Baktericide aktiviteter af den kationiske steroid CSA-13 og cathelicidin peptid LL-37 over for Helicobacter pylori i simulerede gastriske juice

baktericide aktiviteter af den kationiske steroid CSA-13 og cathelicidin peptid LL-37 over for Helicobacter pylori
i simuleret mavesaft
Abstrakt
Baggrund
verdensomspændende udseende resistente stammer af H. pylori
motiverer en søgning efter nye agenter med terapeutisk potentiale mod denne familie af bakterier, der koloniserer maven, og er forbundet med adenocarcinom udvikling . Denne undersøgelse blev designet til at vurdere in vitro
anti-H. pylori
potentiale cathelicidin LL-37 peptid, der er naturligt til stede i mavesaft, dens optimerede syntetisk analog WLBU2, og den ikke-peptid-antibakterielt middel ceragenin CSA-13.
Resultater
Efter aftale med tidligere undersøgelser blev der observeret forøget ekspression af hCAP-18 /LL-37 i maveslimhinden opnået fra H. pylori
smittede forsøgspersoner. MBC (minimum bakteriedræbende koncentration) værdier bestemt i næringsstof-holdige medier interval 100-800 pg /ml for LL-37, 17,8 til 142 pg /ml for WLBU2 og 0.275-8.9 pg /ml for ceragenin CSA-13. Disse data indikerer betydelige, men vidt forskellige antibakterielle aktiviteter mod kliniske isolater af H. pylori
. Efter inkubation i simuleret mavesaft (lav pH med tilstedeværelse af pepsin) CSA-13, men ikke LL-37 eller WLBU2, bibeholdt antibakteriel aktivitet. Sammenlignet med LL-37 og WLBU2 peptider, CSA-13-aktivitet var også mere modstandsdygtige over for inhibering med isolerede vært gastriske muciner.
Konklusion
Disse data indikerer, at cholsyre-baserede antimikrobielle midler, såsom CSA-13 modstå proteolytisk nedbrydning og hæmning af mucin og har potentiale til behandling af H. pylori
infektioner, herunder omkostningerne i forbindelse med clarithromycin og /eller metronidazol-resistente stammer.
Baggrund
Helicobacter pylori
bæres af mere end halvdelen af verdens voksne befolkning [1]. Det kan kronisk kolonisere menneskets gastrisk mucosa, hvor det findes i slimlaget og er klæbet til epitelceller [2]. Selv om de fleste smittede forsøgspersoner forbliver asymptomatisk, infektion med H. pylori
kan fremme alvorlige gastritis [3] og øge risikoen for gastrisk maligniteter [4, 5]. I nogle epidemiologiske studier blev H. pylori
udryddelse vist at være effektiv i gastrisk forebyggelse af kræft [6, 7]. Desuden blev H. pylori
udryddelse sig at reducere forekomsten og sværhedsgraden af ​​læsioner med carcinogent potentiale i dyremodeller [8, 9]. Naturlige mekanismer, der beskytter værten mod H. pylori
infektioner afhænger funktionen af ​​medfødte forsvar system, hvori antibakterielle peptider, såsom cathelicidin LL-37 [10, 11] og O-glycaner i gastrisk mucin [12] spille en nøglerolle.
LL-37 er en proteolytisk forarbejdet peptid afledt fra den C-terminale domæne af humant cathelicidin (hCAP-18 /LL-37), der konstitutivt frigivet til det ekstracellulære rum ved fagocytiske granulocytter og epitelceller [13] . Funktioner tilskrives LL-37 omfatter forebyggelse af bakterievækst [14], neutralisering af bakteriel væg molekyle bioaktivitet [15], og aktivering af værtsceller ved at binde specifikke cellemembranreceptorer [16-18]. H. pylori
opregulerer produktionen af ​​LL-37 /hCAP18 af gastriske epithel, tyder på, at cathelicidin eller dens afledte LL-37 bidrager til at bestemme balancen mellem vært slimhinde forsvar og H. pylori
overlevelse mekanismer, der styrer kroniske infektion med denne gastrisk patogen [10, 11].
Kationiske antibakterielle peptider (CAP), herunder LL-37 er blevet grundigt undersøgt som en potentiel kilde til nye antibakterielle molekyler. Det konstruerede WLBU2 peptid, hvis rester er indrettet til at danne en amfipatisk helisk struktur med optimal ladning og hydrofobe densitet, overvinder nogle begrænsninger af naturlige LL-37, såsom følsomhed over for Mg 2+ eller Ca 2+ og inaktivering ved blod serum [19]. Derfor kunne WLBU2 behandle infektioner, hvor LL-37 er ineffektive. For at generere molekyler stand til at efterligne CAP evne til at kompromittere bakteriel membran integritet, ikke-peptid ceragenins med kationiske, blev facially amfifile strukturer karakteristisk for de fleste antimikrobielle peptider udvikles. Ceragenins såsom CSA-13 reproducere den krævede morfologi CAP anvendelse af en galde-syre stilladser og vedhæftede amingrupper [20]. De er baktericide mod både grampositive og gramnegative organismer, herunder lægemiddelresistente bakterier såsom klinisk relevant methicillin-resistent Staphylococcus aureus
(MRSA), og en tidligere modtagelighed undersøgelse viste at CSA-13 har en MIC 50 /MBC 50 forhold på 1 [21, 22]. I denne undersøgelse sammenligner vi den baktericide styrke af LL-37, WLBU2 og CSA-13 mod kliniske isolater af H. pylori
. Resultaterne antyder, at cholsyre-baserede efterligninger af antimikrobielt peptid såsom CSA-13 har potentiale til behandling af H. pylori
infektion, herunder dem forårsaget af clarithromycin og /eller metronidazol-resistente stammer.
Resultater
immunohistokemisk probing af humane maveslimhinden sektioner med anti-hCAP-18 /LL-37-antistof
mikroskopiske billeder af mucosale biopsier efter immunhistokemisk evaluering med anti-hCAP-18 /LL-37-antistof er vist i figur 1. DAB- positiv farvning indikerer tilstedeværelsen af ​​LL-37 peptidet og /eller dens moderprotein hCAP-18. Høj intensitet DAB-farvning (angivet med brun farve) til slim-producerende epitelceller og fundiske kirtler indikerer høj akkumulering af hCAP-18 /LL-37-peptid sandsynligvis drevet af LL-37 specifik interaktion med mucin, der blev rapporteret i tidligere undersøgelser [23, 24]. Fordelingen af ​​hCAP-18 /LL-37 i mere differentieret epitelcelle population af maveslimhinden afviger fra det, der findes for human β-defensin 2 [10] eller lysozym [25], men svarer til den observeret i tyktarmen [26 ]. Maveslimhinden biopsier fra patienter inficeret med H. pylori
vise højere intensitet af DAB farvning i forhold til dem, der opnås fra ikke-smittede forsøgspersoner. Ifølge tidligere rapporter viser dette resultat en værtsforsvar respons på H. pylori
[11], som er delvis baseret på forøget ekspression af hCAP-18 /LL-37 ved gastriske epitelceller. Figur 1 Tilstedeværelse af hCAP-18 /LL-37 peptid i mucosale biopsier fra det menneskelige mave detekteret ved anvendelse immunhistokemisk analyse med monoklonale antistoffer mod human CAP-18 /LL-37. Prøver A /B og C /D repræsenterer prøver taget fra ikke-inficerede og H. pylori
smittede personer hhv. De viste data er repræsentative for fem eksperimenter.
Baktericid aktivitet af LL-37, WLBU-2 peptider og ceragenin CSA-13 mod forskellige stammer af H. pylori
at identificere resistente stammer, kliniske isolater af H. pylori
blev underkastet MIC evaluering (tabel 1) med flere antibiotika for tiden anvendes i klinisk behandling af H. pylori
infektion. Blandt syv testede isolater opnået fra forskellige individer, stamme 4 var resistent over for metronidazol og stammerne 5, 6, 7, var resistente over for både metronidazol og clarithromycin. Alle isolater var modtagelige for amoxicillin og tetracyclin. I overensstemmelse med tidligere rapporter om virkningerne af hBD-1, H-BD-2 og LL-37 peptider mod H. pylori
[10, 11] alle isolerede stammer af H. pylori
blev dræbt efter 6 timers inkubation med LL-37, WLBU2 og CSA-13 med gennemsnitlig MBC (ug /m) værdier 8.9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 og 0,31 ± 0,25, når MBC blev evalueret i HEPES-buffer, eller 300 ± 232, 53 ± 41 og 2,98 ± 3,11, når MBC blev evalueret i Brucella Broth Bullion henholdsvis (figur 2). Evaluering af MBC værdier i HEPES buffer med tilsætning af 2 mM MgCl 2 for H. pylori
ATCC 43504 afslørede en otte gange stigning for LL-37, og en fire dobling for både WLBU2 og CSA-13 (data Vis ikke). Figur 2 baktericid aktivitet mod H. pylori. Minimum bakteriedræbende koncentration (MBC) af LL-37 (hvid søjle), WLBU2 (grå søjle) og CSA-13 (sort søjle) mod H. pylori
(ATCC 43504 stamme og syv kliniske isolater opnået fra slimhinder prøver fra forskellige fag ) evalueret i HEPES (panel A) eller Brucella Broth Bulion (panel B). MBC angiver koncentrationer, hvor forbindelser helt udrydde et inokulum af H. pylori
.
Tabel 1 Vurdering af følsomhed af kliniske stammer af H. pylori
for antibiotika.
H. pylori
stammer

Antibiotika
AMX
CLR
TET
Metronidazol
ATCC 43504
0,016
0,094
0.25
64,0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0.25
64,0 ®
1,0
96,0 ®
6
0.032
1,5 ®
1,5
32,0 ®
7
0,047
1.5 ®
2,0
48,0 ®
MIC-værdier (ug /m) (AMX-amoxicillin, CLR-clarithromycin, TET-tetracyclin)
antibakterielle aktivitet af LL-37, WLBU2 og CSA-13 efter præinkubation ved lavt pH med pepsin eller mucin
Udover kendte inhibering af CAP antibakteriel aktivitet ved divalente kationer såsom Mg 2+ og Ca 2+, den proteolytiske aktivitet pepsin kan også kompromittere CAP funktion i mavesaften miljø med tilstedeværelse af muciner, og lav pH. For at løse denne mulighed vurderet, antibakteriel aktivitet over for Escherichia coli
MG1655 efter 3 timer Præinkubering af LL-37, WLBU2 og CSA-13 i simuleret mavesaft i sammenligning med aktivitet efter deres præ-inkubering i PBS ved pH 7,4 . Forud for udførelsen aflivning assay pH af prøver med lav pH og lav pH /pepsin blev indstillet til 7,4. Den antibakterielle aktivitet af LL-37 og WLBU2 peptider mod E. coli
MG1655 blev ikke signifikant ændret efter præinkubation ved pH ~ 1,5, men blev tabt efter præinkubation ved pH ~ 1,5 i nærvær af pepsin (figur 3A og 3B). I modsætning hertil den antibakterielle aktivitet af CSA-13 var uændret ved præ-inkubering ved pH ~ 1,5 med eller uden pepsin (figur 3C). På den anden side blev der baktericide aktiviteter af alle komponenter kompromitteret i forskellig udstrækning, når de afprøves under anvendelse af en bakteriel drab assay i nærværelse af oprenset gastrisk mucin. I tæt aftale med resultater fra denne E. coli
MG1655 undersøgelse, MBC værdier af LL-37 peptid evalueret efter 1H præ-inkubering med buffer ved lav pH, der indeholder pepsin eller mucin blev øget, men dem af CSA-13 var næsten uændret (figur 3D). Alle evaluerede agenter mistede antibakteriel aktivitet i PBS suppleret med 10% humant galde (en koncentration, der ikke interfererer med E. coli
MG1655 vækst - data ikke vist). Dette resultat antyder, at fysisk-kemiske egenskaber af antibakterielle molekyler fremme deres indsættelse i galde lipoprotein og derved begrænse deres interaktion med den bakterielle væg. Der har ikke været nogen undersøgelse for at evaluere antibakterielle aktivitet af CAP i duodenal juice, men disse resultater viser, at galde reflux ind i maven kan forstyrre CAP aktivitet. Figur 3 Antibakteriel aktivitet mod E. coli MG1655 og H. pylori stamme ATCC 43504. Antibakteriel aktivitet af LL-37 (panel A), WLBU2 (panel B) og CSA-13 (panel C) mod E. coli
MG1655 efter præinkubation (3 timer ved 37 ° C) i PBS (åbne cirkler), simuleret mavesaft ved pH ~ 1,5 (firkanter), simuleret mavesaft med pepsin (romber), simuleret mavesaft med mucin (trekanter) og PBS med humant galde (10%) opnået fra galdeblæren (udfyldt cirkel). De viste data er middelværdier ± SD af tre til fire eksperimenter. MBC af LL-37 (hvid søjle) og CSA-13 (sort søjle) (felt D) mod H. pylori
(ATCC 43504) efter præinkubation (1 time ved 37 ° C) i simuleret mavesaft ved pH ~ 1,5 (A), simuleret mavesaft med pepsin (B) og i nærvær af mucin (C)
Analytisk karakterisering af LL-37 og CSA-13 efter inkubation med pepsin
massespektrometrianalyse (figur 4) viser at tre timers inkubation med pepsin resulterer i omfattende nedbrydning af LL-37. Men ved lav pH, pepsinfordøjelse er meget specifikke og LL-37 peptidspaltning er begrænset til stedet med hydrofobe aminosyrer. Potentielle spaltningssteder forudsagt af PeptideCutter karakterisering software http:.. //Kr ExPASy org /værktøjer /peptidecutter /, tyder på, at LL-37 fordøjelse med pepsin i vores eksperimentelle betingelser bør frigive 11 produkter, herunder 3 kortere peptider (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD og LVPRTES). Disse forudsigelser er i overensstemmelse med massespektralanalyse, som ikke viser tilstedeværelsen af ​​intakt LL-37 tilbage efter inkubation med pepsin ved lav pH, men ikke afslører fremkomsten af ​​adskillige nye toppe med forskellige retentionstider. Den resterende antibakterielle aktivitet af LL-37 efter behandling med pepsin (figur 3A og 3D) i drabsassays sandsynligvis repræsenterer den tilbageværende aktivitet af disse LL-37 fragmenter. I modsætning til den iagttagne nedbrydning af LL-37, blev CSA-13 analytisk karakterisering ikke ændret efter inkubation med pepsin ved lav pH. Figur 4 massespektrometrianalyse. Massespektrometrianalyse af LL-37 (panel A) og CSA-13 (panel B) i PBS (kurve 1) lav pH-buffer (kurve 2) og lav pH-buffer med tilstedeværelse af pepsin (kurve 3). Den samlede ion kromatogram (TIC) præsenteres for hver prøve tilstand med en indsat masse-til-ladning (m /z) spektre viser intensitet for de boxed TIC toppe. Molekylvægten af ​​intakt LL-37 er 4494, som kan observeres med flere debiteringer (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 MW = 900, osv) i positiv ion-mode. Molekylvægt CSA13 er 678, som kan observeres direkte, og med flere afgifter. Data fra et forsøg er vist.
Toksicitet af LL-37, WLBU2 og CSA-13 mod RBC og humane adenocarcinomceller
Uspecifik indsættelse af antibakterielle peptider og deres efterligner i værtscelle-membraner kan forårsage toksicitet. Host cellemembranpermeabilisering kan måles ved frigivelse af proteiner, såsom hæmoglobin og LDH fra cytosolen til det ekstracellulære rum. Ved at evaluere hæmoglobin og LDH-frigivelse (figur 5A og 5B), viser vi ingen signifikant membranpermeabilisering af nogen testede molekyler i området, hvor de har baktericid aktivitet i saltholdige buffere (figur 2A, figur 3). Dette resultat blev bekræftet ved mikroskopisk bedømmelse af adenocarcinom cellemorfologi viser ingen synlig forskel mellem kontrolcellerne og dem behandlet med 10 ug /ml LL-37, WLBU2 eller CSA-13 (figur 5C). Men en stigning i hæmoglobin og LDH frigivelse blev observeret med stigende koncentration. Blandt de tre testede molekyler, WLBU2 var den stærkeste hæmolytiske middel, men alle af dem viste lignende evne til at kompromittere adenocarcinom cellemembranen integritet (figur 5B og 5C). CSA-13 baktericide koncentrationer mod H. pylori
og E. coli
MG1655 (figur 2A, 2B og 3C) evalueres i saltvand samt næringsstof indeholdende puffer lå under sin minimale hæmolytisk koncentration og under koncentrationer forårsager dysfunktion af adenocarcinom cellemembraner. Figur 5 Evaluering af celletoksicitet. Hæmoglobin og LDH-frigivelse fra humane røde blodlegemer og humane gastrisk adenocarcinom-celler (panel A og B henholdsvis) efter tilsætning af LL-37 (cirkler), WLBU2 (diamanter) og CSA-13 (trekanter), efterfulgt af inkubation i 1 time ved 37 ° C. De viste data er middelværdier ± SD af tre eksperimenter. Morfologi af humane gastrisk adenocarcinom celler før (kontrol) og efter LL-37, blev WLBU2 og CSA-13 behandling evalueret ved fase-kontrast mikroskopi (panel C). Data fra et repræsentativt forsøg er vist. To andre eksperimenter afslørede tilsvarende resultater.
Diskussion
Hastigheden for vellykket behandling af H. pylori
mave infektion, opnås med kombinationsterapier af to antibiotika og en protonpumpehæmmer er faldet fra over 90% til ca. 80 % i det sidste årti [27]. Hertil kommer, at omkostningerne ved denne behandling er signifikant, og derfor behov for mere bredt tilgængelige midler til behandling eller forebyggelse af H. pylori
infektion stadig eksisterer [28]. Nye midler til behandling af H. pylori
infektioner er også nødvendig på grund af stigende lægemiddelresistens problemer forårsaget af omfattende brug af antibiotika [29] og de adaptive overlevelse mekanismer patogene bakterier til at modvirke øjeblikket anvendes antimikrobielle midler. For eksempel har H. pylori
resistente over for amoxicillin, metronidazol og clarithromycin er rapporteret [30, 31]. Metoder til at forbedre behandlinger for H. pylori
kan være styret af indsigt i de naturlige mekanismer, som inficerede patienter reagerer på denne bakterie og årsagerne de normale vært-forsvarsmekanismer mislykkes.
Denne undersøgelse bekræfter en tidligere rapport fra øget hCAP-18 /LL-37 ekspression i maveslimhinden af ​​forsøgspersoner inficeret med H. pylori
[11]. Dette fund tyder på, at øget produktion af den baktericide peptid LL-37 kan spille en nøglerolle i værtsforsvar mod H. pylori
[11]. Men denne bakteriedræbende reaktion i nogle fag er utilstrækkelig og H. pylori
infektion kan stadig nå et kronisk stadie. Manglen på baktericide funktion af LL-37 i denne indstilling har foreslået, at øget ekspression af hCAP-18 /LL-37 peptid i gastrisk slim af inficerede individer kan have yderligere fungerer som en anti-inflammatorisk og vækststimulerende middel. Det blev faktisk for nylig vist, at mavesår helbredelse i rotter fremmes ved cathelicidin-medieret transaktivering af epidermal vækstfaktor receptorer (EGFR) via transformerende vækstfaktor alpha (TGFa) signalvejen [32]. Alternativt tab af forsvar mod H. pylori
kan skyldes tab af antibakteriel funktion af LL-37 i det miljø af maveslimhinden. Følgelig kan design af antimikrobielle midler, som er mere effektive i denne indstilling være gavnligt.
Motiveret af immunohistologiske resultater, aktiviteten af ​​LL-37 mod kliniske isolater af H. pylori
og E. coli
MG1655 under biologisk relevante betingelser blev sammenlignet med den for det syntetiske peptid WLBU2 og ceragenin CSA-13. Denne undersøgelse viser, at CSA-13, i modsætning til LL-37 og WLBU2 peptider, opretholder stærk baktericid aktivitet i nærvær af mucin og efter præinkubering med pepsin ved lav pH. Disse betingelser repræsenterer unikke udfordringer i forbindelse med H. pylori
behandling, som disse bakterier i maven er beskyttet mod det sure miljø af et tykt slimlag og effektiviteten af ​​mange antimikrobielle medikamenter er stærkt formindsket ved sur pH [31]. I den første effektiv terapi for H. pylori
infektion var en kombination af relativt pH- ufølsom antimikrobielle lægemidler, såsom bismuth, tetracyclin og metronidazol [33]. Hertil kommer, som maven tømmes med jævne dens indhold (lokal behandling tendens til at blive udvandet og vaskes ud) konstateringen af, at CSA-13 har baktericid aktivitet ved meget lavere koncentration derefter LL-37, efter samme inkubationstid (3-6 timer) [11], tyder på, at CSA-13 kan have terapeutisk potentiale til behandling af H. pylori
infektion. Den antibakterielle aktivitet af CSA-13, som har en mindre nettoladning og en unik fordeling af denne ladning over et steroid stillads sammenlignet med LL-37 og WLBU2 peptider, viste sig også at være mindre hæmmede ved mucin isoleret fra maveslimhinden. Terapeutisk potentiale baseret på evnen af ​​CSA-13 at udrydde H. pylori
understøttes også af tidligere rapporteret antibakteriel aktivitet mod andre bakteriestammer, herunder kliniske isolater af Pseudomonas aeruginosa
[21] og S. aureus
[22]. CSA-13 unikke evne til at gå på kompromis bakteriel membran integritet og den kemiske natur af denne lave-molekylær-masse stof, der kan oversættes til at sænke omkostningerne ved syntese i forhold til kationiske antibakterielle peptider tyder på, at CSA-13 eller måske andre ceragenins have potentiale til behandling af H. pylori
infektion, herunder dem, der skyldes dens resistente stammer.
Konklusion
baktericid aktivitet af ceragenin CSA-13 fastholdes efter præinkubering i simuleret mavesaft og i nærværelse af mucin. Dette in vitro
evaluering indikerer et betydeligt potentiale i dette molekyle i behandling af mave slimhinde infektion.
Metoder
Antibakterielle midler
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) og WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) peptider blev indkøbt fra Bachem (King of Prussia, PA). CSA-13 blev fremstillet som tidligere beskrevet [34]. Amoxicillin (AMX), clarithromycin (CLR), tetracyclin (TET) og metronidazol blev købt fra Sigma.
Indsamling af maveslimhinden og galde prøver
Under gastroskopi, udført med enten en GIF V2 eller Q145 (Olympus) gastroskop, flere gastriske mucosale skiver blev taget fra prepyloric og corpus regioner af maven. H. pylori
infektion blev etableret i biopsi prøver vha en urease test (CLO-test). Human galde blev opnået fra galdeblæren hos patienter, der gennemgår kolecystektomi. Prøver blev filtersteriliseret gennem et 0,45 um membran før bliver fortyndet i PBS (1: 1) og blandes med antibakterielle midler anvendt i bakterier drab assays. Undersøgelserne blev godkendt af Medical University of Bialystok etiske komité for forskning på mennesker og dyr, og alle patienter gav informeret skriftligt samtykke til deltagelse i undersøgelsen.
Immunohistokemiske undersøgelser
Immunohistokemiske undersøgelser blev udført på formalin-fikseret, paraffin- indlejrede humane gastriske mucosale snit under anvendelse af et kanin-anti-LL-37-antistof (H-075-06, anvendt ved 1: 100 fortynding Phoenix Pharamceuticals Inc.). Paraffinindlejrede materialer blev snittet til 5 um tykkelse og flød på destilleret vand ved 45 ° C. Snit blev derefter monteret på objektglas og anbragt i 57 ° C varm ovn natten over. Snittene blev deparaffineret ifølge standardprocedurer og standset med 0,9% hydrogenperoxid i methanol i 30 minutter. Snittene blev inkuberet med primært antistof ved 37 ° C i 60 minutter, vaskes med 1% PBSA (1% BSA i PBS), og udsat for binding med sekundært antistof (biotinyleret gede-anti-kanin IgG, 1: 400 fortynding). Amplifikation blev udført med et Vectastain ABC kit, og et HRP detektionssystem blev anvendt til colocalize peroxidaseaktivitet med en DAB-substrat. Snittene blev modfarvet med hæmatoxylin. Prøver blev betragtet med et Nikon Eclipse 80 mikroskop under 40 ganges forstørrelse.
Evaluering af MIC og MBC
Den minimale inhibitoriske koncentration (MIC) af konventionelle antibiotika mod syv forskellige kliniske isolater af H. pylori
(9 × 10 8 CFU /ml) blev bestemt under anvendelse Muller-Hinton agar (MH) indeholdende 5% fåreblod. Inkubationen blev fortsat i 4 dage ved 35 ° C i mikroaerofile betingelser opretholdt med anvendelse af en Gas Pack-Campylobacter gasdannende kit BR60. Kliniske isolater af H. pylori
blev anset resistente over for respektive antibiotika, når MIC-værdierne var over 4 pg /ml til AMX, 1 ug /ml for CLR og 16 ug /ml for TET og metronidazol. Den minimale baktericide koncentration (MBC) af antibakterielle stoffer blev vurderet ved anvendelse et inokulum ved 10 8 CFU /ml. Efter en 6 timers inkubering ved 37 ° C blev 10 pi prøver af suspensionerne spottet på Columbia agar suppleret med fåreblod (5%). Salg bakterier drab assay Salg The baktericide aktiviteter af LL-37, WLBU2 peptider og ceragenin CSA-13 mod E. coli
MG1655 i nærvær af mucin eller pepsin fra porcint slim (Sigma) og human galde blev målt som tidligere beskrevet [35]. Bakterier blev dyrket til midt-log-fase ved 37 ° C (kontrolleret af evalueringen af ​​optisk densitet ved 600 nm) og resuspenderet i PBS-buffer (pH = 7,4). De bakterier suspensioner blev derefter fortyndet 10 gange i 100 pi af opløsninger indeholdende antibakterielle midler i sig selv eller med mucin (1000 ug /ml), eller galde (de endelige 01:10 bile fortyndingsforhold efterligner miljøet i de øvre tyndtarm, hvori galde er secerneret [36] (pH = 7,4)). I et andet sæt forsøg antibakteriel aktivitet af disse komponenter blev bestemt efter deres præinkubering i simuleret mavesaft [36, 37] ved pH ~ 1,5 med og uden pepsin (0,5 mg /ml). Efter inkubering bakterier med antibakterielle molekyler i en time ved 37 ° C blev bakterielle suspensioner placeret på is og fortyndet 10- til 1000- fold. Portioner af hver fortynding (10 pi) blev spottet på LB-agarplader for dyrkning natten over ved 37 ° C. Antallet af kolonier på hver fortynding blev talt den følgende morgen. De kolonidannende enheder (CFU /ml) af de enkelte prøver blev bestemt ud fra fortyndingsfaktoren.
Massespektrometri
Analytisk karakterisering blev udført på de CSA-13 og LL-37 suspensioner efter 3H inkubation med pepsin (0,5 mg /ml) ved lav pH (~ 1,5) ved 37 ° C, under anvendelse af Shimadzu (Columbia, MD) instrument (LC-MS-system bestod af en LC-20AB opløsningsmiddeltilførselssystem og SIL-20A autosampler koblet til dobbelt bølgelængde UV-Vis detektor og en LCMS 2010EV enkelt kvadrupolmassespektrometer), koblet til en Shimadzu Premier C18-søjle (150 mm x 4,6 mm id, 5 um partikelstørrelse). Den mobile fase strømningshastighed var 1 ml /min med en start-forhold på 90% mobil fase A (vand) og 10% mobil fase B (acetonitril) begge med 0,1% (vol /vol) myresyre. Analysemetoden bestod af følgende trin: (i) prøven injektion og fastholdelse ved 10% B i 5 min, (ii) lineær gradient fra 10% til 90% B i løbet af 15 minutter, (iii), der holder ved 90% B i 5 minutter, (iv) isokratisk trin til 10% B og holde i 5 minutter før den næste prøve injektion. Massespektrometri blev udført på eluenten under anvendelse elektrosprayionisering (ESI) i positiv ion-mode med en scannet m /z området fra 160-2000.
Lyse af røde blodlegemer
hæmolytiske aktivitet af LL-37, WLBU-2 og CSA-13 (0-200 μ
g /ml), mod humane røde blodlegemer (RBC) blev testet under anvendelse erythrocytter suspenderet i PBS. RBC fremstillet ud fra frisk blod (hæmatokrit ~ 5%) blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C efter tilsætning af testmolekyler. koncentration relativ hæmoglobin i supernatanter efter centrifugering ved 2000 x g blev overvåget ved at måle absorbansen ved 540 nm. 100% hæmolyse blev taget fra prøver, hvor 2% Triton X-100 blev tilsat
Cellekultur
Humane gastrisk adenocarcinom-celler. (ATCC; CRL 1739) blev opretholdt i DMEM (BioWhittaker) kultur suppleret med 10% varme -inactivated føtalt bovint serum (Hyclone) ved 37 ° C og 5% CO 2. For LDH-frigivelse-assay og mikroskop evaluering celler blev udpladet i plader med 24 brønde og dyrkes til konfluens. I alle eksperimenter blev mediet ændret til serumfrit medium ~ 12 timer før cellebehandling med LL-37, WLBU2 og CSA-13 (0-200 pg /ml) i individuelle brønde i 1 time. Celledyrkningsmedium blev derefter opsamlet, centrifugeret (10 minutter, 5000 omdrejninger, RT) og underkastet LDH evaluering (LDH-cytotoksicitet Assay Kit; BioVision Inc.)
erklæringer Salg Takord
Dette arbejde blev støttet af NIH give HL067286 og Medical University of Bialystok giver 3-22458F og 3-18714L
Forfattere 'oprindelige indsendt filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12866_2009_858_MOESM1_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12866_2009_858_MOESM2_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12866_2009_858_MOESM3_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12866_2009_858_MOESM4_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 4 12866_2009_858_MOESM5_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 5 konkurrerende interesser
Dr. P. Savage er en betalt konsulent for Ceragenix Pharmaceuticals, medfødte immunsystem Inc., og WittyCell. Ingen af ​​den forskning, rapporteret i dette papir blev støttet af Ceragenix Pharmaceuticals eller af en anden juridisk enhed. Andre forfattere: ingen til at erklære
.

• Evaluering af passagen af ​​Lactobacillus gasseri K7 og bifidobakterier fra maven til tarmene ved hjælp af en enkelt reaktor model
• Ballon-okkluderet retrograd transvenøse udslettelse for gastrisk varicer: forholdet mellem det kliniske resultat og gastrorenal shunt okklusion