Además, como el estómago se vacía periódicamente su contenido (la terapia tópica tiende a ser diluido y lavado) el hallazgo de que CSA-13 tiene una actividad bactericida a mucho menor concentración entonces LL-37, después del mismo tiempo de incubación (3-6 horas) [11], sugiere que los CSA-13 puede tener un potencial terapéutico para el tratamiento de H. pylori
infección. La actividad antibacteriana de CSA-13, que tiene una carga neta más pequeño y una distribución única de esta carga sobre un andamio de esteroides en comparación con LL-37 y WLBU2 péptidos, también se encontró que era menos inhibida por mucina aislado de mucosa gástrica. potencial terapéutico basado en la capacidad de CSA-13 para erradicar H. pylori
también es apoyado por informado anteriormente la actividad antibacteriana frente a otras cepas de bacterias, incluyendo aislados clínicos de Pseudomonas aeruginosa
[21] y S. aureus
[22]. La capacidad única de CSA-13 comprometer la integridad de la membrana bacteriana y la naturaleza química de este compuesto de bajo peso molecular en masa que se traduce en un menor coste de la síntesis en comparación con los péptidos antibacterianos catiónicos sugerir que CSA-13 o tal vez otros ceragenins tienen potencial para el tratamiento de H. pylori
infección, incluyendo las causadas por sus cepas resistentes.
Conclusión
actividad bactericida de ceragenin CSA-13 se mantiene después de la preincubación en jugo gástrico simulado y en presencia de mucina. Esta evaluación in vitro
indica un potencial significativo de esta molécula en el tratamiento de la infección de la mucosa del estómago.
Métodos
agentes antibacterianos
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) y WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) péptidos se adquirieron en Bachem (king of Prussia, PA). CSA-13 se preparó como se describe anteriormente [34]. Amoxicilina (AMX), claritromicina (CLR), tetraciclina (TET) y metronidazol se adquirieron de Sigma.
Recogida de muestras de la mucosa y biliares gástricas
Durante gastroscopia, realizada ya sea con un V2 GIF o Q145 gastroscopio (Olympus), varias rebanadas de la mucosa gástrica se tomaron de las regiones prepilórica y del cuerpo del estómago. H. pylori
la infección se estableció en las muestras de biopsia utilizando una prueba de ureasa (CLO-test). bilis humana se obtuvo de la vesícula biliar de los pacientes sometidos a colecistectomía. Las muestras se esterilizaron-filtro a través de una membrana de 0,45 micras antes de ser diluido en PBS (1: 1) y se mezcla con agentes antibacterianos utilizados en la eliminación de bacterias ensayos. Los estudios fueron aprobados por la Universidad de Medicina de la Comisión de Ética para la Investigación sobre Bialystok seres humanos y animales, y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio.
Estudios inmunohistoquímicos
se realizaron estudios inmunohistoquímicos en fijado en formol e parafina incrustados humanos secciones mucosa gástrica utilizando un anti-LL-37 anticuerpo de conejo (H-075 a 06, que se utiliza en dilución 1: 100; Phoenix Pharamceuticals Inc.). materiales incluidos en parafina se seccionaron a 5 micras de espesor y flotaban en el agua destilada a 45 ° C. Las secciones fueron montadas en portaobjetos y se colocaron en 57 ° C horno durante la noche. Las secciones se desparafinaron acuerdo con procedimientos estándar y se inactivó con peróxido de hidrógeno 0,9% en metanol durante 30 minutos. Las secciones se incubaron con anticuerpo primario a 37 ° C durante 60 minutos, se lavó con 1% PBSA (BSA 1% en PBS), y se someten a la unión con el anticuerpo secundario (IgG de cabra biotinilado anti-conejo, dilución 1: 400). La amplificación se realizó con un kit Vectastain ABC, y un sistema de detección de HRP se utilizó para colocalize actividad de la peroxidasa con un sustrato de DAB. Las secciones se counterstained con hematoxilina. Las muestras fueron vistos con un microscopio Nikon Eclipse 80 bajo 40 aumentos.
Evaluación de MIC y MBC México La concentración inhibitoria mínima (CIM) de los antibióticos convencionales contra siete cepas clínicas diferentes de H. pylori gratis (9 × 10 8 CFU /ml) se determinó usando agar Muller-Hinton (MH) que contiene 5% de sangre de oveja. La incubación se continuó durante 4 días a 35 ° C en condiciones microaerófilas mantenidas con el uso de un generador de gas BR60 kit Gas Pack-Campylobacter. Los aislados clínicos de H. pylori
se consideraron resistentes a los antibióticos respectivos, cuando los valores de MIC fueron superiores a 4 mg /ml de AMX, 1 mg /ml para CLR y 16 mg /ml para TET y metronidazol. Se evaluó la concentración bactericida mínima (CBM) de los agentes antibacterianos utilizando un inóculo al 10 8 CFU /ml. Después de una incubación de 6 horas a 37 ° C, 10 ml de alícuotas de las suspensiones fueron vistos en agar Columbia suplementado con sangre de carnero (5%).
Matar las bacterias de ensayo
Las actividades bactericidas de LL-37, péptidos WLBU2 y ceragenin CSA-13 contra E. coli MG1655
en presencia de mucina o pepsina de mucosa porcina (Sigma) y la bilis humana se midió como se describe anteriormente [35]. Las bacterias se cultivaron hasta la fase semilogarítmica a 37 ° C (controlado por la evaluación de la densidad óptica a 600 nm) y se resuspendieron en tampón PBS (pH = 7,4). Las suspensiones de bacterias se diluyeron 10 veces en 100 l de soluciones que contienen agentes antibacterianos por sí mismos o con mucina (1,000 g /ml), o la bilis (los últimos 01:10 biliares dilución imita el entorno del intestino delgado superior en el que la bilis es secretada [36] (pH = 7,4)). En otra serie de experimentos se determinó la actividad antibacteriana de estos componentes tras su preincubación en jugo gástrico simulado [36, 37] a pH ~ 1,5 con y sin pepsina (0,5 mg /ml). Después de incubar las bacterias con moléculas antibacterianas para una hora a 37 ° C, las suspensiones bacterianas se colocaron en hielo y se diluyeron de 10 a 1000- veces. Las alícuotas de cada dilución (10 l) fueron vistos en placas de LB agar para el cultivo durante la noche a 37 ° C. El número de colonias en cada dilución se contaron a la mañana siguiente. Las unidades formadoras de colonias (CFU /ml) de las muestras individuales se determinaron a partir del factor de dilución.
Espectrometría de masas
Caracterización analítica se realizó en las suspensiones de CSA-13 y LL-37 después de la incubación con pepsina 3H (0,5 mg /ml) a pH bajo (~ 1,5) a 37 ° C, utilizando el Shimadzu (Columbia, MD) instrumento (el sistema de LC-MS consistía en un sistema de suministro de disolvente LC-20AB y SIL-20A muestreador automático acoplado a doble longitud de onda del detector UV-Vis y un espectrómetro de masas de cuadrupolo único CLEM 2010EV), acoplado a una columna Shimadzu Premier C18 (150 mm x 4,6 mm de diámetro, el tamaño de partícula de 5 micras). El caudal de la fase móvil fue de 1 ml /min con una relación inicial de fase móvil A (agua) 90% y 10% B fase móvil (acetonitrilo), ambos con 0,1% (v /v) de ácido fórmico. El método analítico consistió en las siguientes etapas: (i) inyección de la muestra y mantenimiento a 10% de B durante 5 min, (ii) gradiente lineal de 10% a 90% de B durante 15 minutos, (iii) mantenimiento a 90% de B durante 5 minutos, (iv) etapa isocrática a 10% B y manteniendo durante 5 minutos antes de la siguiente inyección de muestra. La espectrometría de masas se realizó en el eluyente mediante ionización por electrospray (ESI) en modo de ion positivo con un rango de m /z escaneado desde 160-2000.
lisis de glóbulos rojos
La actividad hemolítica de LL-37, WLBU-2 y CSA-13 (0-200 μ
g /ml), contra los glóbulos rojos humanos (RBC) se sometieron a pruebas de eritrocitos en suspensión en PBS. RBC prepara a partir de sangre fresca (hematocrito ~ 5%) se incubaron durante 1 h a 37 ° C después de la adición de moléculas de ensayo. la concentración de hemoglobina relativa en los sobrenadantes después de centrifugación a 2000 × g se controló midiendo la absorbancia a 540 nm. 100% de hemólisis fue tomado de muestras en las que 2% se añadió Triton X-100 para el cultivo celular
células de adenocarcinoma gástrico humano. (ATCC; CRL-1739) se mantuvieron en DMEM cultivo (BioWhittaker) suplementado con 10% de calor -inactivated de suero bovino fetal (Hyclone) a 37 ° C y 5% de CO 2. Para ensayo de liberación de LDH y celdillas de evaluación de microscopio se sembraron en placas de 24 pocillos y se dejaron crecer hasta confluencia. En todos los experimentos, el medio se cambió a medio libre de suero ~ 12 h antes de la célula de tratamiento con LL-37, WLBU2 y CSA-13 (0-200 mg /ml) en pocillos individuales, durante 1 hora. A continuación, se recogió el medio de cultivo de células, se centrifuga (10 minutos, 5000 rpm, temperatura ambiente) y se sometió a la evaluación de la LDH (LDH-citotoxicidad kit de ensayo; Biovision Inc.)
Declaraciones
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NIH conceder HL067286 y la Universidad médica de Bialystok otorga 3-22458F y 3-18714L
Autores 'original presentado archivos de imágenes
a continuación se presentan los enlaces a los archivos de los autores presentados original para imágenes. 'archivo original para la figura 1 12866_2009_858_MOESM2_ESM.pdf autores 12866_2009_858_MOESM1_ESM.pdf Autores archivo original de la figura 2 12866_2009_858_MOESM3_ESM.pdf autores archivo original de la figura 3 12866_2009_858_MOESM4_ESM.pdf autores archivo original de la figura 4 12866_2009_858_MOESM5_ESM.pdf archivo original de los autores de la figura 5 Conflicto de intereses
Dr. P. Savage es un consultor pagado por Ceragenix Pharmaceuticals, Inc. inmune innata, y WittyCell. Ninguna de las investigaciones recogidas en este documento fue apoyado por Ceragenix farmacéuticos o por cualquier otra entidad corporativa. Otros autores: ninguno de declarar
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