Baktericidinis veikla katijoninių steroidų CSA-13 ir cathelicidin peptido LL-37 prieš Helicobacter pylori imituojant skrandžio sulčių

Baktericidinis veikla katijoninių steroidų CSA-13 ir cathelicidin peptido LL-37 prieš Helicobacter pylori
imituojant skrandžio sulčių pervežimas tezės
Background Viesbutis The visame pasaulyje išvaizdos vaistams atsparių padermių H. pylori
motyvuoja ieškoti naujų agentų su terapinio potencialo su šiuo bakterijų šeima, kolonizuoja skrandį, ir yra susijęs su adenokarcinoma plėtrai. Šis tyrimas buvo skirtas įvertinti in vitro Viesbutis The anti-H. pylori
potencialas cathelicidin LL-37 peptido, kuris yra natūraliai esančių skrandžio sulčių, jos optimizuotas sintetinės analoginis WLBU2, o ne baltyminės antibakterinis agentas ceragenin CSA 13 d.
rezultatai
sutikus ankstesnių tyrimų padidėjo išraiška hCAP-18 /LL-37 buvo pastebėtas skrandžio gleivinės gauto iš H. pylori
infekuotų asmenų. MBC (minimali baktericidinis koncentracijos) vertės nustatomos maistinių medžiagų, kurių sudėtyje yra žiniasklaidos svyruoja nuo 100-800 mikrogramų /ml LL-37, 17.8-142 mikrogramų /ml WLBU2 ir 0.275-8.9 mikrogramo /ml ceragenin CSA-13. Šie duomenys rodo, nemažai, bet labai skirtingus antibakterinių veiklą prieš klinikinių izoliatų H. pylori
. Po inkubacijos imituojant skrandžio sulčių (mažo pH su buvimu pepsino) CSA-13, bet ne LL-37 arba WLBU2 išlaikė antibakterinį aktyvumą. Palyginti su LL-37 ir WLBU2 peptidų, CSA-13 aktyvumas taip pat buvo labiau atsparūs slopina izoliuota šeimininko skrandžio mucino.
Išvada
Šie duomenys rodo, kad Cholio rūgšties pagrindu antimikrobinių agentų, tokių kaip CSA-13 atsispirti proteolitinę degradaciją ir slopinimo mucino ir turi potencialą gydyti Helicobacter pylori
infekcijų, įskaitant tuos, kuriuos sukelia klaritromicino ir /ar metronidazoliu atsparių.
faktai
Helicobacter pylori
veža daugiau nei pusė pasaulio suaugusiųjų gyventojų [1]. Jis gali chroniškai kolonizuoti žmogaus skrandžio gleivinę, kur ji rastos gleivių sluoksniu ir yra prikibęs epitelinių ląstelių [2]. Nors dauguma infekuotiems asmenims likti simptomų, infekcija su H. pylori
gali skatinti sunkia gastritas [3] ir žymiai padidinti skrandžio piktybinių navikų riziką [4, 5]. Kai kurių epidemiologinių tyrimų duomenimis, H. pylori
likvidavimo buvo įrodyta, kad būti veiksmingos skrandžio vėžio prevencijos [6, 7]. Be to, H. pylori
likvidavimo buvo nustatyta, kad sumažinti sergamumą ir pažeidimų sunkumas kancerogeninio gyvūnų modeliais [8, 9]. Natūralių mechanizmai, kurios apsaugo šeimininko, iš H. pylori
infekcijų priklauso nuo įgimto apsaugos sistemos funkcija, kuriuose antibakterinės peptidus, tokius kaip cathelicidin LL-37 [10, 11] ir O-glikanų skrandžio muciną [12] žaisti svarbų vaidmenį.
LL-37 yra proteolitiškai apdorojami peptidas kilęs iš C-galinį domeną žmogaus cathelicidin (hCAP-18 /LL-37), kuris yra konstitutyviai išleidžiami į ekstraląstelinio erdvėje fagocitines granulocitų ir epitelinių ląstelių [13] , Funkcijos priskiria LL-37 prevenciją įtraukti bakterijų augimą [14], neutralizavimas bakterijų sienelės molekulės biologinį aktyvumą [15] ir aktyvacijos šeimininko ląsteles, prisijungdamas konkrečių ląstelių membranos receptorius [16-18]. H.pylori
upregulates LL-37 /hCAP18 gamybą skrandžio epitelį, o tai rodo, kad cathelicidin ar jo išvestinius LL-37, prisideda prie nustatymo tarp priimančiosios gleivinės gynybos ir H. pylori
išgyvenimo mechanizmų pusiausvyrą, kuri reglamentuoja lėtinis infekcija su šiuo skrandžio patogeno [10, 11].
Katijoniniai antibakterinių peptidų (kepurės), įskaitant LL-37 buvo plačiai ištirtas kaip potencialus šaltinis naujų antibakterinių molekulių. Inžinerijos būdu WLBU2 peptidas, kurio liekanos yra išdėstyti suformuoti amfipatinio sraigtinis struktūrą su optimalaus krūvio ir hidrofobinio tankio, įveikia keletą gamtinių LL-37 trūkumų, kaip antai jautrumo Mg 2 + arba Ca 2 + ir slopinamasis kraujo serumo [19]. Todėl WLBU2 gali infekcijoms gydyti, kur LL-37 yra neveiksmingas. Siekiant sukurti molekulių, galinčių imituoti rinktinėje gebėjimą sutrukdyti bakterijų membranos vientisumas, nepeptidinę ceragenins su katijoninių, buvo sukurta iš veido amfifilinės struktūros būdingi daugumai antimikrobinių peptidų. Ceragenins pavyzdžiui, CSA-13 atgaminti reikiamą BŽŪP morfologiją naudojant tulžies rūgščių pastolius ir pridedamus aminų grupes [20]. Jie yra baktericidinis abiems gramteigiamų ir gramneigiamų mikroorganizmų, įskaitant vaistams atsparių bakterijų, tokių kaip kliniškai reikšmingas meticilinui atsparus Staphylococcus aureus
(MRSA) ir ankstesnis jautrumo tyrimas parodė, kad CSA-13 turi MIC 50 /MKV 50 santykis iš 1 [21, 22]. Šiame tyrime mes palyginti baktericidinį potenciją LL-37, WLBU2 ir CSA-13 prieš klinikinių izoliatų H. pylori pervežimas. Rezultatai rodo, kad Cholio rūgšties pagrindu imituoja antimikrobinių peptidų, pvz CSA-13 turi potencialą gydyti Helicobacter pylori
infekcijos, įskaitant sukelia klaritromicinas ir /ar metronidazoliu atsparių.
Rezultatai
Imunohistocheminis zondavimo žmogaus skrandžio gleivinės sekcijų su anti-hCAP-18 /LL-37 antikūnų
mikroskopiniai vaizdai gleivinės biopsijos po imunohistocheminio vertinimo su anti-hCAP-18 /LL-37 antikūnų rodomi 1. DAB- pav teigiamas dažymo parodo, kad LL-37 peptido ir /arba jos pagrindinės baltymų hCAP-18 buvimą. Didelio intensyvumo TBP dažymo (nurodomas rudos spalvos) ne gleives gaminančių epitelio ląstelių ir fundic liaukų rodo aukštą kaupimosi hCAP-18 /LL-37 peptido greičiausiai lemia LL-37 specifinės sąveikos su muciną, kuris buvo pranešta ankstesniais tyrimais [23, 24]. Pasiskirstymo hCAP-18 /LL-37 į daugiau diferencijuoto epitelio ląstelių populiacijos skrandžio gleivinės skiriasi nuo žmogaus beta-defensin 2 [10] arba lizocimo [25] nustatyta, tačiau yra panašus kaip ir storojoje žarnoje [26 ]. Skrandžio gleivinės biopsijos iš pacientų, infekuotų H. pylori
rodo didesnį intensyvumą DAB dažymo, palyginti su rezultatais, gautais ne iš infekuotų asmenų. Pagal ankstesnėse ataskaitose, šis rezultatas rodo šeimininko gynybos reakcija į H. pylori pervežimas [11], kuris yra iš dalies paremta padidėjo išraiška hCAP-18 /LL-37 skrandžio epitelinių ląstelių. 1 pav buvimas hCAP-18 /LL-37 peptido gleivinės biopsijos iš žmogaus skrandžio aptikta naudojant imunohistocheminės analizę su monokloninių antikūnų žmogaus BŽŪP-18 /LL-37. Mėginiai A /B ir C /D atstovauti pavyzdžius, gautus iš neužkrėstų ir H. pylori
infekuotų asmenų atitinkamai. Skelbiami duomenys yra atstovas iš penkių eksperimentų.
baktericidinį aktyvumą LL-37, WLBU-2 peptidai ir ceragenin CSA-13 prieš skirtingų kamienų H. pylori
Identifikuoti atsparių padermių, klinikiniai izoliatai H. pylori
buvo atliktas MILC vertinimo (1 lentelė) su keliais antibiotikų metu naudojamų klinikinis gydymas H. pylori
infekcijos. Tarp septynių tirtų, gautų iš įvairių dalykų, kamienas 4 buvo atsparus metronidazolio ir padermių 5, 6, 7 buvo atsparus tiek metronidazolio ir klaritromiciną. Visi izoliatai buvo jautrios amoksicilino ir tetraciklinas. Suderinamas su ankstesnėmis ataskaitomis hBD-1 poveikį, H-BD-2 ir LL-37 peptidai prieš H. pylori
[10, 11] visi izoliuoti padermių H. pylori pervežimas žuvo po 6 valandų inkubacijos su LL-37, WLBU2 ir CSA-13 su vidutiniu MBC (g /ml) vertės 8,9 ± 4,03; 5.23 ± 2,7 ir 0,31 ± 0,25, kai MKV buvo įvertintas Hepes buferio, arba 300 ± 232, 53 ± 41 ir 2,98 ± 3,11, kai MKV buvo įvertintas Brucella sultinio lydiniams atitinkamai (2 paveikslas). Vertinimas MBC vertybių HEPES buferis pridedant 2 mm MgCl 2 H. pylori
ATCC 43.504 atskleidė aštuonis kartus daugiau už LL-37, ir keturių kartų padidinti tiek WLBU2 ir CSA-13 (Duomenų nerodo). 2 pav baktericidinis aktyvumas prieš H. pylori. Minimalus baktericidinis koncentracija (MKV) ir LL-37 (balta skiltis), WLBU2 (pilkas stulpelis) ir CSA-13 (juoda stulpelio) prieš H. pylori pervežimas (ATCC 43.504 įtampa ir septyni klinikinių izoliatų, gautų iš gleivinės mėginiai iš skirtingų dalykų ) įvertinta HEPES (skydelyje) arba Brucella sultinio Bulion (panelė B). MBC rodo koncentracijos, už kurią junginiai visiškai likviduoti H. pylori
užkrato. 1
lentelė vertinimas jautrumo klinikinių padermių H. pylori pervežimas antibiotikams.
h. pylori
padermių

Antibiotikai
AMX
CLR
Tet
metronidazolis
ATCC 43.504
0,016
0,094
0,25
64.0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0,25
64,0 ®
1,0
96,0 ®
6
0,032
1,5 ®
1,5
32,0 ®
7
0,047
1,5 ®
2,0
48,0 ®
MIC vertės (mikrogramai /ml) (AMX-amoksicilino, CLR-klaritromicinas, TET-tetraciklino)
Antibakterinis aktyvumas LL-37, WLBU2 ir CSA-13 po išankstinio inkubacinio žemoje pH su pepsino arba mucino
Be žinomas slopinimu rinktinėje antibakteriniu veiklos pagal dvivalentinių katijonų, pvz Mg 2 + ir Ca 2 +, proteolitinis veiklos pepsino taip pat gali pakenkti rinktinėje funkciją skrandžio sulčių aplinkoje su mucino akivaizdoje, ir mažo pH. Siekiant spręsti šią galimybę mes įvertino antibakteriniu aktyvumu prieš Escherichia coli
MG1655 po 3 valandas iki inkubavimo LL-37, WLBU2 ir CSA-13 iš imituojant skrandžio sulčių, palyginti su veiklos po jų išankstinio inkubacinio PBS esant pH 7,4 , Prieš atliekant žudymo testą, bandinių su mažu pH ir žemo pH pH /pepsino buvo pakoreguotas 7.4. Antibakterinis aktyvumas LL-37 ir WLBU2 peptidų prieš E. coli pervežimas MG1655 reikšmingai nepakito po išankstinio inkubacinio laikotarpio pH ~ 1,5, bet buvo prarastas po išankstinio inkubacinio laikotarpio pH ~ 1.5 pepsino akivaizdoje (3a pav ir 3B). Priešingai, antibakterinis aktyvumas CSA-13 buvo nepakeistas išankstinio inkubacinio laikotarpio pH ~ 1,5 su arba be pepsino (3C pav.) Kita vertus, bakteriniai veikla visų komponentų buvo pažeista įvairių mastu, kai bandoma taikant bakterijų žudantį testą išgryninto skrandžio muciną buvimą. Glaudžiai bendradarbiaujant su rezultatais, gautais iš šio E. coli pervežimas MG1655 tyrimo, MBC vertybių LL-37 peptido įvertintas po 1H iki perinimo su buferiu žemoje pH, kuriame pepsinas ar mucino buvo padidintas, bet tiems iš CSA-13 buvo beveik nepakitęs (3D pav.) Visi įvertintas agentai prarado antibakterinis aktyvumas PBS papildytas 10% žmogaus tulžyje (kiekis, kad netrukdytų E. coli
MG1655 augimą - duomenys nebus rodomas). Šis rezultatas rodo, kad fizinės ir cheminės savybės antibakterinių molekulių skatinti jų įterpimą tulžies lipoproteinų, taip apribojant jų sąveika su bakterijų sienelės. Nebuvo tyrimas siekiant įvertinti antibakterinį aktyvumą dangteliais dvylikapirštės žarnos sulčių, tačiau šie rezultatai rodo, kad tulžies refliukso į skrandžio gali trukdyti rinktinėje veikla. 3 pav Antibakterinis aktyvumas prieš E. coli MG1655 ir H. pylori padermės ATCC 43504. antibakteriniu aktyvumu ir LL-37 (skydelyje), WLBU2 (panelė B) ir CSA-13 (panelė C) prieš E. coli
MG1655 po iki perinimo (3 h 37 ° C) PBS (atviros apskritimai), imituojant skrandžio sulčių esant pH ~ 1,5 (kvadratų), imituojant skrandžio sultys su pepsino (deimantais), imituojant skrandžio sultys su mucino (trikampiai) ir PBS su žmogaus tulžies (10%), gaunamas iš tulžies pūslės (užpildyti apskritimo). Skelbiami duomenys yra priemonė ± SD nuo trijų iki keturių eksperimentų. MBC LL-37 (balta stulpelis) ir CSA-13 (juoda stulpelis) (panelė D), prieš H. pylori pervežimas (ATCC 43504), po išankstinio inkubacinio (1 h 37 ° C), imituojant skrandžio sulčių, esant pH ~ 1,5 (A) imituoti skrandžio sultys su pepsino (B) ir dalyvaujant muciną (C)
analizės apibūdinimo iš LL-37 ir CSA-13 po inkubacijos su pepsino
masių spektrometrijos analizės (4 paveikslas) rodo, kad tris valandas inkubacijos su pepsino rezultatų platus degradacijos LL-37. Tačiau, esant mažam pH, pepsino virškinimą yra itin specifinė ir LL-37 peptidas skaldymas tik prie puslapio su hidrofobinių amino rūgščių. Galimas skilimo svetainės prognozavo PeptideCutter apibūdinimą programinės įrangos http:.. //As expasy org /Įrankiai /peptidecutter /, rodo, kad LL-37 virškinimas su pepsino mūsų eksperimento sąlygomis turėtų išleisti 11 produktų, įskaitant 3 trumpesnius peptidais (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD ir LVPRTES). Šios prognozės yra suderinamas su masinio spektrinę analizę, kuri nerodo bet sveika LL-37 likusių po inkubacijos su pepsino žemoje pH buvimą, tačiau atskleisti daug naujų viršūnių su skirtingais sulaikymo trukmė atsiradimą. po gydymo pepsino (3a pav ir 3D) į žudymo tyrimų Likusi antibakterinis aktyvumas LL-37 greičiausiai atstovauja liekamąjį poveikį šių LL-37 fragmentų. Priešingai pastebėtas degradacijos LL-37, ŠK-13 analitinė charakteristika nepasikeitė po inkubacijos su pepsino žemoje pH. 4 pav Masių spektrometrija analizė. Masių spektrometrija analizė LL-37 (skydelyje) ir CSA-13 (panelė B) PBS (kreivė 1) žemos pH buferis (kreivė 2) ir mažo pH buferis su buvimu pepsino (kreivė 3). Bendras jonų chromatograma (TIC) yra pateiktas su kiekviena mėginio sąlyga, su intarpas masė-į-atsakingas už (m /z) spektrų, kuriame intensyvumo dėžutės pavidalo TIC viršūnių. Molekulinė masė sveika LL-37 yra 4494, kuris gali būti stebimas su keliais mokesčius (m /z = 4 MW = 1124 m /z = 5 MW = 900 ir tt), teigiamą jonų režimu. Molekulinė masė CSA13 yra 678, kuris gali būti stebimas tiesiogiai ir su keliais mokesčiams. Duomenis iš vieno eksperimento rodomi.
Toksiškumas LL-37, WLBU2 ir CSA-13 prieš RBC ir žmogaus adenokarcinoma ląstelių
nespecifinis įterpimo antibakterinių peptidų ir jų imituoja į šeimininko ląstelių membranų gali sukelti toksinį poveikį. Ląstelė-šeimininkė, membrana permeabilization gali būti matuojamas pagal baltymų, pavyzdžiui, hemoglobino ir LDH iš citozolyje į ekstraląstelinio vietą išleidimo. Vertinant hemoglobino ir LDH atleidimo (5a pav ir 5B), mes parodome, neturi didelės membranos permeabilization bet išbandytų molekulių diapazone, kuriame jie turi baktericidinį aktyvumą druskinguose buferiai (2a pav 3 pav.) Ši išvada buvo patvirtinta mikroskopinių vertinimo adenokarcinoma ląstelių morfologijos nepateikdamas jokių matomų skirtumą tarp kontrolinių ląstelių ir gydytų 10 mikrogramų /ml LL-37, WLBU2 ar CSA-13 (5c pav). Tačiau in hemoglobino ir LDH išleidimo padidėjimas buvo pastebėtas su didėjančios koncentracijos. Tarp trijų išbandytų molekulių, WLBU2 buvo stipriausias hemolizinė agentas, bet visi jie parodė panašų gebėjimą sutrukdyti adenokarcinoma ląstelių membranos vientisumą (5b pav ir 5c). CSA-13 baktericidinėmis koncentracija prieš H. pylori pervežimas ir E. coli
MG1655 (skaičiais 2a, 2b ir 3c), vertinamą fiziologiniu tirpalu, taip pat maistinių medžiagų, kurių sudėtyje yra buferyje buvo mažesnis minimaliai hemolizinė koncentracijos ir žemiau koncentracijos sukelia sutrikusi adenokarcinoma ląstelių membranas. 5 pav vertinimas toksiškumo ląstelių. Hemoglobino ir LDH atpalaidavimo iš žmogaus raudonųjų kraujo ląstelių ir žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių (panelė A ir B atitinkamai) po to, kai to LL-37 (apskritimai), WLBU2 (deimantus), ir CSA-13 (trikampiai), o po to inkubuojant 1 h 37 ° C temperatūroje. Skelbiami duomenys yra priemonė ± SD trijų eksperimentų. Morfologija žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių anksčiau (valdymas) ir po LL-37, WLBU2 ir CSA-13 gydymas buvo įvertintas fazinio kontrasto mikroskopu (skydelio C). Duomenys iš vienos reprezentatyvios eksperimento rodomi. Du kiti eksperimentai parodė panašius rezultatus.
Diskusijos
sėkmingo gydymo H. pylori
skrandžio infekcijos, pasiektą kombinaciją terapijos dviejų antibiotikų ir protonų siurblio inhibitorių rodiklis sumažėjo nuo daugiau nei 90% iki apie 80 % per pastarąjį dešimtmetį [27]. Be to, šio gydymo sąnaudos yra didelės, ir todėl daugiau plačiai turimų gydymui arba prevencijai H. pylori
infekcija poreikis vis dar egzistuoja [28]. Nauja agentai gydyti Helicobacter pylori
infekcijos yra būtina, taip pat dėl ​​to, didėja narkotikų pasipriešinimo problemas, kurias sukelia plačiai naudoti antibiotikų [29] ir prisitaikanti išgyvenimo mechanizmų patogeninių bakterijų neutralizuoti metu naudojamų antimikrobinių medžiagų. Pavyzdžiui, atsparūs amoksicilino, metronidazolo ir klaritromicino Helicobacter pylori
padermės buvo pranešta [30, 31]. Metodus, siekiant pagerinti gydymo H. pylori
gali būti vadovaujamasi įžvalgos į gamtinių mechanizmų, kuriais infekuotiems pacientams, kuriems atsakyti į šią bakteriją ir priežasčių, kodėl normalus priimančiosios gynybos mechanizmai nesugeba.
Šis tyrimas patvirtina ankstesnį pranešimą padidėjo hCAP-18 /LL-37 raiška skrandžio gleivinę, užsikrėtusiems H. pylori
[11]. Ši išvada rodo, kad didėja gamybos baktericidinis peptidų LL-37, gali vaidinti svarbų vaidmenį priimančiosios gynybos prieš H. pylori pervežimas [11]. Tačiau tai baktericidinis atsakas kai kurių dalykų yra nepakankamas ir H. pylori
infekcija dar gali pasiekti chronišką stadiją. Iš baktericidinį funkcija LL-37 šioje aplinkoje trūkumas rodo, kad padidėjo išraiška hCAP-18 /LL-37 peptido skrandžio gleivių užsikrėtusių dalykų gali turėti papildomų funkcijų, kaip priešuždegiminis ir augimą skatinantis agentas. Iš tiesų, jis buvo neseniai parodė, kad skrandžio opos gydymas žiurkėms yra skatinamas cathelicidin-tarpininkaujant transactivation epidermio augimo faktoriaus receptorių (EGFR) per transformuojančio augimo faktoriaus alfa (TGFα) signalinio kelio [32]. Arba praradimas ginantis nuo H. pylori
gali būti dėl nuostolių antibakteriniu funkcija LL-37 į skrandžio gleivinę aplinkoje. Todėl, dizainas antimikrobinių preparatų, kurie yra efektyvesni Šis nustatymas gali būti naudingas.
Motyvuotus immunohistological rezultatus, LL-37 veiklą prieš klinikinių izoliatų H. pylori parsisiųsti ir E. coli
MG1655 pagal biologiškai atitinkamos sąlygos buvo lyginamas su sintetinio peptidų WLBU2 ir ceragenin CSA-13. Šis tyrimas rodo, kad CSA-13, priešingai LL-37 ir WLBU2 peptidų, palaiko stiprų baktericidinį aktyvumą į muciną akivaizdoje ir po išankstinės inkubacijos su pepsino žemoje pH. Šios sąlygos sudaro unikalų problemas, susijusias su H. pylori
gydymo, nes šios bakterijos skrandyje yra apsaugotas nuo rūgščioje aplinkoje storu gleivių sluoksniu ir daug antimikrobinių vaistų veiksmingumas labai sumažėja rūgštaus pH [31]. Atitinkamai, pirmasis veiksmingas gydymo, skirto H. pylori
infekcija buvo santykinai pH-nejautrus antimikrobinių vaistų, tokių kaip bismuto, tetraciklinų ir metronidazolo [33] derinys. Be to, kaip skrandis periodiškai ištuština jo turinį (aktuali terapija linkęs būti skiedžiamas ir nuplaunamas) išvadą, kad CSA-13 turi baktericidinį poveikį esant daug mažesnėms koncentraciją tada LL-37, po to paties inkubacijos metu (3-6 val) [11] rodo, kad CSA-13 gali turėti gydomąjį potencialą gydyti Helicobacter pylori
infekcijos. Antibakterinis aktyvumas CSA-13, kuris turi mažesnį grynąjį mokestį ir unikalų pasiskirstymą šį mokestį per steroidų pastolių, kai, palyginti su LL-37 ir WLBU2 peptidų, taip pat buvo nustatyta, kad mažiau slopina mucino, išskirtas iš skrandžio gleivinės. Gydomąsias savybes remiantis CSA-13 gebėjimą išnaikinti H. pylori
taip pat remia pranešta anksčiau antibakteriniu aktyvumu prieš kitų bakterijų padermių, įskaitant klinikinių izoliatų Pseudomonas aeruginosa
[21] ir S. aureus
[22]. CSA-13 Unikali galimybė eiti į kompromisą bakterijų membranos vientisumą ir cheminė prigimtis šios mažos molekulinės masės junginys, kuris verčia mažinti išlaidas sintezę, palyginti su katijoninių antibakterinių peptidų rodo, kad CSA-13 arba galbūt kitas ceragenins turi potencialą gydyti H. pylori
infekcija, įskaitant tuos, kuriuos sukelia jos atsparių padermių.
Išvada
baktericidinį aktyvumą ceragenin CSA-13 yra palaikoma po išankstinės inkubacijos metu imituojant skrandžio sulčių ir į muciną buvimą. Ši in vitro
vertinimas rodo didelį potencialą šios molekulės gydant skrandžio gleivinės infekcijos.
Metodai
antibakterinių preparatų
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) ir WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) peptidai buvo įsigytas iš Bachem (King of Prussia, PA). CSA-13 buvo paruoštas kaip aprašyta anksčiau [34]. Amoksicilinas (AMX), klaritromicinas (CLR), tetraciklinas (TET) ir metronidazoliu buvo įsigytas iš Sigma.
Kolekcija skrandžio gleivinės ir tulžies mėginių
gastroskopijos metu atliekami arba su GIF V2 arba Q145 (Olympus) gastroscope, keletas skrandžio gleivinės gabaliukai buvo paimti iš prepyloric ir tekstynų regionuose skrandį. H. pylori
infekcija buvo įkurta biopsijos mėginių naudojant ureazės testą (CLO-testas). Žmogaus tulžyje buvo gautas iš pacientų, kuriems atliekama Cholecistektomijos tulžies pūslės. Mėginiai buvo filtras-sterilizuoti per 0,45 mkm membranos prieš, praskiesta PBS (1: 1) ir sumaišyti su antibakterinių agentų, naudojamų bakterijų žudymo tyrimų. Tyrimai patvirtino Balstogės medicinos universitetas etikos komiteto mokslinių tyrimų ir žmonėms bei gyvūnams, o visi pacientai davė informavo rašytinio sutikimo dalyvauti tyrime.
Imunohistocheminiais tyrimais
Imunohistocheminiais tyrimai buvo atlikti su formalinu fiksuoto, paraffin- įterptųjų žmogaus skrandžio gleivinės skyriai naudojant triušio prieš LL-37 antikūno (H-075-06, naudojama ne 1: 100 atskiesti; Phoenix Pharamceuticals Inc). Parafino-įdėta medžiagos buvo suskirstyta į 5 pm storio ir plūduriavo distiliuotą vandenį, esant 45 ° C temperatūroje. tada skyriai buvo sumontuoti ant skaidrių ir įdedamas į 57 ° C orkaitę naktį. Skyriai buvo deparaffinized pagal standartines procedūras ir skaldomas 0,9% vandenilio peroksido tirpalą metanolyje 30 minučių. Skyriai buvo inkubuojamos su pirminiais antikūnais 37 ° C temperatūroje 60 minučių, nuplauti 1% PBSA (1% BSA PBS) ir būtų vykdomas privalomas su antriniu antikūnu (biotinilinta ožkos anti-triušis IgG, 1: 400 praskiedimo). Amplifikacija buvo atliktas su Vectastain ABC rinkinys, ir HRP aptikimo sistema buvo naudojama colocalize peroksidazės aktyvumo su DAB substrato. Skyriai buvo counterstained hematoksilinu. Mėginiai buvo žiūrima su Nikon Eclipse 80 mikroskopu pagal 40 × priartinimas.
Vertinimas MIC ir MBC
minimaliai slopina koncentracija (MIC) tradicinių antibiotikų nuo septynių skirtingų klinikinių izoliatų H. pylori pervežimas (9 × 10 8 KSV /ml) nustatoma naudojant Müller-Hinton agaro (MH), kuriame yra 5% avies kraujo. Inkubacinis buvo tęsiamas 4 dienas 35 ° C temperatūroje, microaerophilic sąlygomis palaikomų su naudojimo Dujos Pakuotės Campylobacter dujų generuojančio rinkinio BR60. Klinikiniai izoliatai H. pylori
buvo laikomi atsparūs atitinkamų antibiotikų, kai MIC vertės buvo daugiau nei 4 g /ml AMX, 1 mikrogramo /ml CLR ir 16 mikrogramų /ml TET ir metronidazolo. Minimalus baktericidinis koncentracija (MKV) antibakterinių preparatų buvo įvertintas naudojant 10 8 KSV /ml užkrato. Po 6 valandų inkubacijos 37 ° C, 10 iL mėginiai pakabų buvo pastebėtas Kolumbijos agaras papildyta avių kraujo (5%).
Bakterijos žuvo tyrimą
baktericidinis veiklos LL-37, WLBU2 peptidais ir ceragenin CSA-13 prieš E. coli
MG1655 atsižvelgiant į muciną ar pepsino nuo kiaulių gleivių (Sigma) ir žmogaus tulžyje akivaizdoje buvo matuojamas kaip aprašyta anksčiau [35]. Bakterijos buvo auginamos vidurio-log etapo 37 ° C temperatūroje (kontroliuojamai pagal optinio tankio vertinimo esant 600 nm bangos ilgiui) ir resuspenduojamos PBS buferyje (pH = 7,4). tada bakterijas suspensijos buvo praskiedžiamas 10 kartų iš 100 pL tirpalais, kurių sudėtyje antibakterinių agentų patys arba su muciną (1000 mikrogramų /ml), arba tulžies (galutiniai 01:10 tulžies praskiedimo imituoja viršutinio plonosiose žarnose, į kurią tulžies yra aplinkos išskiriami [36] (pH = 7,4)). Kitoje eksperimentų serija antibakterinis veikla iš šių komponentų buvo nustatomas po jų išankstinės inkubacijos imituoti skrandžio sulčių [36, 37], esant pH ~ 1,5 su ir be pepsino (0,5 mg /ml). Po to, kai inkubavimą bakterijų, kurios gali antibakterinių molekulių už vienos valandos 37 ° C temperatūroje, bakterijų suspensijos buvo dedamas ant ledo ir praskiestas nuo 10 iki 1000- kartus. Mėginiai, kiekvieno praskiedimo (10 pl) buvo pastebėtas LB agaro lėkštelėse per naktį kultūros 37 ° C temperatūroje. Kolonijų prie kiekvieno praskiedimo skaičius buvo skaičiuojamas kitą rytą. Į kolonijas sudarančių vienetų (KSV /ml) atskirų mėginių buvo nustatyti iš praskiedimo koeficiento.
Masių spektrometrija
analitinės apibūdinimo buvo atliktas CSA-13 ir LL-37 pakabų po 3H inkubacijos su pepsino (0,5 mg /ml) esant mažam pH (~ 1,5) esant 37 ° C, naudojant Shimadzu (Kolumbija, MD) priemonę (LC-MS sistemą sudaro LC-20AB tirpiklio tiekimo sistema ir sIL-20A automatinio mėginių sujungtas su dvigubos bangos UV-VIS detektoriumi ir LCMS 2010EV vieno masių spektrometras), sujungtas su Shimadzu Premier "C18 kolonėlę (150 mm x 4.6 mm id, 5 mkm dalelių dydis). Judančiosios fazės srauto greitis buvo 1 ml /min su pradinę santykis 90% judančiosios fazės A (vandens) ir 10% judančiosios fazės B (acetonitrilo) tiek su 0,1% (v /v) skruzdžių rūgštimi. Analizės metodas sudarė šių veiksmų: (i) mėginio įpurškimo ir ūkyje B 10% 5 min, (ii) gradiento nuo 10% iki 90% B per 15 minučių, (III), turintys ne B 90% 5 minučių, (iv) izokratinis žingsnis B 10% ir turintis 5 minutes iki kito mėginio įpurškimo įrenginį. Masių spektrometrija buvo atliktas eliuatu naudojant elektropurkštuviniu jonizacijos (ESI) teigiamą jonų režimu skenuotą m /z intervale nuo 160-2000.
Eritrocitų lizę
hemoliziniu veiklos LL-37, WLBU-2 ir CSA-13 (0-200 μ
g /ml), prieš žmogaus raudonieji kraujo kūneliai (RKK) buvo išbandytas naudojant eritrocitus sustabdytas PBS. RBC paruošti iš šviežios kraujyje (hematokrito ~ 5%) buvo inkubuojami 1 h 37 ° C temperatūroje po to bandymo molekulių. Santykinis hemoglobino koncentracija supernatantų po centrifugavimo, esant 2000 × g buvo stebimas matuojant absorbciją prie 540 nm bangos ilgiui. 100% hemolizės buvo paimtas iš mėginių, kuriuose 2% buvo pridėta Triton X-100
ląstelių kultūros
žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląsteles. (ATCC; BEL-1739) buvo palaikomi DMEM (BioWhittaker) kultūros papildytas 10% šilumos -inactivated vaisiaus jaučio serumo (Hyclone) 37 ° C temperatūroje ir 5% CO 2. Dėl LDH spaudai tyrimas ir mikroskopo vertinimo ląstelės buvo padengtą 24 duobučių lėkštelėse ir išaugo iki santakos. Visuose eksperimentuose, vidutinės buvo pakeistas į laikmeną be serumo ~ 12 valandų prieš skiriant ląstelių gydymą su LL-37, WLBU2 ir CSA-13 (0-200 g /ml) atskirais šulinių, 1 valandą. tada Ląstelių kultūros terpė buvo surinkta, centrifuguoti (10 min, 5000 rpm, RT) ir veikiamas LDH vertinimo (LDH-citotoksiškumo prabavimo rinkiniu; BioVision Inc.) pervežimas deklaracijų
nusipelniusieji
Šis darbas buvo remiamas NIH suteikti HL067286 ir Balstogės medicinos universitetas suteikia 3-22458F ir 3-18714L
Autoriai "originalas pateiktas failai vaizdų
Žemiau išvardintos nuorodos į autorių originalus pateiktų failų vaizdų. 12866_2009_858_MOESM1_ESM.pdf Autorių originalus failas 1 pav 12866_2009_858_MOESM2_ESM.pdf Autorių originalaus failo 2 pav 12866_2009_858_MOESM3_ESM.pdf Autorių originalaus failo 3 pav 12866_2009_858_MOESM4_ESM.pdf Autorių originalus failas 4 pav 12866_2009_858_MOESM5_ESM.pdf Autorių originalaus failo 5 paveiksle konkuruojančių interesų
dr p Laukinis yra mokama konsultantas Ceragenix Pharmaceuticals, įgimto imuniteto Inc., ir WittyCell. Nė vienas iš tyrimų, pateikiama šiame dokumente parėmė Ceragenix Pharmaceuticals arba bet kuri kita verslo subjektas. Kiti autoriai: nė deklaruoti
.

• Vertinimas Lactobacillus gasseri K7 ir bifidobakterijų iš skrandžio perėjimo į žarnyną, naudojant vieną reaktoriaus modelį
• Balionas-užkimštas atgal transvenous užmiršimas skrandžio varices: tarp klinikinių rezultatų ir santykiai gastrorenal šuntas occlusion