Baktericid tevékenységét a kationos szteroid CSA-13 és a cathelicidin peptid LL-37 Helicobacter pylori elleni szimulált gyomornedv

Baktericid tevékenysége a kationos szteroid CSA-13 és a cathelicidin peptid LL-37 ellen Helicobacter pylori
szimulált gyomornedvben
Abstract
alapon
A világméretű megjelenése a gyógyszer-rezisztens törzseket a H. pylori
motiválja a keresés az új hatóanyagok terápiás potenciállal szemben ennek a családnak a baktériumok colonizes a gyomorban, és a kapcsolódó adenocarcinoma fejlődését. Ez a tanulmány célja az volt, hogy értékelje az in vitro katalógusa az anti-H. pylori katalógusa potenciálja cathelicidin LL-37 peptid, mely természetesen jelen lévő gyomorsav, optimalizált szintetikus analóg WLBU2, és a nem-peptid típusú antibakteriális szerrel ceragenin CSA-13. katalógusa Eredmények
megegyeznek a korábbi tanulmányok fokozott expressziója hCAP-18 /LL-37 volt megfigyelhető gyomornyálkahártya nyert H. pylori katalógusa fertőzöttekéhez. MBC (minimum baktericid koncentráció) értékeket meghatározni a tápanyag-tartalmú média tartomány 100-800 ng /ml LL-37, 17,8-142 ng /ml WLBU2 és ,275-8,9 ng /ml ceragenin CSA-13. Ezek az adatok azt jelzik, jelentős, de igen különböző antibakteriális hatást fejtenek ki klinikai izolátumok a H. pylori katalógusa. Az inkubálás után a szimulált gyomornedvben (alacsony pH a pepszin jelenlétében) CSA-13, de nem LL-37 vagy WLBU2, visszatartott antibakteriális aktivitást. Összehasonlítva a LL-37 és WLBU2 peptidek, CSA-13 aktivitás szintén jobban ellenáll a gátlás által izolált gazdasejt gyomor mucinok.
Következtetés
Ezek az adatok azt jelzik, hogy kólsav-alapú antimikrobiális szerek, mint CSA-13 ellenállni proteolitikus degradáció és a gátlás által mucin ki és potenciálisan kezelés a H. pylori katalógusa fertőzések, beleértve azokat is, által okozott klaritromicin és /vagy metronidazol-rezisztens törzsek.
alapon
Helicobacter pylori
által szállított több mint a fele a világ felnőtt lakosságának [1]. Meg lehet krónikusan megtelepedni az emberi gyomor nyálkahártya, ahol megtalálható a nyálka réteg és van ragasztva hámsejtek [2]. Bár a legtöbb fertőzött, de tünetmentes marad, fertőzés H. pylori katalógusa elősegítheti súlyos gyomorhurut [3], és jelentősen növeli a gyomor rosszindulatú [4, 5]. Egyes epidemiológiai vizsgálatok, a H. pylori
felszámolására kimutatták, hogy hatásos a gyomorrák megelőzésére [6, 7]. Továbbá, H. pylori
felszámolására találtuk, hogy csökkentse a előfordulása és súlyossága léziók karcinogén hatást állatmodellekben [8, 9]. Természetes mechanizmusok, amelyek védik a gazdaszervezetet a H. pylori
fertőzések függ a funkciója a veleszületett védelmi rendszer, amelyben az antibakteriális peptidek, mint például cathelicidin LL-37 [10, 11], és az O-glikánok a gyomor mucin [12] játszanak kulcsfontosságú szerepet.
LL-37 egy proteolitikusan feldolgozott származó peptid C-terminális domén a humán cathelicidin (hCAP-18 /LL-37), amely konstitutív módon megjelent, hogy az extracelluláris térbe fagocita granulociták és epiteliális sejtek [13] . Funkciók tulajdonítható, hogy az LL-37 tartalmaz megelőzési A bakteriális növekedés [14], a semlegesítés a bakteriális fal molekula bioaktivitást [15], és aktiválása gazdasejtek által kötő specifikus sejtmembrán receptorokhoz [16-18]. H. pylori katalógusa upregulálja előállítására LL-37 /hCAP18 a gyomornyálkahártya, ami arra utal, hogy cathelicidin vagy annak származékát LL-37 hozzájárul közötti egyensúly fogadó nyálkahártya védelemben és a H. pylori katalógusa túlélési mechanizmusok, amelyek a krónikus fertőzés ezen a gyomor kórokozó [10, 11].
kationos antibakteriális peptidek (CAPS), beleértve az LL-37 kimerítően vizsgálták mint potenciális forrása az új antibakteriális molekulák. A génsebészetileg WLBU2 peptid, amelynek maradékok vannak elrendezve, hogy amfipatikus spirális szerkezet optimális töltés és hidrofób sűrűség, legyőzi bizonyos korlátai természetes LL-37, például érzékenységet Mg 2+ vagy Ca 2+ és inaktiválása vér szérum [19]. Ezért WLBU2 lehetett fertőzések kezelésére, ahol LL-37 hatástalan. Annak érdekében, hogy létrehoz molekulákat képes utánozni sapkák "képessége, hogy kompromisszumot a bakteriális membrán integritásának, nem-peptid ceragenins kationos, facially amfifil struktúrák jellemző legtöbb antimikrobiális peptidek fejlesztettek ki. Ceragenins, mint CSA-13 reprodukálni a szükséges KAP morfológia segítségével epe-sav állványzat és a csatolt amincsoportok [20]. Ezek baktericid mind Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusok, beleértve a gyógyszer-rezisztens baktériumok, mint klinikailag releváns meticillin-rezisztens Staphylococcus aureus katalógusa (MRSA), és egy korábbi fogékonyság vizsgálat kimutatta, hogy a CSA-13 rendelkezik egy MIC 50 /MBC 50 arány 1 [21, 22]. Ebben a tanulmányban összehasonlítjuk a baktericid potenciáját LL-37, WLBU2 és CSA-13 ellen a klinikailag izolált H. pylori katalógusa. Az eredmények azt sugallják, hogy kólsav-alapú utánozza az antimikrobiális peptid, mint CSA-13 potenciális kezelésére a H. pylori katalógusa fertőzés, beleértve azokat, által okozott klaritromicin és /vagy metronidazol-rezisztens törzsek.
Eredmények
immunhisztokémiai tapintás az emberi gyomornyálkahártya szakaszok anti-hCAP-18 /LL-37 ellenanyag
mikroszkópos képek a nyálkahártya-biopsziák után immunhisztokémiai értékelése anti-hCAP-18 /LL-37 antitestet az 1. ábrán látható A DAB- pozitív festődés jelenlétét jelzi az LL-37 peptid és /vagy annak szülő fehérje hCAP-18. Nagy intenzitású DAB festést (jelzi barna színű) a nyálka-termelő hámsejtek és fundus mirigy jelzi magas felhalmozási hCAP-18 /LL-37 peptid valószínűleg hajtott LL-37 specifikus kölcsönhatás mucin, amelyet jelentettek a korábbi tanulmányok [23, 24]. A terjesztési hCAP-18 /LL-37 a differenciáltabb epiteliális sejtpopuláció a gyomornyálkahártya eltér talált emberi β-defenzin 2 [10] vagy lizozim [25], de hasonló a megfigyelt a vastagbélben [26 ]. A gyomor nyálkahártya biopsziát származó fertőzött betegek H. pylori
mutatnak magasabb intenzitású DAB festést, mint azok származó nem-fertőzött betegeknél. Szerint a korábbi jelentések, ez az eredmény azt jelzi, hogy a gazdaszervezet védekezését válasz H. pylori katalógusa [11], amely részben a megnövekedett expressziója hCAP-18 /LL-37 által gyomornyálkahártya-sejtek. 1. ábra jelenléte hCAP-18 /LL-37 peptid nyálkahártya származó biopsziák az emberi gyomorban kimutatható immunhisztokémiai analízis monoklonális antitestek humán CAP-18 /LL-37. Minták A /B és C /D képviseli a példányok nyert a nem fertőzött és H. pylori katalógusa fertőzöttekéhez volt. A bemutatott adatok reprezentatívak öt kísérletet.
Baktericid hatás LL-37, WLBU-2 peptidek és ceragenin CSA-13 ellen különböző törzsei H. pylori Matton azonosítása rezisztens törzsek, a klinikai izolátumok H. pylori
vetettük alá MIC értékelés (1. táblázat), több antibiotikum jelenleg használt klinikai kezelés a H. pylori katalógusa fertőzés. Közül hét vizsgált izolátumok nyert különböző tárgyak, törzs 4 rezisztens volt metronidazol és törzsek 5, 6, 7 rezisztens volt mind a metronidazol és klaritromicin. Mindegyik izolátum érzékeny volt amoxicillin és a tetraciklin. Összhangban van a korábbi jelentéseket hatásainak HBD-1, h-BD-2 és LL-37 peptid ellen H. pylori katalógusa [10, 11] minden elszigetelt törzsek H. pylori katalógusa öltek után 6 óra inkubáció az LL-37, WLBU2 és CSA-13 átlagos MBC (ng /ml) értékek 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 és 0,31 ± 0,25, amikor az MBC értékelték HEPES pufferben, vagy 300 ± 232, 53 ± 41 és 2,98 ± 3,11, amikor az MBC értékeltük Brucella Broth Bullion volt (2. ábra). Értékelése MBC értékek HEPES puffer hozzáadásával 2 mM MgCI 2 H. pylori katalógusa ATCC 43504 kiderült, nyolcszoros növekedést LL-37, és négyszeres növekedést mindkét WLBU2 és CSA-13 (az adatok nem mutatjuk). 2. ábra Baktericid aktivitás H. pylori ellen. A minimális baktericid koncentráció (MBC) LL-37 (fehér oszlop), WLBU2 (szürke oszlop) és CSA-13 (fekete oszlop) a H. pylori ellen katalógusa (ATCC 43504 törzs és hét klinikai izolátumok, amelyek a nyálkahártya-mintákból származó különböző tantárgyak ) értékelték HEPES (a panel), vagy Brucella-Broth Bulion (B panel). MBC jelzi koncentrációt, amely vegyületek teljes felszámolása oltóanyaggal H. pylori katalógusa.
1. táblázat értékelése érzékenység klinikai törzsek H. pylori katalógusa antibiotikumokkal. Katalógusa H. pylori törzsek katalógusa
Antibiotikumok Matton AMX katalógusa CLR katalógusa TET katalógusa metronidazol katalógusa ATCC 43504 katalógusa 0.016 katalógusa 0,094 katalógusa 0,25
64,0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ® katalógusa 5 katalógusa 0,25 katalógusa 64,0 ® katalógusa 1.0 katalógusa 96,0 ® katalógusa 6 katalógusa 0.032 katalógusa 1.5 ® katalógusa 1.5 katalógusa 32,0 ® katalógusa 7
0,047
1,5 ®
2.0
48,0 ®
a MIC-értékek (ig /ml) (AMX-amoxicillin, CLR-klaritromicin, TET-tetraciklin)
antibakteriális hatását LL-37, WLBU2 és CSA-13 után pre-inkubáció alacsony pH pepszinnel vagy mucin
Amellett, hogy ismert gátlása CAPS antibakteriális aktivitás által kétértékű kationok, mint a Mg 2+ és Ca 2+, a proteolitikus aktivitás pepszin is veszélyeztethetik CAPs funkció a gyomornedvben környezet jelenlétében mucinok, és az alacsony pH-n. Ennek megoldására lehetőség értékeltük az antibakteriális aktivitást az Escherichia coli
MG1655 3 óra után előinkubálás LL-37, WLBU2 és CSA-13 szimulált gyomornedvben képest aktivitás után pre-inkubáció PBS-ben, pH = 7,4 . Lefolytatása előtt a gyilkos vizsgálatban a pH-minták az alacsony pH-érték és az alacsony pH /pepszin-ját 7,4-en. Az antibakteriális aktivitását LL-37 és WLBU2 peptidek ellen az E. coli
MG1655 jelentősen nem változott után pre-inkubáció, pH = ~ 1,5, de elveszett után pre-inkubáció, pH = ~ 1,5 pepszin jelenlétében (3A és 3B ábrák). Ezzel szemben, az antibakteriális aktivitása CSA-13 változatlan volt pre-inkubáció, pH = ~ 1,5 vagy anélkül pepszinnel (3C, ábra). Másrészt, baktericid tevékenységét összes komponensek veszélybe különböző mértékben, ha a vizsgálat során, bakteriális megölő vizsgálattal jelenlétében tisztított gyomor mucin. Szoros egyetértésben nyert eredmények ezt az E. coli
MG1655 vizsgálatban MBC értékek LL-37 peptid után értékeltük 1H pre-inkubációs pufferrel alacsony pH tartalmazó pepszin vagy mucin növeltük, de ezek a CSA-13 volt közel változatlan (ábra 3D). Minden vizsgált szerek elveszett antibakteriális aktivitása PBS-ben, kiegészítve 10% humán epe (olyan koncentrációban, amely nem zavarja az E. coli
MG1655 növekedés - az adatokat nem mutatjuk). Ez az eredmény azt sugallja, hogy fizikai-kémiai tulajdonságait az antibakteriális molekulák elősegítik azok behelyezés epe lipoprotein, korlátozva ezzel azok kölcsönhatása a bakteriális falon. Nem volt vizsgálatban, antibakteriális aktivitását sapkák a duodenális lé, de ezek az eredmények azt jelzik, hogy epe reflux a gyomorba zavarhatják CAPS aktivitást. 3. ábra ellen antibakteriális hatású E. coli MG1655 és a H. pylori ATCC 43504. antibakteriális hatását LL-37 (A panel), WLBU2 (B panel), és a CSA-13 (C panel) E. coli elleni
MG1655 után pre-inkubáció (3 órán át 37 ° C-on) PBS-ben (üres körök), szimulált gyomornedv pH = ~ 1,5 (négyzetek), szimulált gyomornedv pepszinnel (rombuszok), szimulált gyomornedv mucin (háromszögek), és PBS-ben a humán epe (10%) kapjuk az epehólyag (teli kör). A bemutatott adatok átlag ± SD-három-négy kísérlet. MBC LL-37 (fehér oszlop), és CSA-13 (fekete oszlop) (D panel) a H. pylori ellen katalógusa (ATCC 43504), miután pre-inkubáció (1 órán át, 37 ° C), szimulált gyomornedvben pH = ~ 1,5 (a), szimulált gyomornedv pepszinnel (B) és jelenlétében mucin (C)
analitikai jellemzői LL-37 és CSA-13 inkubáció után pepszines
tömegspektrometriás analízissel (4. ábra), feltárja hogy három órás inkubálás pepszinnel eredményeket kiterjedt lebomlása LL-37. Azonban alacsony pH, pepszin emésztést erősen specifikus, és az LL-37 peptid hasítási korlátozódik a helyszínen hidrofób aminosavak. Potenciális hasító helyek által megjósolt PeptideCutter jellemzés szoftver http: //kr. Expasy. Org /tools /peptidecutter /, arra utalnak, hogy az LL-37 emésztéssel pepszin a mi kísérleti körülmények között el kell engedniük 11 termék, köztük 3 rövidebb peptidek (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD és LVPRTES). Ezek az előrejelzések összhangban vannak tömegspektrometriás elemzés, amely nem mutatja a jelenléte olyan intakt LL-37 maradék inkubálás után pepszines alacsony pH, de nem mutatják a megjelenése több új csúcsok különböző retenciós időket. A fennmaradó antibakteriális aktivitását LL-37 kezelést követően pepszinnel (3A és 3D) a leölés vizsgálatokban valószínűleg képviseli a maradék aktivitás ezeknek az LL-37 töredékek. Ellentétben a megfigyelt lebomlási LL-37, CSA-13 analitikai jellemzését nem változott az inkubálás után pepszines alacsony pH. 4. ábra A tömegspektrometriás analízis. A tömegspektrometriás analízis LL-37 (A panel) és CSA-13 (B panel) PBS-ben (1. görbe) alacsony pH-jú pufferrel (2. görbe) és alacsony pH-jú pufferrel a pepszin jelenlétében (3. görbe). A teljes ion kromatogram (TIC) kerül bemutatásra az egyes minták állapot egy süllyesztés tömeg-to-töltés (m /z) spektrumokat mutatja intenzitás a dobozos TIC csúcsokat. A molekulatömege ép LL-37 4494, mely lehet megfigyelni több díjak (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 MW = 900, stb.), Pozitív ion módban. A molekulatömege CSA13 678, amely közvetlenül megfigyelhető, és több díjakat. Az adatok egy kísérlet mutatja. Katalógusa toxicitás LL-37, WLBU2 és CSA-13 ellen RBC és humán adenokarcinóma sejtek
nem specifikus behelyezése antibakteriális peptidek és utánozza a gazdasejt membrán okozhat toxicitást. Host sejtmembrán permeabilizálás mérhető felszabadulása által fehérjék, mint például a hemoglobin és az LDH a citoszolban az extracelluláris térbe. Kiértékelésével hemoglobin és LDH felszabadulást (ábra 5A és 5B), akkor nem mutat jelentős permeabilizációját bármely vizsgált molekulák a tartomány, amelyen ezek baktericid aktivitást sóoldatban puffereket (2A ábra, 3. ábra). Ezt a megállapítást megerősítette mikroszkópos értékelést adenokarcinóma sejt morfológiája nem mutat látható különbség a kontroll sejtek és az említett kezelt 10 ng /ml-LL-37, WLBU2 vagy CSA-13 (5C). Azonban a növekedés a hemoglobin és LDH kibocsátás volt megfigyelhető koncentráció növekedésével. A három molekulákat tesztelt, WLBU2 volt a legerősebb hemolitikus ügynök, de mindegyikük mutatott hasonló kompromisszumkészség adenokarcinóma sejtmembrán integritását (5B ábra és 5C). CSA-13 baktericid koncentrációk H. pylori ellen
és az E. coli
MG1655 (2A, 2B és 3C) értékelték sóoldatban, valamint a tápanyag tartalmú puffer alatt voltak a minimális hemolitikus koncentrációja és az alábbi koncentrációkat okozó diszfunkció adenocarcinoma sejtmembránon. 5. ábra értékelése sejt toxicitást. Hemoglobin és LDH felszabadulást humán vörösvérsejtek és a humán gyomor adenokarcinóma sejteket (panel, illetve a B.) hozzáadása után az LL-37 (körök), WLBU2 (rombuszok), és CSA-13 (háromszögek), majd az inkubálást 1 órán 37 ° C-on. A bemutatott adatok átlag ± SD-három kísérlet. Morfológia Az emberi gyomor adenokarcinóma sejtek előtt (kontroll) és után LL-37, WLBU2 és CSA-13 kezelés értékeltük fáziskontraszt-mikroszkóppal (C panel). Az adatok egy reprezentatív kísérletből látható. Két másik kísérletek azt mutatták, hasonló eredményeket kaptunk.
Megbeszélés
Az arány a sikeres kezelés a H. pylori katalógusa gyomor fertőzés, elért kombinációs terápiák két antibiotikum és egy proton pumpa gátló csökkent több mint 90% és körülbelül 80 % az elmúlt évtizedben [27]. Ezen túlmenően, a költségek ez a terápia jelentős, és ezért szükség van több széles körben elérhető eszközök kezelésére vagy megelőzésére a H. pylori
fertőzés még mindig létezik [28]. Új kezelésére alkalmazott szerek a H. pylori
fertőzések szükséges is köszönhető, hogy egyre nagyobb gyógyszer-rezisztencia által okozott problémák kiterjedt antibiotikumok [29] és az adaptív túlélési mechanizmusok patogén baktériumok, hogy ellensúlyozzák a jelenleg használt antimikrobiális. Például, a H. pylori
rezisztens törzsek amoxicillin, metronidazol és klaritromicin számoltak [30, 31]. Módszerek javítása kezelések H. pylori katalógusa lehet vezérlik betekintést természetes mechanizmusokat, amelyek révén a fertőzött beteg reagál ez a baktérium, és miért a normális host-védelmi mechanizmus nem.
Ez a tanulmány megerősíti egy korábbi jelentésében fokozott hCAP-18 /LL-37 expresszió gyomornyálkahártya alanyok fertőzött H. pylori katalógusa [11]. Ez arra utal, hogy a termelés növelése a baktericid peptid LL-37 is fontos szerepet játszanak a gazdaszervezet védekezésében H. pylori ellen katalógusa [11]. Azonban ez a baktericid válasz bizonyos tárgyak nem elegendő, és a H. pylori fertőzés katalógusa még mindig elérheti a krónikus szakaszban. A hiányzó baktericid funkció az LL-37 ebben a beállításban azt javasolta, hogy a fokozott expressziója hCAP-18 /LL-37 peptid a gyomor nyálka fertőzött alanyok további funkciói lehetnek, mint egy gyulladáscsökkentő és növekedést stimuláló szer. Valóban, ez a közelmúltban kimutatták, hogy a gyomorfekély gyógyulását patkányokon elősegíti az cathelicidin közvetített transzaktiválását epidermális növekedési faktor receptorok (EGFR) keresztül a transzformáló növekedési faktor-alfa (TGFa) jelátviteli [32]. Alternatív módon, a veszteség elleni védelem H. pylori
oka lehet, hogy veszteséget antibakteriális funkció az LL-37 a miliőt a gyomor nyálkahártyáját. Következésképpen, design antimikrobiális hatóanyagok, amelyek hatékonyabbak ebben a közegben is előnyös lehet.
Motiválja immunhisztokémiai eredmények, a tevékenység LL-37 elleni klinikai izolátumot H. pylori katalógusa és E. coli katalógusa MG1655 alatt biológiailag releváns körülmények összehasonlítottuk a szintetikus peptid WLBU2 és a ceragenin CSA-13. Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a CSA-13, ellentétben azzal, LL-37 és WLBU2 peptidek, fenntartja erős baktericid aktivitás jelenlétében mucin és után előinkubálás pepszinnel alacsony pH. Ezek a feltételek képviselik egyedülálló kapcsolatos kihívások a H. pylori
kezelés, mivel ezek a baktériumok a gyomorban védve vannak a savas környezet egy vastag nyálka réteg és a hatékonyságát sok antimikrobiális gyógyszerek nagyban csökken savas pH [31]. Ennek megfelelően az első hatásos terápia a H. pylori
fertőzés volt kombinációja viszonylag pH-érzéketlen antimikrobiális gyógyszerek, mint a bizmut, tetraciklin és metronidazol [33]. Ezen túlmenően, mivel a gyomor időszakosan kiüríti a tartalmát (helyi kezelést általában hígítani kell, és vízzel ki) az a megállapítás, hogy a CSA-13 baktericid aktivitása sokkal alacsonyabb koncentráció majd LL-37, miután az azonos inkubációs idő (3-6 óra) [11], azt sugallja, hogy a CSA-13 lehet a terápiás potenciál kezelésére a H. pylori katalógusa fertőzés. Az antibakteriális aktivitását CSA-13, amely egy kisebb nettó töltés és egy egyedi eloszlása ​​Ez a töltés egy szteroid állvány képest LL-37 és WLBU2 peptidek, úgy találták, hogy kevésbé gátolta mucin izolált gyomor nyálkahártyáját. Terápiás potenciál alapján képes a CSA-13 felszámolása a H. pylori
is alátámasztják azt korábban jeleztük antibakteriális aktivitását más baktériumok ellen törzsek, beleértve a klinikai izolátumok Pseudomonas aeruginosa katalógusa [21], és a S. aureus katalógusa [22]. CSA-13 egyedülálló képessége, hogy kompromisszumot a bakteriális membrán integritását és a kémiai természetét az alacsony molekulatömegű vegyület, amely fordítja alacsonyabb költsége szintézis képest kationos antibakteriális peptidek azt sugallják, hogy a CSA-13 vagy talán más ceragenins potenciális kezelésére H. pylori
fertőzés, beleértve azokat is, okozta a rezisztens törzsek.
Következtetés
baktericid aktivitásának ceragenin CSA-13 után is fennmaradjon előinkubálás szimulált gyomornedvben és jelenlétében mucin. Ez az in vitro katalógusa értékelés azt mutatja, jelentős potenciállal ezen molekula kezelés a gyomor nyálkahártya fertőzés. Katalógusa módszerek
Antibakteriális szerek
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) és WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) peptideket vásárolt Bachem (porosz király, PA). CSA-13 állítjuk elő az előzőekben leírtak [34]. Amoxicillin (AMX), klaritromicin (CLR), tetraciklin (TET), és a metronidazol a Sigma.
Gyűjtemény gyomornyálkahártya és az epe mintákat
során gasztroszkópiával végzett vagy egy GIF-V2 vagy Q145 (Olympus) gastroszkóppal, több gyomor nyálkahártya szeleteket vettünk a prepyloric és corpus régióiban a gyomorban. H. pylori katalógusa fertőzés alakult ki a biopsziás minták segítségével ureáz teszt (CLO-teszt). Humán epében kapunk az epehólyag átesett betegek cholecystectomiát. A mintákat szűréssel sterilizált 0,45 um-es membránon, mielőtt hígítva PBS-ben (1: 1), és összekeverjük antibakteriális szerek felhasznált baktériumölő vizsgálatokban. A vizsgálatok által jóváhagyott Medical University of Bialystok Etikai Bizottság Kutatási emberekre és az állatokra, és minden beteg adta tájékoztatta írásos hozzájárulás a kísérletben részt vegyenek.
Immunhisztokémiai vizsgálatok katalógusa immunhisztokémiai vizsgálatokat hajtottunk végre formalin-fixált, paraffinba ágyazott humán gyomor nyálkahártya szakaszok segítségével nyúl anti-LL-37 antitest (H-075-06, használt 1: 100 hígításban; Phoenix Pharamceuticals Inc.). Paraffinba ágyazott anyagokat metszeteket 5 jim vastagságú és lebegtek a desztillált vizet 45 ° C-on. Metszeteket ezután szerelt diák és helyezzük 57 ° C-os sütőben egy éjszakán át. A metszeteket paraffint standard eljárások szerint, és befagyasztjuk 0,9% hidrogén-peroxiddal metanolban 30 percig. A metszeteket primer antitesttel inkubáltuk 37 ° C-on 60 percig, mostuk, 1% PBSA (1% BSA PBS-ben), és vetjük alá kötő másodlagos antitesttel (biotinilezett kecske anti-nyúl IgG-t, 1: 400 hígítás). Az amplifikációt végeztünk egy Vectastain ABC kit, és egy HRP kimutatási rendszert használunk a colocalize peroxidáz aktivitást a DAB szubsztráttal. A metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük. A mintákat nézett Nikon Eclipse 80 mikroszkóp alatt 40 × nagyítással. Katalógusa értékelése MIC és MBC
A minimális gátló koncentráció (MIC) a hagyományos antibiotikumokkal szembeni hét különböző klinikai izolátumainak H. pylori katalógusa (9 × 10 8 CFU /ml) alkalmazásával határoztuk meg Muller-Hinton-agart (MH), amely 5% birkavér. Az inkubálást további 4 napon át 35 ° C-on mikroaerofil körülmények között tartjuk a használat során egy Gáz Pack-Campylobacter gázképző készlet BR60. Klinikai izolátumai H. pylori katalógusa tekintettük ellenálló megfelelő antibiotikumokkal, amikor a MIC értékek felett 4 ng /ml AMX, 1 ng /ml CLR és 16 ug /ml TET és a metronidazol. A minimális baktericid koncentráció (MBC) az antibakteriális szerek alkalmazásával értékeltük inokulumot 10 8 CFU /ml volt. Miután egy 6 órás inkubálás 37 ° C hőmérsékleten, 10 ul aliquot a szuszpenziókat foltos Columbia agar kiegészített Sheep Blood (5%).
Baktériumölő assay katalógusa A baktericid tevékenységét LL-37, WLBU2 peptidek és ceragenin CSA-13 E. coli elleni
MG1655 jelenlétében mucin vagy pepszinnel sertés nyálka (Sigma) és humán epében mértük a korábban leírtak [35]. A baktériumokat növesztjük a közép-log fázis 37 ° C hőmérsékleten (által irányított értékelésével optikai sűrűség 600 nm-en), és újraszuszpendáltuk PBS-pufferben (pH = 7,4). A baktériumokat szuszpenziókat azután hígítjuk, 10-szer 100 pl tartalmazó oldatok antibakteriális szerek önmagukban vagy mucin (1000 ng /ml), vagy epe (a végső 01:10 epe hígítás utánozza a környezet és a vékonybél felső amelybe epe szekretált [36] (pH = 7,4)). Egy másik kísérletsorozatban antibakteriális aktivitását ezen komponensek határoztuk követő előinkubálás szimulált gyomornedvben [36, 37], pH = ~ 1,5 és anélkül pepszin (0,5 mg /ml). Inkubálás után a baktériumokat az antibakteriális molekulák egy órán át 37 ° C-on, a bakteriális szuszpenziókat jégre helyeztük, és hígított 10-, hogy 1000- szeres. Aliquotjait az egyes hígítás (10 ul) cseppentjük LB-agar lemezeken egy éjszakán át 37 ° C-on. A telepek számát minden hígítási megszámoltuk a következő reggel. A telepképző egységek (CFU /ml) az egyes mintákat határozzuk meg a hígítási faktor.
Tömegspektrometria
analitikai jellemzés végeztünk a CSA-13 és LL-37 szuszpenziók után 3H inkubáció pepszin (0,5 mg /ml) alacsony pH (~ 1,5), 37 ° C-on, a Shimadzu (Columbia, MD) eszköz (az LC-MS rendszer egy LC-20AB oldószer-adagoló rendszer és a SIL-20A automatikus mintavevő kapcsolt kettős hullámhosszú UV-Vis detektorral és LCMS 2010EV egyetlen kvadrupol tömegspektrométer), amelyhez egy Shimadzu Premier C18 oszlopon (150 mm x 4,6 mm ID, 5 um részecskeméret). A mobil fázis áramlási sebessége 1 ml /perc sebességgel egy kiindulási aránya 90% mozgó fázisú A (víz) és 10% 'B' mozgófázis (acetonitril) mind a 0,1% (v /v) hangyasavval. Az analitikai módszer abból állt, a következő lépéseket: (i) a minta injektálása és tartja meg a 10% B 5 percen keresztül, (ii) a lineáris gradiens 10% -tól 90% B 15 perc alatt, a (III) gazdaság 90% B 5 perc, (iv) izokratikus lépésben 10% B és tartja 5 percig, mielőtt a következő minta injektálása. Tömegspektrometria végeztünk az eluenst vettük fel elektrospray ionizációt (ESI) alkalmazva pozitív ion módban egy beolvasott m /z tartomány 160-2000.
Vörösvérsejt lízis katalógusa A hemolitikus aktivitása LL-37, WLBU-2 és CSA-13 (0-200 μ
g /ml), az emberi vörösvérsejtek (RBC) teszteltük eritrociták PBS-ben szuszpendáljuk. RBC készített friss vért (hematokrit ~ 5%) inkubáltuk 1 órán át 37 ° C-on hozzáadása után a vizsgálati molekulákat. Relatív hemoglobin koncentráció a felülúszókat centrifugálás után 2000 x g sebességgel mérésével követtük nyomon az abszorbanciát 540 nm-en. 100% -os hemolízist vettünk mintát, amelyben 2% Triton X-100-at adtunk.
Sejttenyészet
humán gyomor adenokarcinóma sejteket (ATCC; CRL-1739) tartottunk fenn DMEM-ben (BioWhittaker) kultúra, kiegészítve 10% hővel -inactivated magzati marhaszérummal (Hyclone), 37 ° C-on és 5% CO 2. Az LDH felszabadulás vizsgálatban és mikroszkóp értékelés sejteket szélesztettünk 24 mérőhelyes lemezeken, és összenőtt. Mindegyik kísérletben a tápközeget kicseréltük szérummentes tápközegben ~ 12 H előtt sejtkezelés LL-37, WLBU2 és CSA-13 (0-200 ng /ml) az egyes kutak, 1 órán át. Cell táptalajt összegyűjtjük, centrifugáljuk (10 perc, 5000 rpm, RT), és alávetni LDH értékelés (LDH-citotoxicitás vizsgáló Kit; BioVision Inc.) hotelben nyilatkozatok katalógusa Köszönetnyilvánítás katalógusa Ezt a munkát támogatott NIH megadja HL067286 és Medical University of Bialystok ad 3-22458F és 3-18714L katalógusa Szerzők eredeti beküldötteknek képeket
alábbiakban a linkeket a szerzők eredeti beküldötteknek képeket. 12866_2009_858_MOESM1_ESM.pdf A szerzők eredeti fájlt az 1. ábra szerinti 12866_2009_858_MOESM2_ESM.pdf A szerzők eredeti fájl 2. ábrán 12866_2009_858_MOESM3_ESM.pdf A szerzők eredeti fájl 3. ábra 12866_2009_858_MOESM4_ESM.pdf A szerzők eredeti fájl 4. ábra 12866_2009_858_MOESM5_ESM.pdf A szerzők eredeti fájl 5. ábra versengő érdekek katalógusa Dr. P. Savage egy fizetett tanácsadója Ceragenix Pharmaceuticals, Inc. veleszületett immunrendszer, és WittyCell. Egyik kutatás számolt ebben a tanulmányban támogatott Ceragenix Pharmaceuticals vagy bármely más vállalati egység. Más szerzők: nincs nyilatkozni. Katalógusa

• Értékelése a folyosón a Lactobacillus gasseri K7 és bifidobaktériumok a gyomorból a belek használatával egyetlen reaktorban model
• Balloon-elzárjuk retrográd vénás kiirtását gyomor varix: a kapcsolat a klinikai eredmények, valamint gastrorenal shunt occlusion