Bactericide activiteiten van de kationische steroid CSA-13 en cathelicidin peptide LL-37 tegen Helicobacter pylori in gesimuleerd maagsap

Bacteriedodende activiteiten van de kationische steroid CSA-13 en de cathelicidin peptide LL-37 tegen Helicobacter pylori
in gesimuleerd maagsap
Abstracte achtergrond
De wereldwijde verschijning van resistente stammen van H. pylori
motiveert een zoektocht naar nieuwe middelen met therapeutisch potentieel tegen deze familie van bacteriën die de maag koloniseert, en wordt geassocieerd met adenocarcinoom ontwikkeling. Deze studie werd ontworpen om te beoordelen in vitro of the anti-H. pylori
potentieel van cathelicidin LL-37 peptide, dat van nature aanwezig is in maagsap, zijn geoptimaliseerde synthetisch analoog WLBU2, en de niet-peptide antibacterieel middel ceragenin CSA-13.
Resultaten
In overeenstemming met eerdere studies , verhoogde expressie van HCAP-18 /LL-37 werd waargenomen in maagslijmvlies afkomstig van H. pylori
geïnfecteerde patiënten. MBC (minimum bactericide concentratie) waarden bepaald voedingsstoffen bevattende media range 100-800 ug /ml voor LL-37, 17,8-142 ug /ml voor WLBU2 en ,275-8,9 ug /ml voor ceragenin CSA-13. Deze gegevens geven aan aanzienlijk, maar zeer uiteenlopende antibacteriële activiteiten tegen klinische isolaten van H. pylori
. Na incubatie in gesimuleerd maagsap (lage pH met aanwezigheid van pepsine) CSA-13, maar niet LL-37 of WLBU2, behield antibacteriële activiteit. Vergeleken met LL-37 en WLBU2 peptiden, CSA-13 activiteit ook beter bestand tegen remming door Geïsoleerde gastheercel maag mucinen.
Conclusie
Deze gegevens geven aan dat choline zuur gebaseerde antimicrobiële middelen zoals CSA-13 weerstaan ​​proteolytische afbraak en remming van mucine en potentie hebben voor de behandeling van H. pylori
infecties, waaronder die veroorzaakt door de clarithromycine en /of metronidazol-resistente stammen. achtergrond
Helicobacter pylori
wordt gedragen door meer dan de helft van 's werelds volwassen populatie [1]. Het kan chronisch koloniseren het menselijk maagslijmvlies, waarbij het wordt gevonden in de slijmlaag en gehecht aan epitheelcellen [2]. Hoewel de meeste geïnfecteerde patiënten asymptomatisch blijven, infectie met H. pylori
kan ernstige gastritis [3] bevorderen en significante toename van de kans op maag- maligniteiten [4, 5]. In sommige epidemiologische studies werd H. pylori
uitroeiing effectief gebleken in het maag-preventie van kanker te zijn [6, 7]. Daarnaast werd H. pylori uitroeiing
vonden de incidentie en de ernst van letsels met carcinogeniteit in diermodellen verlagen [8, 9]. Natuurlijke mechanismen die de host H. pylori infecties beschermen
afhankelijk van de functie van het aangeboren afweersysteem waarin antibacteriële peptiden zoals cathelicidin LL-37 [10, 11] en O-glycanen in gastrische mucine [12] spelen een sleutelrol.
LL-37 is een proteolytisch verwerkt peptide afgeleid van het C-terminale domein van humaan cathelicidin (HCAP-18 /LL-37), die constitutief de extracellulaire ruimte wordt vrijgegeven door fagocytische granulocyten en epitheelcellen [13] . Functies toegeschreven aan IL-37 omvatten het voorkomen van bacteriële groei [14], geneutraliseerd bacteriewand molecuul bioactiviteit [15], en activering van gastheercellen door binding specifieke celmembraan receptoren [16-18]. H. pylori
upregulates de productie van LL-37 /hCAP18 door de maag epitheel, wat suggereert dat cathelicidin of zijn derivaat LL-37 draagt ​​bij aan het bepalen van de balans tussen gastheer mucosale defensie en H. pylori
survival mechanismen die chronische regeren infectie met deze gastrische ziekteverwekker [10, 11].
Kationogene antibacteriële peptiden (CAP) met LL-37 zijn uitgebreid onderzocht als een mogelijke bron van nieuwe antibacteriële moleculen. De gemanipuleerde WLBU2 peptide waarvan resten zijn ingericht om een ​​amfipathische helixstructuur met een optimale lading en hydrofobe dichtheid te vormen, overwint een aantal beperkingen van de natuurlijke LL-37, zoals de gevoeligheid voor Mg 2+ of Ca 2+ en inactivatie door bloed serum [19]. Daarom kon WLBU2 infecties te behandelen waar de LL-37 is niet effectief. Om moleculen kunnen mogelijkheden CAP "bacteriële membraanintegriteit, niet-peptide ceragenins compromis met kationische nabootsen genereren facially amfifiele structuren kenmerk van de meeste antimicrobiële peptiden ontwikkeld. Ceragenins zoals CSA-13 te reproduceren het vereiste CAP morfologie met behulp van een gal-zuur steigers en de bijgevoegde aminegroepen [20]. Ze zijn bactericide tegen zowel Gram-positieve als Gram-negatieve organismen, waaronder geneesmiddelresistente bacteriën zoals klinisch relevante methicilline-resistente Staphylococcus aureus
(MRSA) en een eerdere gevoeligheid studie toonde aan dat CSA-13 heeft een MIC 50 /MBC 50 verhouding van 1 [21, 22]. In deze studie vergelijken we de bacteriedodende potentie van LL-37, WLBU2 en CSA-13 tegen klinische isolaten van H. pylori
. De resultaten suggereren dat cholinezuur-zure nabootsers antimicrobiële peptiden zoals CSA-13 potentieel hebben voor de behandeling van H. pylori
infecties, zoals die veroorzaakt door de clarithromycine en /of metronidazol-resistente stammen.
Resultaten
immunohistochemische sonderen van menselijke maagslijmvlies secties met anti-HCAP-18 /LL-37 antilichaam
Microscopische beelden van mucosale biopsies na immunohistochemische evaluatie met anti-HCAP-18 /LL-37 antilichaam worden getoond in figuur 1. De DAB- positieve kleuring duidt op de aanwezigheid van de LL-37 peptide en /of het oudereiwit HCAP-18. Hoge intensiteit DAB kleuring (aangegeven met bruine kleur) en slijmvormende epitheelcellen en fundus klieren geeft hoge accumulatie van HCAP-18 /LL-37 peptide waarschijnlijk veroorzaakt door LL-37 specifieke interactie met mucine, die in eerdere studies [23, 24]. De verdeling van HCAP-18 /LL-37 in de meer gedifferentieerde epitheelcel populatie van het maagslijmvlies verschilt van die gevonden voor humaan-β defensine 2 [10] of lysozyme [25], maar vergelijkbaar met die waargenomen in het colon [26 ]. Maagslijmvlies biopten van patiënten die geïnfecteerd zijn met H. pylori
tonen hogere intensiteit van DAB kleuring vergeleken met die verkregen uit niet-geïnfecteerde patiënten. Volgens eerdere berichten, dit resultaat geeft een afweer reactie op H. pylori
[11], die deels is gebaseerd op verhoogde expressie van HCAP-18 /LL-37 door de maag epitheelcellen. Figuur 1 Aanwezigheid van HCAP-18 /LL-37 peptide in mucosale biopsies van de menselijke maag gedetecteerd middels immunohistochemische analyse met monoklonale antilichamen tegen humaan CAP-18 /LL-37. Monsters A /B en C /D vertegenwoordigt de monsters respectievelijk verkregen uit niet-geïnfecteerde en H. pylori geïnfecteerde patiënten
. De getoonde gegevens zijn representatief voor vijf experimenten.
Bactericide activiteit van LL-37, WLBU-2 peptiden en ceragenin CSA-13 tegen verschillende stammen van H. pylori
Om resistente stammen te identificeren, klinische isolaten van H. pylori
werden onderworpen aan MIC evaluatie (tabel 1) met verscheidene antibiotica momenteel in klinische behandeling van H. pylori-infectie
. Onder zeven geteste isolaten verkregen van verschillende onderwerpen, stam 4 was resistent tegen metronidazol en stammen 5, 6, 7 waren bestand tegen metronidazol en claritromycine. Alle isolaten waren gevoelig voor amoxicilline en tetracycline. Consistent met eerdere rapporten over de effecten van hBD-1, h-BD-2 en LL-37 peptiden tegen H. pylori
[10, 11] Alle geïsoleerde stammen van H. pylori
werden gedood na 6 uur incubatie met LL-37, WLBU2 en CSA-13 met een gemiddelde MBC (ug /ml) waarden 8,9 ± 4,03; 5,23 ± 2,7 en 0,31 ± 0,25 bij MBC werd geëvalueerd in HEPES buffer of 300 ± 232, 53 ± 41 en 2,98 ± 3,11 bij respectievelijk MBC werd geëvalueerd in Brucella Broth Bullion (figuur 2). Evaluatie van MBC waarden in HEPES buffer met de toevoeging van 2 mM MgCl 2 voor H. pylori
ATCC 43.504 onthulde een acht-voudige toename voor LL-37, en een vier-voudige toename voor zowel WLBU2 en CSA-13 (gegevens niet laten zien). Figuur 2 Bactericide activiteit tegen H. pylori. Minimale bacteriedodende concentratie (MBC) van LL-37 (witte kolom), WLBU2 (grijze kolom) en CSA-13 (zwarte kolom) tegen H. pylori
(ATCC 43504 stam en zeven klinische isolaten verkregen uit mucosale monsters van verschillende onderwerpen ) geëvalueerd in HEPES (panel A) of Brucella Broth Bulion (paneel B). MBC geeft concentraties waarbij verbindingen een entstof van H. pylori
volledig uit te roeien.
Tabel 1 Evaluatie van de gevoeligheid van klinische stammen van H. pylori
tegen antibiotica.
H. pylori
stammen
Antibiotica
AMX
CLR
TET
Metronidazole
ATCC 43.504
0,016
0,094
0,25
64.0 ®
1
0.094
0.125
0.75
0.19
2
<0.016
0.19
0.125
0.094
3
0.016
0.25
3.0
0.5
4
0.032
0.047
2.0
32.0 ®
5
0.25
64,0 ®
1,0
96,0 ®
6
0,032
1.5 ®
1.5
32,0 ®
7
0,047
1.5 ®
2,0
48,0 ®
MIC-waarden (ug /ml) (AMX-amoxicilline, CLR-claritromycine, TET-tetracycline)
antibacteriële activiteit van LL-37, WLBU2 en CSA-13 na pre-incubatie bij lage pH met pepsine of mucine
Naast bekende remming van CAP antibacteriële activiteit door divalente kationen zoals Mg 2 + en Ca 2 +, de proteolytische activiteit pepsine kan ook CAP functie compromis in het maagsap omgeving met de aanwezigheid van mucinen en lage pH. Om deze mogelijkheid aan te pakken evalueerden we de antibacteriële activiteit tegen Escherichia coli MG1655
na 3 uur voorincubatie van LL-37, WLBU2 en CSA-13 in gesimuleerd maagsap in relatie tot hun activiteit na voorincubatie in PBS bij pH 7,4 . Alvorens tot het doden assay, de pH van monsters met een lage pH en lage pH /pepsine werd ingesteld op 7,4. De antibacteriële activiteit van LL-37 en WLBU2 peptiden tegen E. coli MG1655
was niet significant gewijzigd na pre-incubatie bij pH van 1,5, maar verloren na voorincubatie bij pH ~ 1,5 in de aanwezigheid van pepsine (figuur 3A en 3B). In tegenstelling, de antibacteriële activiteit van CSA-13 was onveranderd door pre-incubatie bij pH van 1,5 met of zonder pepsine (Figuur 3C). Anderzijds, bactericide activiteiten van alle componenten werden gecompromitteerd in verschillende mate wanneer getest met een bacteriedodende test in aanwezigheid van gezuiverd gastrische mucine. In nauw overleg met de resultaten van deze E. coli
MG1655 studie, MBC waarden van LL-37 peptide geëvalueerd na 1H pre-incubatie met buffer bij lage pH met pepsine of mucine werd verhoogd, maar die van de CSA-13 waren nagenoeg ongewijzigd (Figuur 3D). Alle onderzochte agentia verloren antibacteriële activiteit in PBS aangevuld met 10% humaan gal (een concentratie die niet interfereert met E. coli MG1655
groei - gegevens niet getoond). Dit resultaat suggereert dat de fysisch-chemische eigenschappen van antibacteriële moleculen bevordering van hun opname in gal lipoproteïne, waardoor hun wisselwerking met de bacteriële wand te beperken. Er is geen onderzoek antibacteriële activiteit van CAP in duodenale sap evalueren, maar deze resultaten aan dat gal reflux in de maag kunnen verstoren CAP activiteit. Figuur 3 Antibacteriële activiteit tegen E. coli MG1655 en H. pylori-stam ATCC 43504. antibacteriële activiteit van LL-37 (panel A), WLBU2 (panel B) en CSA-13 (paneel C) tegen E. coli
MG1655 na pre-incubatie (3 uur bij 37 ° C) in PBS (open cirkels), gesimuleerd maagsap bij pH ~ 1,5 (vierkanten), gesimuleerd maagsap met pepsine (ruiten), gesimuleerd maagsap met mucine (driehoekjes) en PBS met menselijke gal (10%) verkregen uit de galblaas (gevulde cirkel). De getoonde gegevens zijn gemiddelden ± SD van 3-4 experimenten. MBC van LL-37 (witte kolom) en CSA-13 (zwarte kolom) (paneel D) tegen H. pylori
(ATCC 43.504) na voorincubatie (1 uur bij 37 ° C) in gesimuleerd maagsap bij pH ~ 1,5 (A), gesimuleerd maagsap met pepsine (B) en in aanwezigheid van mucine (C)
Analytische karakterisatie van LL-37 en CSA-13 na incubatie met pepsine
Massaspectrometrie analyse (Figuur 4) onthult dat drie uur incubatie met pepsine resulteert in een uitgebreide afbraak van LL-37. Bij lage pH, pepsine digestie zeer specifiek en LL-37 splitsingsplaats is beperkt tot de plaats met hydrofobe aminozuren. Potentiële splitsingsplaatsen voorspeld door PeptideCutter karakterisering software http:.. //Kr ExPASy org /tools /peptidecutter /, suggereren dat LL-37 digestie met pepsine in onze experimentele omstandigheden 11 producten, waaronder 3 kortere peptides moet vrijgeven (RKSKEKIGKE, FKRIVQRIKD en LVPRTES). Deze voorspellingen zijn consistent met massaspectrale analyse, die de aanwezigheid van een intacte LL-37 blijven na incubatie met pepsine bij lage pH vertoont, maar openbaart de opkomst van tal van nieuwe pieken met verschillende retentietijden. De resterende antibacteriële activiteit van IL-37 na behandeling met pepsine (Figuur 3A en 3D) bij het doden assays vertegenwoordigt waarschijnlijk de restactiviteit van deze LL-37 fragmenten. Anders dan de waargenomen afbraak van LL-37 werd CSA-13 analytische karakterisatie ongewijzigd na incubatie met pepsine bij lage pH. Figuur 4 Massaspectrometrie analyse. Massaspectrometrie analyse van LL-37 (paneel A) en CSA-13 (panel B) in PBS (curve 1) buffer met lage pH (curve 2) en lage pH-buffer met aanwezigheid van pepsine (curve 3). De totale ion chromatogram (TIC) wordt gepresenteerd voor elk monster staat met een inzet van massa-tot-lading (m /z) spectra toont de intensiteit van de boxed TIC pieken. Het molecuulgewicht van intacte LL-37 is 4494, die kan worden waargenomen met meerdere ladingen (m /z = 4 MW = 1124, m /z = 5 MW = 900, etc.) in positieve ion modus. Het molecuulgewicht van CSA13 is 678, die direct kunnen worden genomen en meerdere ladingen. De gegevens van het ene experiment worden getoond.
Toxiciteit van LL-37, WLBU2 en CSA-13 tegen RBC en menselijke adenocarcinoom cellen
Niet-specifieke toevoeging van antibacteriële peptiden en hun bootst in gastheercellen celmembranen kan toxiciteit veroorzaken. Gastheercelmembraan permeabilisatie kan worden gemeten door de afgifte van eiwitten zoals hemoglobine en LDH het cytosol naar de extracellulaire ruimte. Door het evalueren hemoglobine en LDH-afgifte (figuur 5A en 5B), tonen wij geen significante membraan permeabilisatie door elke geteste moleculen in het gebied waar ze bactericide activiteit in zoutoplossing buffers (Figuur 2A, figuur 3). Deze bevinding werd bevestigd door microscopische evaluatie van adenocarcinoom celmorfologie geeft geen zichtbare verschillen tussen de controlecellen en die behandeld met 10 ug /ml IL-37, WLBU2 of CSA-13 (figuur 5C). Een verhoging van hemoglobine en LDH afgifte werd waargenomen met toenemende concentratie. Van de drie geteste moleculen, WLBU2 de sterkste hemolytisch agens, maar ze vertoonden vergelijkbare mogelijkheid adenocarcinoom celmembraanintegriteit (Figuur 5B en 5C) compromitteren. CSA-13 concentraties bactericide tegen H. pylori Kopen en E. coli MG1655
(figuren 2A, 2B en 3C) geëvalueerd in zoutoplossing en voedingsstoffen bevattende buffer lagen onder het minimale hemolytische concentratie en onder concentraties die dysfunctie van adenocarcinoom celmembranen. Figuur 5 Evaluatie van celtoxiciteit. Hemoglobine en LDH afgifte uit humane rode bloedcellen en humane adenocarcinoom cellen (paneel A en B respectievelijk) na toevoeging van LL-37 (cirkels), WLBU2 (ruiten) en CSA-13 (driehoeken), gevolgd door incubatie gedurende 1 uur bij 37 ° C. De getoonde gegevens zijn gemiddelden ± SD van drie experimenten. Morfologie van de menselijke adenocarcinoom van de maag cellen vóór (controle) en na LL-37, WLBU2 en CSA-13 behandeling werd geëvalueerd door fase-contrast microscopie (paneel C). Gegevens afkomstig van één representatief experiment worden getoond. Twee andere experimenten toonden dezelfde resultaten.
Discussie
De snelheid van succesvolle behandeling van H. pylori
maagontsteking, bereikt met combinatietherapieën van twee antibiotica en een protonpompremmer gedaald van meer dan 90% tot ongeveer 80 % in de afgelopen tien jaar [27]. Bovendien zijn de kosten van deze therapie is aanzienlijk en daarom behoefte aan grotere schaal beschikbaar middel voor het behandelen of voorkomen van H. pylori-infectie
nog bestaat [28]. Nieuwe middelen voor de behandeling van H. pylori infecties
nodig ook door toenemende resistentie veroorzaakt door intensief gebruik van antibiotica [29] en de adaptieve mechanismen van pathogene bacteriën momenteel gebruikte antimicrobiële middelen tegen overleving. Zo hebben H. pylori
stammen resistent tegen amoxicilline, metronidazol en claritromycine gemeld [30, 31]. Methoden om behandelingen te verbeteren voor H. pylori
zou laten leiden door inzicht in de natuurlijke mechanismen die geïnfecteerde patiënten reageren op deze bacterie en de redenen waarom de normale gastheer-afweermechanismen mislukken.
Deze studie bevestigt een eerder verslag van verhoogde HCAP-18 /LL-37 expressie in maagslijmvlies van patiënten geïnfecteerd met H. pylori
[11]. Deze bevinding suggereert dat het verhogen van de productie van de bacteriedodende peptide LL-37 een belangrijke rol kunnen spelen bij de afweer tegen H. pylori
[11]. Echter, dit bactericide respons bij sommige onderwerpen is onvoldoende en H. pylori
infectie kan nog steeds de bal na een chronische fase. Het gebrek aan bactericide functie van LL-37 in deze instelling heeft gesuggereerd dat de expressie van HCAP-18 /LL-37 peptide verhoogd maagslijmvlies van geïnfecteerde personen kunnen extra functies als een anti-inflammatoire en groei stimulerend middel hebben. Er werd recent aangetoond dat maagzweren bij ratten genezing wordt bevorderd door cathelicidin-gemedieerde transactivatie van epidermale groeifactorreceptoren (EGFR) via de transformerende groeifactor alfa (TGFa) signaalweg [32]. Alternatief verlies verdedigingslinie tegen H. pylori
kan door het verlies van antibacteriële werking van LL-37 in het milieu van het maagslijmvlies. Bijgevolg kan ontwerp van antimicrobiële middelen die effectiever deze instelling is gunstig zijn.
Gedreven door immunohistologische resultaten, de activiteit van IL-37 tegen klinische isolaten van H. pylori Kopen en E. coli MG1655 onder
biologisch relevante omstandigheden werd vergeleken met die van de synthetische peptide WLBU2 en ceragenin CSA-13. Deze studie toont aan dat CSA-13, anders dan LL-37 en WLBU2 peptiden, onderhoudt sterke bactericide activiteit in de aanwezigheid van mucine na pre-incubatie met pepsine bij lage pH. Deze omstandigheden vormen unieke uitdagingen op H. pylori
behandeling, aangezien deze bacteriën in de maag worden beschermd tegen de zure omgeving een dikke slijmlaag en de effectiviteit van veel antimicrobiële geneesmiddelen sterk verminderd in zuur milieu [31]. Dienovereenkomstig, de eerste effectieve therapie voor H. pylori infectie
een combinatie van relatief pH-ongevoelige antimicrobiële geneesmiddelen zoals bismut, tetracycline en metronidazol [33]. Bovendien, de maag leegt periodiek de inhoud (lokale therapie vaak wordt verdund en uitgewassen) de vaststelling dat CSA-13 heeft bactericide activiteit tegen veel lagere concentratie dan LL-37, na dezelfde incubatietijd (3-6 uur) [11], suggereert dat CSA-13 therapeutische mogelijkheden voor de behandeling van H. pylori
infectie kan hebben. De antibacteriële activiteit van CSA-13, die een kleinere netto lading en een unieke verdeling van de last over een steroïde skelet vergelijking met LL-37 en WLBU2 peptiden, bleek ook minder geremd door mucine geïsoleerd uit het maagslijmvlies zijn. Therapeutisch potentieel gebaseerd op het vermogen van CSA-13 tegen H. pylori uitroeiing
wordt ook ondersteund door eerder gerapporteerd antibacteriële activiteit tegen andere bacteriestammen, waaronder klinische isolaten van Pseudomonas aeruginosa
[21] en S. aureus
[22]. CSA-13 de unieke mogelijkheid om bacteriële membraan integriteit en de chemische aard van deze laagmoleculaire massa verbinding die vertaalt naar lagere kosten synthese vergeleken met kationische antibacteriële peptiden beschadigen suggereren dat CSA-13 of misschien andere ceragenins potentieel hebben voor de behandeling van H.
pylori infecties, zoals die veroorzaakt door de resistente stammen.
Conclusie
bactericide activiteit van ceragenin CSA-13 gehandhaafd na pre-incubatie in gesimuleerd maagsap en in aanwezigheid van mucine. Dit in vitro
evaluatie blijkt een aanzienlijk potentieel van dit molecuul in de behandeling van maag mucosale infectie.
Methods
antibacteriële middelen
LL-37 (NH 2-LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES-COOH) en WLBU2 ( NH 2-RRWVRRVRRWVRRVVRVVRRWVRR-COOH) peptiden werden gekocht van Bachem (King of Prussia, PA). CSA-13 werd bereid zoals eerder beschreven [34]. Amoxicilline (AMX), claritromycine (CLR), tetracycline (TET) en metronidazol werden gekocht bij Sigma.
Verzamelen van maagslijmvlies en gal monsters
Tijdens gastroscopie, uitgevoerd met ofwel een GIF V2 of Q145 (Olympus) gastroscoop, verschillende maagslijmvlies schijfjes werden uit de prepyloric en corpus regio van de maag. H. pylori
infectie werd opgericht in de biopten met behulp van een urease-test (CLO-test). Menselijke gal werd verkregen uit de galblaas van patiënten die cholecystectomie. Monsters werden filter-gesteriliseerd door een 0,45 urn membraan alvorens te worden verdund in PBS (1: 1) en gemengd met antibacteriële stoffen voor bacteriedodende assays. De studies werden goedgekeurd door de Medische Universiteit van Bialystok Ethische Commissie voor onderzoek bij mens en dier, en alle patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voor deelname aan het onderzoek.
Immunohistochemische studies
Immunohistochemische studies werden uitgevoerd op met formaline gefixeerde, paraffine ingebedde menselijke maagslijmvlies secties met een konijn anti-IL-37-antilichaam (H-075-06, gebruikt in een 1: 100 verdunning; Phoenix Pharamceuticals Inc.). In paraffine ingebedde coupes materialen werden tot 5 urn dik en dreef op gedestilleerd water bij 45 ° C. Secties werden vervolgens aangebracht op microscoopglaasjes gebracht bij 57 ° C oven gedurende de nacht. De plakjes werden van paraffine ontdaan volgens standaardprocedures en geblust met 0,9% waterstofperoxide in methanol gedurende 30 minuten. De coupes werden geïncubeerd met primair antilichaam bij 37 ° C gedurende 60 minuten, gewassen met 1% PBSA (1% BSA in PBS), en onderworpen aan binding met secundair antilichaam (gebiotinyleerd geiten anti-konijn IgG, 1: 400 verdunning). Amplificatie werd uitgevoerd met een Vectastain ABC kit, en een HRP detectiesysteem werd gebruikt voor peroxidase activiteit colocalize een DAB substraat. De secties werden tegengekleurd met hematoxyline. Monsters werden bekeken met een Nikon Eclipse 80 microscoop onder de 40 × vergroting.
Evaluatie van MIC en MBC Ondernemingen De minimale remmende concentratie (MIC) van de conventionele antibiotica tegen zeven verschillende klinische isolaten van H. pylori
(9 × 10 8 CFU /ml) werd bepaald met behulp Muller-Hinton agar (MH) met 5% schapenbloed. De incubatie werd in microaërofiele omstandigheden gehandhaafd met gebruik van een gas-Pack Campylobacter gasvormende kit BR60 gedurende 4 dagen bij 35 ° C. Klinische isolaten van H. pylori werden
resistent tegen antibiotica respectieve beschouwd als de MIC waarden boven 4 ug /ml voor AMX, 1 ug /ml voor CLR en 16 ug /ml voor TET en Metronidazol waren. De minimale bactericidale concentratie (MBC) van antibiotica werd geëvalueerd met een inoculum op 10 8 CFU /ml. Na 6 uur incubatie bij 37 ° C werd 10 gl aliquots van de suspensies gespot op Columbia agar gesupplementeerd met schapenbloed (5%).
Bacteriedodende assay
bactericide activiteiten van LL-37, WLBU2 peptiden en ceragenin CSA-13 tegen E. coli MG1655
in aanwezigheid van mucine of pepsine van varkens slijm (Sigma) en humaan gal werden gemeten zoals eerder beschreven [35]. Bacteriën werden gekweekt tot mid-log fase bij 37 ° C (bepaald door de evaluatie van de optische dichtheid bij 600 nm) en geresuspendeerd in PBS-buffer (pH = 7,4). De bacteriën suspensies werden vervolgens 10 keer verdund in 100 ui oplossingen die antibacteriële middelen alleen of met mucine (1000 ug /ml) of gal (de uiteindelijke 1:10 verdunning gal bootst de omgeving van de bovenste dunne darm waarin gal uitgescheiden [36] (pH = 7,4)). In een andere reeks experimenten antibacteriële activiteit van deze componenten werd bepaald na de voorincubatie in gesimuleerd maagsap [36, 37] bij pH ~ 1,5 met en zonder pepsine (0,5 mg /ml). Na incubatie bacteriën antibacteriële moleculen gedurende één uur bij 37 ° C werden de bacteriële suspensies geplaatst op ijs en verdund 10 tot 1000- voudig. Monsters van elke verdunning (10 ui) werden gespot op LB agarplaten overnacht kweken bij 37 ° C. Het aantal kolonies op elke verdunning werd de volgende morgen geteld. De kolonievormende eenheden (CFU /ml) van de individuele monsters werden bepaald uit de verdunningsfactor.
Massaspectrometrie
Analytische karakterisatie werd uitgevoerd op het CSA-13 en IL-37 suspensies na 3H incubatie met pepsine (0,5 mg /ml) bij lage pH (~ 1,5) bij 37 ° C, met de Shimadzu (Columbia, MD) instrument (de LC-MS-systeem bestond uit een LC-20AB oplosmiddeltoevoersysteem en SIL-20A autosampler gekoppeld dubbele golflengte UV-Vis detector en een LCMS 2010EV enkele quadrupool massaspectrometer), gekoppeld aan een Shimadzu Premier C18-kolom (150 mm x 4,6 mm id, 5 micrometer deeltjesgrootte). De mobiele fase stroomsnelheid was 1 ml /min aan een uitgangsverhouding van 90% mobiele fase A (water) en 10% mobiele fase B (acetonitril) beide met 0,1% (v /v) mierenzuur. De analytische werkwijze bestond uit de volgende stappen: (i) monsterinjectie en bedrijf, op 10% B gedurende 5 minuten, (ii) lineaire gradiënt van 10% tot 90% B gedurende 15 min, (iii) het houden op 90% B gedurende 5 minuten, (iv) isocratische stap tot 10% B en handhaven gedurende 5 minuten voor de volgende monsterinjectie. Massaspectrometrie werd uitgevoerd op het eluens met behulp van elektrospray ionisatie (ESI) in positieve ion mode met een gescande m /z bereik 160-2000.
Lysis van rode bloedcellen
hemolytische activiteit van LL-37, WLBU-2 en CSA-13 (0-200 μ
g /ml), tegen menselijke rode bloedcellen (RBC) werd getest met erytrocyten gesuspendeerd in PBS. RBC bereid uit vers bloed (hematocriet ~ 5%) werden gedurende 1 uur bij 37 ° C na toevoeging van testmoleculen. Relatieve hemoglobineconcentratie in supernatanten na centrifugeren bij 2000 xg werd gevolgd door meting van de absorptie bij 540 nm. 100% hemolyse werd genomen uit monsters die 2% Triton X-100 werd toegevoegd
Celkweek
menselijke gastrisch adenocarcinoom cellen. (ATCC, CRL-1739) werden in DMEM (Bio Whittaker) kweek aangevuld met 10% warmte gehandhaafd -inactivated foetaal runderserum (Hyclone) bij 37 ° C en 5% CO 2. Voor LDH afgifte assay en microscoop evaluatie cellen werden uitgeplaat in platen met 24 putjes en gekweekt tot confluentie. In alle experimenten werd het medium veranderd in serumvrij medium ~ 12 uur voor behandeling van cellen met IL-37, WLBU2 en CSA-13 (0-200 ug /ml) in afzonderlijke putjes, gedurende 1 uur. Celcultuur medium werd vervolgens verzameld, gecentrifugeerd (10 min, 5000 rpm, RT) en onderworpen aan LDH evaluatie (LDH-cytotoxiciteit Assay Kit; BioVision Inc.)
verklaringen
Dankwoord
Dit werk werd ondersteund door NIH verlenen HL067286 en de Medische Universiteit van Bialystok verleent 3-22458F en 3-18714L
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen. 'Originele bestand voor figuur 1 12866_2009_858_MOESM2_ESM.pdf Authors' 12866_2009_858_MOESM1_ESM.pdf Auteurs originele bestand voor figuur 2 12866_2009_858_MOESM3_ESM.pdf Authors 'originele bestand voor figuur 3 12866_2009_858_MOESM4_ESM.pdf Authors' originele bestand voor figuur 4 originele bestand 12866_2009_858_MOESM5_ESM.pdf Authors 'voor figuur 5 tegenstrijdige belangen
Dr P. Savage is een betaalde consultant voor Ceragenix Pharmaceuticals, Innate Immune Inc., en WittyCell. Geen van de beschreven in dit document onderzoek werd gesteund door Ceragenix Pharmaceuticals of door een andere rechtspersoon. Andere auteurs: geen te verklaren
.

• Evaluatie van de passage van Lactobacillus gasseri K7 en bifidobacteriën van de maag naar de darmen met één reactor model
• -Balloon afgesloten retrograde transveneuze obliteration voor maag varices: de relatie tussen de klinische uitkomst en gastrorenal shunt occlusion