L'activité bactéricide de l'cationique stéroïde CSA-13 et le peptide cathélicidine LL-37 contre Helicobacter pylori dans les activités gastriques simulés juice

bactéricides de type cationique stéroïde CSA-13 et le peptide cathélicidine LL-37 contre Helicobacter pylori
dans le suc gastrique simulé
Résumé de l'arrière-plan
l'apparition dans le monde de souches résistantes aux médicaments de H. pylori
motive la recherche de nouveaux agents ayant un potentiel thérapeutique contre cette famille de bactéries qui colonise l'estomac, et est associée au développement de l'adénocarcinome . Cette étude a été conçue pour évaluer in vitro
l'anti-H. pylori de potentiel de cathelicidin LL-37 peptide, qui est naturellement présent dans le suc gastrique, son WLBU2 analogique synthétique optimisée, et l'agent antibactérien non-peptide ceragenin Résultats de la CSA-13.
En accord avec les études antérieures , une expression accrue de hCAP-18 /LL-37 a été observée dans la muqueuse gastrique obtenu à partir de H. pylori
sujets infectés. MBC (concentration minimale bactéricide) des valeurs déterminées dans la gamme de milieux contenant des éléments nutritifs-1-800 pg /ml pour LL-37, 17,8 à 142 pg /ml pour WLBU2 et 0.275-8.9 pg /ml pour ceragenin CSA-13. Ces données indiquent une activité antibactérienne importantes, mais très différents contre des isolats cliniques de H. pylori
. Après incubation dans le suc gastrique simulé (pH faible avec présence de pepsine) CSA-13, mais pas LL-37 ou WLBU2, a conservé une activité antibactérienne. Par rapport à LL-37 et WLBU2 peptides CSA-13 a également une activité plus résistante à l'inhibition par l'hôte isolée mucine gastrique.

Conclusion Ces résultats indiquent que les agents antimicrobiens à base d'acide cholique tels que CSA-13 résistent à la dégradation protéolytique et l'inhibition par la mucine et ont un potentiel pour le traitement de H. pylori
infections, y compris celles causées par les souches de clarithromycine et /ou métronidazole résistant.
fond
Helicobacter pylori
est porté par plus de la moitié de la population adulte dans le monde [1]. Elle peut chroniquement coloniser la muqueuse gastrique humaine, où il se trouve dans la couche de mucus et adhère aux cellules épithéliales [2]. Bien que la plupart des sujets infectés restent asymptomatiques, l'infection par H. pylori
peut promouvoir une gastrite sévère [3] et d'augmenter considérablement le risque de tumeurs malignes gastriques [4, 5]. Certaines études épidémiologiques, l'éradication de Helicobacter pylori a été révélé efficace dans la prévention du cancer gastrique [6, 7]. En outre, l'éradication de H. pylori a été trouvé pour réduire l'incidence et la sévérité des lésions ayant un potentiel cancérogène dans des modèles animaux [8, 9]. des mécanismes naturels qui protègent l'hôte contre les infections à H. pylori dépendent de la fonction du système de défense innée dans laquelle les peptides anti-bactériens tels que la cathélicidine LL-37 [10, 11] et O-glycanes à la mucine gastrique [12] jouent un rôle clé.
LL-37 est un peptide traité par protéolyse dérivé du domaine C-terminal de la cathélicidine humaine (hCAP-18 /LL-37) qui est constitutivement libéré dans l'espace extracellulaire par les granulocytes et les cellules phagocytaires epitheliales [13] . Les fonctions attribuées aux LL-37 comprennent la prévention de la croissance bactérienne [14], la neutralisation de la molécule de la paroi bactérienne bioactivité [15], et l'activation des cellules hôtes par des récepteurs de membrane cellulaire spécifiques [16-18] de liaison. H. pylori
upregulates la production de LL-37 /hCAP18 par l'épithélium gastrique, ce qui suggère que cathelicidin ou ses dérivés LL-37 contribue à la détermination de l'équilibre entre la défense de la muqueuse de l'hôte et les mécanismes de survie de H. pylori de qui régissent chronique l'infection par ce pathogène gastrique [10, 11]. de peptides antibactériens cationiques (CAP) dont LL-37 ont été largement étudiés comme une source potentielle de nouvelles molécules antibactériennes. Le peptide conçu WLBU2 dont les résidus sont agencés pour former une structure en hélice amphipathique avec la charge optimale et la densité hydrophobe, permet de surmonter certaines limites de LL-37 naturelles telles que la sensibilité à Mg 2+ ou Ca 2+ et l'inactivation par le sang sérum [19]. Par conséquent WLBU2 pourrait traiter les infections où LL-37 est inefficace. Afin de générer des molécules capables de mimer la capacité de GAD pour compromettre l'intégrité de la membrane bactérienne, ceragenins non peptidiques avec cationiques, les structures à face amphiphile caractéristique de la plupart des peptides antimicrobiens ont été développés. Ceragenins tels que CSA-13 reproduisent la morphologie de la PAC requise à l'aide d'un échafaudage de l'acide biliaire et des groupes amine annexés [20]. Ils sont bactéricide contre les organismes Gram-positifs et Gram-négatives, y compris les bactéries résistantes aux médicaments tels que cliniquement pertinente résistant à la méthicilline Staphylococcus aureus (MRSA), et une étude de sensibilité précédente démontré que CSA-13 a une MIC 50 /MBC 50 rapport de 1 [21, 22]. Dans cette étude, on compare la puissance bactéricide de LL-37, WLBU2 et CSA-13 contre les isolats cliniques de H. pylori
. Les résultats suggèrent que imite à base d'acide cholique de peptide antimicrobien tel que CSA-13 ont un potentiel pour le traitement de l'infection à H. pylori, y compris celles causées par les souches de clarithromycine et /ou métronidazole résistant
. Résultats
immunohistochimique de sections de palpage muqueuse gastrique humaine avec l'anti-hCAP-18 /LL-37 anticorps
images microscopiques des biopsies muqueuses après une évaluation immunohistochimique avec des anticorps anti-hCAP-18/37 LL-anticorps sont présentés sur la figure 1. La DAB- une coloration positive indique la présence de LL-37 peptide et /ou de sa protéine parente hCAP-18. Haute intensité DAB coloration (indiqué par la couleur brune) aux cellules épithéliales mucus produisant et les glandes fundiques indique une accumulation élevée de peptide hCAP-18 /LL-37 très probablement entraîné par LL-37 interaction spécifique avec la mucine, qui a été rapporté dans les études précédentes [23, 24]. La répartition des hCAP-18 /LL-37 dans la population de cellules épithéliales plus différenciée de la muqueuse gastrique est différente de celle observée pour les β-défensines humaines 2 [10] ou le lysozyme [25], mais est similaire à celle observée dans le côlon [26 ]. Des biopsies de la muqueuse gastrique à partir de patients infectés par H. pylori
montrent plus forte intensité de la coloration DAB par rapport à celles obtenues chez des sujets non infectés. Selon les rapports précédents, ce résultat indique une réponse de défense de l'hôte à H. pylori
[11], qui est en partie basée sur une expression accrue de hCAP-18 /LL-37 par les cellules épithéliales gastriques. Figure 1 Présence de hCAP-18 /LL-37 peptide dans les biopsies de la muqueuse de l'estomac humain détecté en utilisant l'analyse immunohistochimique avec des anticorps monoclonaux à CAP-18 humaine /LL-37. Les échantillons A /B et C /D représentent les échantillons obtenus à partir de pylori
sujets non infectés et infectés H. respectivement. Les données présentées sont représentatives de cinq expériences.
L'activité bactéricide de LL-37, WLBU-2 peptides et ceragenin CSA-13 contre différentes souches de H. pylori
Pour identifier les souches résistantes, des isolats cliniques de H.
pylori ont été soumis à une évaluation de la CMI (tableau 1) avec plusieurs antibiotiques actuellement utilisés dans le traitement clinique de l'infection par H. pylori. Parmi les sept isolats testés obtenus à partir de différents sujets, la souche 4 était résistante au métronidazole et souches 5, 6, 7 ont été résistants à la fois le métronidazole et la clarithromycine. Tous les isolats étaient sensibles à l'amoxicilline et la tétracycline. Conformément aux précédents rapports sur les effets de hBD-1, h-BD-2 et LL-37 peptides contre H. pylori
[10, 11] toutes les souches isolées de H. pylori
ont été tués après 6 heures d'incubation avec LL-37, WLBU2 et CSA-13 avec moyenne MBC (pg /ml) des valeurs de 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 et 0,31 ± 0,25 lorsque la MBC a été évaluée dans un tampon HEPES, ou 300 ± 232 53 ± 41 2,98 ± 3,11 et quand MBC a été évaluée dans un bouillon Brucella Lingot respectivement (figure 2). L'évaluation des valeurs MBC en tampon HEPES avec addition de 2 mM MgCl 2 pour H. pylori
ATCC 43504 a révélé une augmentation de huit fois pour LL-37, et quatre fois plus pour les deux WLBU2 et CSA-13 (données ne pas montrer). Figure 2 L'activité bactéricide contre H. pylori. concentration minimale bactéricide (MBC) de LL-37 (colonne blanche), WLBU2 (colonne grise) et CSA-13 (colonne noire) contre H. pylori
(ATCC 43504 souche et sept isolats cliniques obtenus à partir d'échantillons de la muqueuse de différents sujets ) évalué dans HEPES (panneau A) ou Brucella Broth bulion (panneau B). MBC indique des concentrations auxquelles les composés éradiquer complètement un inoculum de H. pylori
.
Tableau 1 Évaluation de la sensibilité des souches cliniques de H. pylori
aux antibiotiques.
H. Les souches pylori
Antibiotiques
AMX
CLR
TET de métronidazole
ATCC 43504
0,016
0,094
0,25
64,0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0.25
64,0 ®
1.0
96,0 ®
6
0,032
1.5 ®
1.5
32,0 ®
7
0,047
1.5 ®
2.0
48,0 ®
valeurs de CMI (pg /ml) (AMX-amoxicilline, CLR-clarithromycine, TET-tétracycline)
activité antibactérienne de LL-37, WLBU2 et CSA-13 après une pré-incubation à un pH bas avec de la pepsine ou de la mucine
En plus de l'inhibition connue de GAD activité antibactérienne par des cations divalents tels que Mg + et Ca2 2+, l'activité protéolytique de la pepsine peut aussi compromettre la fonction de la GAD dans l'environnement du suc gastrique avec la présence de mucine, et un faible pH. Pour faire face à cette possibilité, nous avons évalué l'activité antibactérienne contre Escherichia coli MG1655
après 3 heures de pré-incubation de LL-37, WLBU2 et CSA-13 dans le suc gastrique simulé par rapport à l'activité après leur pré-incubation dans du PBS à pH 7,4 . Avant de procéder à l'essai de destruction, le pH des échantillons à faible pH et un pH faible /pepsine a été ajusté à 7,4. L'activité antibactérienne des peptides de LL-37 et WLBU2 contre E. coli MG1655
n'a pas été sensiblement modifiée après la pré-incubation à un pH d'environ 1,5, mais il a été perdu après une pré-incubation à un pH d'environ 1,5 en présence de pepsine (figure 3A et 3B). En revanche, l'activité antibactérienne de la CSA-13 n'a pas varié en pré-incubation à un pH d'environ 1,5 avec ou sans pepsine (figure 3C). D'autre part, les activités bactéricides de tous les composants ont été compromises à divers degrés lorsqu'elle est testée en utilisant un test de bactéricidie en présence de mucine gastrique purifié. En étroite accord avec les résultats obtenus à partir de ce E. coli
étude MG1655, les valeurs MBC de LL-37 peptide évaluée après 1H pré-incubation avec un tampon à pH faible contenant de la pepsine ou la mucine a été augmenté, mais celles de CSA-13 étaient presque inchangées (Figure 3D). Tous les agents évalués ont perdu l'activité antibactérienne dans du PBS additionné de 10% de la bile humaine (une concentration qui ne gêne pas la bactérie E. coli MG1655
croissance - données non montrées). Ce résultat suggère que les propriétés physico-chimiques des molécules anti-bactériens favorisent leur insertion dans la bile lipoprotéine, limitant ainsi leur interaction avec la paroi bactérienne. Il n'y a eu aucune étude pour évaluer l'activité antibactérienne de CAPS dans le jus duodénal, mais ces résultats indiquent que le reflux de bile dans l'estomac peut interférer avec l'activité de GAD. Figure 3 L'activité antibactérienne contre E. coli MG1655 et H. pylori souche ATCC 43504. activité antibactérienne de LL-37 (tableau A), WLBU2 (panneau B) et CSA-13 (tableau C) contre E. coli MG1655
après pré-incubation (3 h à 37 ° C) dans du PBS (cercles vides), le jus gastrique simulé à pH ~ 1,5 (carrés), du jus gastrique simulé avec de la pepsine (losanges) suc gastrique simulé avec la mucine (triangles) et du PBS avec humaines bile (10%) obtenu à partir de la vésicule biliaire (cercle rempli). Les données présentées sont des moyennes ± écart type de trois à quatre expériences. MBC de LL-37 (colonne blanche) et CSA-13 (colonne noire) (panneau D) contre H. pylori
(ATCC 43504) après pré-incubation (1 h à 37 ° C) dans le suc gastrique simulé à pH ~ 1,5 (A) suc gastrique simulé avec de la pepsine (B) et en présence de mucine (C)
caractérisation analytique du LL-37 et CSA-13 après incubation avec de masse l'analyse par spectrométrie de pepsine (figure 4) montre que trois heures d'incubation avec les résultats de la pepsine dans une dégradation de LL-37. Cependant, à un pH faible, digestion à la pepsine est hautement spécifique et LL-37 clivage du peptide est limitée au site d'acides aminés hydrophobes. sites de clivage potentiels prédits par PeptideCutter http logiciel de caractérisation:.. //kr ExPASy org /tools /peptidecutter /, suggèrent que LL-37 digestion à la pepsine dans nos conditions expérimentales devrait libérer 11 produits, y compris les 3 peptides plus courts (RKSKEKIGKE, et FKRIVQRIKD LVPRTES). Ces prévisions sont conformes à l'analyse spectrale de masse, qui ne montre pas la présence de tout intact LL-37 restant après incubation avec de la pepsine à pH faible, mais ne révèle l'émergence de plusieurs nouveaux pics avec des temps de rétention. L'activité anti-bactérienne restante de LL-37 après traitement avec de la pepsine (figure 3A et 3D) dans les essais de mise à mort représente probablement l'activité résiduelle de ces fragments de LL-37. Contrairement à la dégradation observée de LL-37, CSA-13 caractérisation analytique n'a pas été modifié après incubation avec de la pepsine à pH faible. Figure 4 Masse d'analyse par spectrométrie. Masse L'analyse par spectrométrie de LL-37 (panneau A) et CSA-13 (panneau B) dans du PBS (courbe 1), un tampon à faible pH (courbe 2) et un tampon de faible pH avec présence de pepsine (courbe 3). Le chromatogramme ionique total (TIC) est présenté pour chaque état de l'échantillon avec un encart de masse à charge (m /z) spectres montrant l'intensité des pics TIC en boîte. Le poids moléculaire intact LL-37 est 4494, qui peut être observé avec des charges multiples (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 MW = 900, etc) en mode d'ions positifs. Le poids moléculaire de CSA13 est 678, qui peut être observé directement et avec des charges multiples. Les données d'une expérience sont présentés
. Toxicité des LL-37, WLBU2 et CSA-13 contre RBC et les cellules d'adénocarcinome humain
insertion non spécifique des peptides antibactériens et leurs imite dans les membranes des cellules hôtes peut entraîner une toxicité. Hôte membrane cellulaire perméabilisation peut être mesurée par la libération de protéines telles que l'hémoglobine et la LDH du cytosol vers l'espace extracellulaire. En évaluant l'hémoglobine et la libération de LDH (figure 5A et 5B), nous montrons aucune perméabilisation membranaire significative par tout molécules testées dans la gamme à laquelle ils ont une activité bactéricide dans des tampons salins (figure 2A, la figure 3). Cette conclusion a été confirmée par examen microscopique de la morphologie des cellules d'adénocarcinome montrant aucune différence visible entre les cellules témoins et ceux traités avec 10 pg /ml d'LL-37, ou WLBU2 CSA-13 (figure 5C). Toutefois, une augmentation du taux d'hémoglobine et de la libération de LDH a été observée avec une concentration croissante. Parmi les trois molécules testées, WLBU2 était l'agent hémolytique fort, mais chacun d'eux a montré la capacité similaire à compromettre l'intégrité de la membrane cellulaire d'adénocarcinome (figure 5B et 5C). CSA-13 concentrations bactéricides contre H. pylori
et E. coli MG1655
(figures 2A, 2B et 3C) évalué dans une solution saline de tampon, ainsi que des éléments nutritifs contenant étaient au-dessous de sa concentration minimale hémolytiques et au-dessous des concentrations provoquant un dysfonctionnement des adénocarcinomes les membranes cellulaires. Figure 5: Evaluation de la toxicité cellulaire. Hémoglobine et la libération de LDH des globules rouges humains et des cellules d'adénocarcinome gastrique humain (panneau A et B respectivement) après addition de LL-37 (cercles), WLBU2 (diamants) et CSA-13 (triangles), suivie d'une incubation pendant 1 h à 37 ° C. Les données présentées sont des moyennes ± SD de trois expériences. Morphologie des cellules humaines d'adénocarcinome gastrique avant (contrôle) et après LL-37, WLBU2 et CSA-13 traitement a été évaluée par microscopie à contraste de phase (panneau C). Les données d'une expérience représentative sont présentés. Rapport de deux autres expériences ont révélé des résultats similaires.
Le taux de réussite du traitement de H. pylori de l'infection de l'estomac, réalisé avec des thérapies de combinaison de deux antibiotiques et un inhibiteur de la pompe à protons a diminué, passant de plus de 90% à environ 80 % au cours de la dernière décennie [27]. En outre, le coût de ce traitement est significative, et par conséquent un besoin de moyens pour traiter ou prévenir une infection à H. pylori, plus largement disponibles existe toujours [28]. De nouveaux agents pour traiter les infections à H. pylori sont nécessaires aussi en raison de l'augmentation des problèmes de résistance aux médicaments provoqués par l'usage extensif d'antibiotiques [29] et les mécanismes de survie des bactéries pathogènes adaptatifs pour contrer les antimicrobiens utilisés actuellement. Par exemple, les souches de H. pylori résistantes à l'amoxicilline, le métronidazole et la clarithromycine ont été rapportées [30, 31]. Méthodes pour améliorer les traitements pour H. pylori
pourrait être guidée par un aperçu des mécanismes naturels par lesquels les patients infectés réagissent à cette bactérie et les raisons pour lesquelles les mécanismes normaux d'accueil de défense échouent.
Cette étude confirme un précédent rapport de augmenté hCAP-18 /LL-37 expression dans la muqueuse gastrique des sujets infectés par H. pylori
[11]. Cette découverte suggère que l'augmentation de la production du peptide LL-37 bactéricide peut jouer un rôle clé dans la défense de l'hôte contre H. pylori
[11]. Cependant, cette réponse bactéricide chez certains sujets est insuffisante et l'infection de H. pylori peut encore atteindre un stade chronique. L'absence de la fonction bactéricide de LL-37 dans ce contexte a suggéré que l'expression accrue de hCAP-18/37 LL-peptide dans le mucus gastrique des sujets infectés peuvent avoir des fonctions supplémentaires en tant qu'agent de stimulation anti-inflammatoire et de la croissance. En effet, il a été montré récemment que la guérison de l'ulcère gastrique chez des rats est favorisée par la transactivation à médiation par la cathélicidine des récepteurs du facteur de croissance épidermique (EGFR) par le facteur de croissance transformant alpha (TGFa), la voie de signalisation [32]. Sinon, la perte de la défense contre H. pylori
peut être due à une perte de fonction antibactérienne de LL-37 dans le milieu de la muqueuse gastrique. Par conséquent, la conception d'agents antimicrobiens qui sont plus efficaces dans ce cadre peut être bénéfique.
Motivé par les résultats immunohistologiques, l'activité de LL-37 contre les isolats cliniques de H. pylori
et le MG1655 de E. coli sous biologiquement conditions pertinentes a été comparée à celle du peptide synthétique WLBU2 et ceragenin CSA-13. Cette étude montre que CSA-13, contrairement aux LL-37 et les peptides de WLBU2, conserve une forte activité bactéricide en présence de mucine et après une pré-incubation avec de la pepsine à un pH bas. Ces conditions représentent des défis uniques liés au traitement de H. pylori, car ces bactéries dans l'estomac sont protégés de l'environnement acide par une couche de mucus épais et l'efficacité de nombreux médicaments antimicrobiens est grandement diminuée à un pH acide [31]. Par conséquent, la première thérapie efficace contre l'infection par H. pylori
est une combinaison de médicaments antimicrobiens relativement insensible au pH tels que le bismuth, la tetracycline et le metronidazole [33]. En outre, comme l'estomac se vide périodiquement son contenu (thérapie topique tend à être dilué et lavé) la constatation que CSA-13 a une activité bactéricide à beaucoup plus faible concentration alors LL-37, après le même temps d'incubation (3-6 heures) [11] suggère que les CSA-13 pourrait avoir un potentiel thérapeutique pour le traitement de l'infection par H. pylori. L'activité antibactérienne de la CSA-13, qui a une charge nette plus petite et une distribution unique de cette charge sur un échafaudage de stéroïdes en comparaison avec LL-37 et WLBU2 peptides, a également été trouvé pour être moins inhibés par mucine isolée de la muqueuse gastrique. Potentiel thérapeutique basée sur la capacité de la CSA-13 pour éradiquer H. pylori
est également soutenue par précédemment rapporté une activité antibactérienne contre d'autres souches de bactéries, y compris les isolats cliniques de [21] et S. aureus
Pseudomonas aeruginosa [22]. La capacité unique de CSA-13 pour compromettre l'intégrité de la membrane bactérienne et la nature chimique de ce composé à faible masse moléculaire qui se traduit par une baisse des coûts de la synthèse par rapport aux peptides antibactériens cationiques suggèrent que CSA-13 ou peut-être d'autres ceragenins ont un potentiel pour le traitement de H. pylori de l'infection, y compris celles causées par les souches résistantes.

Conclusion l'activité bactéricide de ceragenin CSA-13 est maintenue après une pré-incubation dans du suc gastrique simulé, et en présence de mucine. Cette évaluation in vitro
indique un potentiel important de cette molécule dans le traitement de l'infection de la muqueuse de l'estomac.
Méthodes
agents antibactériens
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) et WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) peptides ont été achetés auprès de Bachem (king of Prussia, PA). CSA-13 a été préparé comme décrit précédemment [34]. Amoxicilline (AMX), la clarithromycine (CLR), la tétracycline (TET) et métronidazole ont été achetés chez Sigma.
Collection d'échantillons gastriques muqueuses et des voies biliaires
Pendant gastroscopie, réalisée soit avec un V2 GIF ou Q145 (Olympus) gastroscope, plusieurs tranches de la muqueuse gastrique ont été prélevés dans les régions prépyloriques et corpus de l'estomac. l'infection de H. pylori a été créé dans les échantillons de biopsie à l'aide d'un test uréase (CLO-test). la bile humaine a été obtenue à partir de la vésicule biliaire des patients subissant une cholécystectomie. Les échantillons ont été stérilisés par filtration à travers une membrane de 0,45 um avant d'être dilué dans du PBS (1: 1) et on mélange avec les agents antibactériens utilisés dans l'élimination des bactéries dosages. Les études ont été approuvées par l'Université médicale du Comité d'éthique Bialystok pour la recherche sur les humains et les animaux, et tous les patients ont donné un consentement écrit pour la participation à l'étude.
Études immunohistochimiques
études immunohistochimiques ont été réalisées sur fixés à la formaline, paraffin- des sections intégrées humaines de la muqueuse gastrique à l'aide d'un contre-LL-37 anticorps de lapin (H-075-06, utilisé à la dilution 1: 100; Phoenix Pharamceuticals Inc.). matériaux enrobés de paraffine ont été sectionnés à une épaisseur de 5 um et flottaient sur l'eau distillée à 45 ° C. Les sections ont ensuite été montées sur des lames et placés dans 57 ° C du four pendant la nuit. Les sections ont été déparaffinées selon des modes opératoires standard et trempées avec 0,9% de peroxyde d'hydrogène dans du methanol pendant 30 minutes. Les sections ont été incubées avec l'anticorps primaire à 37 ° C pendant 60 minutes, lavées avec 1% de PBSA (1% de BSA dans du PBS), et on les soumet à une liaison avec un anticorps secondaire (chèvre biotinylé anti-IgG de lapin, dilution 1: 400). L'amplification a été réalisée avec un kit Vectastain ABC et un système de détection de HRP a été utilisé pour colocalisent activité de la peroxydase avec un substrat DAB. Les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline. Évaluation des échantillons ont été vus avec un Nikon Eclipse 80 microscope sous 40 × grossissement. De MIC et MBC
La concentration minimale inhibitrice (CMI) d'antibiotiques classiques contre sept isolats cliniques différents de H. pylori
(9 × 10 8 UFC /ml) a été déterminée en utilisant la gélose de Muller-Hinton (MH) contenant du sang de mouton à 5%. L'incubation a été poursuivie pendant 4 jours à 35 ° C dans des conditions microaérophiles entretenues avec utilisation d'un gaz Pack-Campylobacter générateur de gaz kit BR60. Les isolats cliniques de H. pylori
ont été considérés comme résistants aux antibiotiques respectifs lorsque les valeurs de CIM étaient supérieures à 4 ug /ml pour AMX, 1 pg /ml pour les CLR et 16 pg /ml pour le TET et le métronidazole. La concentration minimale bactéricide (MBC) d'agents antibactériens a été évaluée en utilisant un inoculum à 10 8 UFC /ml. Après une incubation de 6 heures à 37 ° C, 10 aliquotes des suspensions ont été déposées sur de la gélose Columbia au sang de mouton (5%).
Tuant des bactéries essai
Les activités bactéricides du LL-37, les peptides WLBU2 et ceragenin CSA-13 contre la MG1655 de E. coli en présence de la mucine ou de la pepsine de mucus de porc (Sigma) et de la bile humaine ont été mesurés comme décrit précédemment [35]. Les bactéries ont été cultivées jusqu'à la phase mid-log à 37 ° C (contrôlée par l'évaluation de la densité optique à 600 nm) et remises en suspension dans du tampon PBS (pH = 7,4). Les bactéries suspensions ont ensuite été diluées 10 fois dans 100 pi de solutions contenant des agents antibactériens par eux-mêmes ou avec mucine (1000 pg /ml), ou de la bile (les dernières 1:10 biliaires dilution imite l'environnement de l'intestin grêle dans laquelle la bile est sécrété [36] (pH = 7,4)). Dans une autre série d'expériences, l'activité antibactérienne de ces composants a été déterminée après leur préincubation dans du suc gastrique simulé [36, 37] à un pH d'environ 1,5 avec et sans pepsine (0,5 mg /ml). Après incubation des bactéries avec des molécules anti-bactériens pour une heure à 37 ° C, les suspensions bactériennes ont été placées sur de la glace et on les dilue 10 à 1000- fois. Aliquotes de chaque dilution (10 pi) ont été repérés sur des plaques LB Agar pour la culture pendant une nuit à 37 ° C. Le nombre de colonies sur chaque dilution a été compté le matin suivant. Les unités formant colonie (UFC /ml) des échantillons individuels ont été déterminés à partir du facteur de dilution
. La spectrométrie de masse
caractérisation analytique a été effectuée sur les suspensions de la CSA-13 et LL-37 après 3H incubation avec de la pepsine (0,5 mg /ml) à pH faible (~ 1,5) à 37 ° C, en utilisant la Shimadzu (Columbia, MD) appareil (le système LC-MS est composée d'un système de distribution de solvant LC-20AB et SIL-20A échantillonneur automatique couplé à double longueur d'onde du détecteur UV-Vis et un spectromètre de masse quadripolaire LCMS 2010EV), couplé à une colonne Shimadzu Premier C18 (150 mm x 4,6 mm, taille des particules 5 um). Le débit de la phase mobile était de 1 ml /min avec un rapport de départ de 90% de phase mobile A (eau) et 10% de phase mobile B (acétonitrile) à la fois avec 0,1% (v /v) d'acide formique. La méthode d'analyse est composée des étapes suivantes: (i) d'injection d'échantillon et de maintien à 10% de B pendant 5 min, (ii) un gradient linéaire de 10% à 90% de B sur 15 minutes, (iii) maintien à 90% de B pendant 5 minutes, (iv) une étape isocratique à 10% de B et maintien pendant 5 minutes avant l'injection de l'échantillon suivant. La spectrométrie de masse a été effectuée sur l'éluant à l'aide d'ionisation électrospray (ESI) en mode d'ions positifs avec une plage balayée m /z de 160 à 2000.
sang rouge lyse cellulaire
L'activité hémolytique du LL-37, WLBU-2 et CSA-13 (0-200 μ
g /ml) contre des globules rouges (RBC) humains a été testée en utilisant des erythrocytes en suspension dans du PBS. RBC préparée à partir de sang frais (hématocrite ~ 5%) ont été incubées pendant 1 h à 37 ° C après addition de molécules d'essai. la concentration d'hémoglobine dans le surnageant par rapport après centrifugation à 2000 x g a été surveillée en mesurant l'absorbance à 540 nm. 100% d'hémolyse a été prélevé des échantillons dans lesquels on a ajouté 2% de Triton X-100 cellules d'adénocarcinomes gastriques humaines de culture cellulaire.
(ATCC, CRL-1739) ont été maintenues dans du DMEM (BioWhittaker) culture supplémenté avec 10% de la chaleur -inactivated de sérum bovin fœtal (Hyclone) à 37 ° C et 5% de CO 2. Pour la LDH test de libération et d'évaluation des cellules au microscope ont été étalées dans des plaques à 24 puits et cultivées jusqu'à confluence. Dans toutes les expériences, le milieu a été changé pour un milieu sans sérum ~ 12 heures avant le traitement avec la cellule LL-37, WLBU2 et CSA-13 (0 à 200 pg /ml) dans chaque puits, pendant 1 heure. milieu de culture cellulaire a été ensuite recueilli, centrifugé (10 min, 5000 rpm, RT) et soumis à l'évaluation de la LDH (LDH-cytotoxicité Kit Assay; BioVision Inc.)
Déclarations Remerciements
Ce travail a été soutenu par le NIH accorder HL067286 et de l'Université médicale de Bialystok accorde 3-22458F et 3-18714L
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Dr P. Savage est un consultant rémunéré pour Ceragenix Pharmaceuticals, Innate Immune Inc. et Wittycell. Aucun de la recherche présentée dans le présent document a été soutenu par Ceragenix Pharmaceuticals ou par toute autre personne morale. D'autres auteurs: aucun de déclarer
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