GP73 nedregleras i magsäckscancer och i samband med tumör differentiation

GP73 nedregleras i magsäckscancer och i samband med tumördifferentiering Bild Sammanfattning
Bakgrund
Golgi protein 73 (GP73) är en typ II Golgi transmembranprotein . Det är överuttryckt i flera cancerformer, inklusive hepatocellulära karcinom, gallgångsceller karcinom, lungcancer och prostatacancer. Men det finns få rapporter om GP73 i magcancer. Denna studie syftar till att undersöka uttrycket av GP73 och dess relation med kliniska patologiska tecken på magcancer.
Metoder
GP73-mRNA-nivå bestämdes genom kvantitativ realtids-RT-PCR i 41 par av matchade gastric tumörvävnad och intilliggande icke-tumörartade slemhinnevävnader. Western blotting utfördes också för att detektera proteinnivån GP73. GP73-proteinuttryck analyserades genom immunhistokemi i 52 kliniskt karakteriserade gastric cancerpatienter och 10 icke-tumör magslemhinnan vävnadskontroller.
Resultat
mRNA och proteinnivå GP73 var betydligt nedregleras i gastriska tumörvävnad jämfört med icke-tumörartade slemhinnevävnader. I icke-tumör slemhinna, kan stark diffus cytoplasmisk färgning ses i celler lokaliserade vid ytan av den glandulära och foveolar fack; medan det i tumörvävnader, färgningen var mycket svagare eller till och med frånvarande och främst i ett semi-granulär dot-liknande färgningsmönster. Uttrycksnivån för GP73-proteinet var associerat med patienternas kön och tumör differentiering.
Slutsatser
GP73 var normalt uttrycks i icke-tumör magslemhinna och nedregleras i magcancer. Dess expression i magsäckscancer var korrelerad med tumör differentiering.
Nyckelord
GP73 Magcancer Tumör differentiering Bakgrund
GP73, även känd som GOLM1 och GOLPH2, är en typ II Golgi transmembranprotein. Strukturellt GP73 innehåller en kort N-terminal cytoplasmatisk domän, en transmembrandomän och en större luminal C-terminal domän som är sammansatt av en coiled-coil-domän och en syra svans. Den luminala C-terminala domänen är den huvudsakliga funktionsdomän av GP73 [1-3]. Möss med en svår trunkering av GP73 C-terminalen visade minskad överlevnad och allvarliga epiteliala abnormaliteter i njurarna och levern [4]. Den coiled-coil-domänen skulle kunna interagera med både prekursor och mogna sCLU, vilket indikerar att GP73 kan vara till hjälp i den post-translationell modifiering, transport och utsöndring av sCLU [5]. En proproteinconvertase igenkänningsställe R 52VRR 55 ligger inom C-terminal ektoområde; PC-medierad klyvning av GP73 omvandlar den intracellulära, Golgi-lokaliserad GP73 till en löslig, sekretoriskt protein [6]. Emellertid är fortfarande oklart funktionen av GP73.
GP73 identifierades först från ett cDNA-bibliotek härlett från levern hos en patient med vuxna jätte-cell hepatit. Det anses en epitelcell-specifikt protein, som uttrycks i hög utsträckning i kolon, mage, prostata och luftstrupe hos normala, friska personer [1]. Leversjukdom, såsom virusinfektion och cirros, kunde uppreglera uttrycket av GP73 i hepatocyter [1, 7, 8]. Nyligen genomförda studier visar att GP73 var överuttryckt i flera cancerformer, såsom hepatocellulära karcinom [9-11], gallgången karcinom [11], lung adenokarcinom [12], prostatacancer [13, 14] och seminom [15]. Uttrycket av GP73 i njurcancer är mycket mer omfattande. Det rapporterades som nedregleras i de flesta tydliga cellnjurcellscancer (RCC), men starkt uttryckt i papillär och chromophobe njurkarcinom [16]. Serum GP73 har också funnit förhöjda i levercellscarcinom, gallgången karcinom och lung adenokarcinom. Det visade även en fördel jämfört med α-fetoprotein (AFP) för att diagnostisera tidiga levercellscarcinom [17, 18]. Även mRNA-expression av GP73 i urin överträffade serum-PSA i att upptäcka prostatacancer [13].
Gastric cancer är en av de vanligaste cancersjukdomarna och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen. Det har särskilt höga frekvenser i Kina [19]. Hittills har etiologiska faktorer och patogenes av magcancer har inte helt klarlagd. I denna studie har vi som mål att undersöka uttrycket av GP73 och dess relation med kliniska patologiska tecken på magcancer genom att mäta mRNA och proteinuttryck nivå GP73 i gastric tumör och angränsande icke-tumör slemhinnevävnader.
Metoder
material och patienter
Forty-ett par av matchade gastric tumör och angränsande icke-tumör slemhinnevävnader (> 5 cm från kanten av tumören) erhölls från patienter med primär magsäckscancer på Zhejiang Provincial People sjukhus, Kina från januari 2011 till december 2012. egenskaperna hos 41 GCsare visas i tabell 1. Efter kirurgiskt avlägsnande, vävnader frystes omedelbart i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C tills use.Table 1 Sammanfattning av clinicopathologic egenskaper hos gastric cancerpatienter
Clinical
parametrar
N (%)
Kön
Män i 27 (65,9)
Kvinnor
14 (34,1) Review storlek 23 (56,1 ) Hotel < 20
18 (43,9) Review ≧ 20
Histologisk differentiering Review Väl
3 (7,3) Review Måttligt
17 (41,5) Review Dåligt
21 (51,2) Review lymfatiska metastasering
Ingen
11 (26,8) katalog Ja
30 (73,2) Review fjärrmetastaser
Ingen
34 (82,9)
Ja
7 (17,1) Review TNM stadium
jag
8 (19,5) Review II
17 (41,5) Review III
10 (24,4)
IV
6 (14,6) Review Femtiotvå paraffin exemplar av magcancer (GC) vävnad (43 hanar, 9 kvinnor) förvärvades från Zhejiang Provincial People sjukhus, som samlats in från 2010 till 2011. Alla fall av magsäcks cancer klassificerades enligt WHO klassificering och iscensatt med hjälp av pTNM systemet [20]. De fall bestod av 22 patientsaged < 60 år, 30 patienter i åldern ≥60years; 20 patienter med tumörstorleken < 5cm, 32 patienter med tumörstorleken ≥5cm; 22 patienter med måttligt differentierad cancer, 30 patienter med dåligt differentierad cancer; 14 patienter med T1 eller T2 vägg invasion, 38 patienter med T3 eller T4 vägg invasion; 39 patienter med lymfkörtelmetastaser och 13 patienter utan lymfkörtel metastas; 10 patienter med fjärrmetastaser och 42 patienter utan fjärrmetastaser. Antalet patienter som klassificerats av TNM stadium var följande: 18 var i TNM stadium I eller II; 34 vid TNM stadium III eller IV. Patienterna var mellan 32 och 84 års ålder, och det fanns ingen radioterapi eller kemoterapi före operationen. Prover fixerades med formalin och bäddades in i paraffin. Tennormal vävnadsprover i magen från patienter utan maligna tumörer erhölls också med endoskopi som kontrollgruppen.
Alla patienter förutsatt informerat samtycke för användning av sina vävnader före operationen. Användningen av alla prover godkändes av den etiska kommittén för Zhejiang Provincial People sjukhus.
Kvantitativ realtids-PCR
QRT-PCR utfördes för att bestämma mRNA-nivån av GP73. I korthet extraherades totalt RNA från 40 par matchade gastric tumör och angränsande icke-tumör mucosal vävnadsprover, med hjälp av Trizol (Invitrogen, Camarillo, USA) enligt tillverkarens anvisningar. cDNA-syntes utfördes med PrimeScript 1. Strand cDNA Synthesis-kit (Takara, DaLian, Kina), med användning av en | j, g av totalt RNA som mall och oligodT grundfärg under 65 ° C, 5 minuter, 42 ° C, 60 minuter och 70 ° C, 10 minuter av omvänd transkription. Det resulterande cDNA amplifierades genom qPCR användning av specifika primers med SYBR förblandning Ex Taq (Takara, Dalian, Kina). GAPDH användes som en intern kontroll. Primrar för GP73 var 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(sens) och 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (antisens). Primers för GAPDH var 5'- TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(sense) och 5'CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (antisense). PCR-parametrarna var enligt följande: 95 ° C under 5 minuter, följt av 40 cykler av 95 ° C för 10 s, 60 ° C under 20s och 72 ° C under 20s. Vid slutet av PCR-cykler, var smältkurvanalys utförs. Den relativa uttrycket av GP73 till GAPDH beräknades med hjälp av två -ΔCT metod.
Western blotting
Western blotting utfördes för att undersöka GP73 proteinnivå i 5 av 41 par gastric tumörvävnad och angränsande icke-tumör slemhinnevävnad. Protein isolerades från vävnadsprover efter RNA-extraktion. Och ca 30 | ig protein separerades på 10% polyakrylamidgel under två timmar. Efter att ha förts till ett polyvinylidendifluorid (PVDF) -membran (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut, USA), proverna sonderades med primära antikroppar mot GP73 (1: 2000, Sigma, St. Louis, MO, USA) och β-aktin ( 1: 5000, Sigma, USA) vid 4 ° Covernight. Efter inkubering med sekundär antikropp (1: 5000, CapitalBio, Beijing, Kina) under 2 timmar, membranen behandlades med elektrokemiluminiscens (ECL) reagens (Generay, Shanghai, Kina) och exponerades för autoradiographicfilms
Immunhistokemisk färgning
Immunhistokemisk. färgning utfördes med standardmetoden. I korthet innebar detta 52 fall av paraffininbäddade gastriska tumörer vävnader och 10 fall av intilliggande icke-tumörartade mukosal vävnadskontroller skuret i 5 | j, m tjock och placerades på objektglas och torkades i en ugn vid 60 ° under 2 timmar. Därefter sektionerna de-paraffinized i xylen, rehydrerades med användning av en gradient av etanolkoncentrationer, microwaved i 10 mM citratbuffert i 15 minuter för att hämta antigen, blockerades med 3% väteperoxid under 10 minuter för att inhibera endogen peroxidasaktivitet och inkuberades med 10 % get icke-immunserum under 20 min för att minska bakgrunden icke-specifik färgning. Efter det, inkuberades sektionerna med kanin-anti-GP73 polyklonal antikropp (Abcam, Cambridge, UK) (1: 100 spädning) vid 4 ° C över natt, inkuberades sedan med biotin-märkt sekundär antikropp (Invitrogen, USA) vid rumstemperatur under 20 minuter, följt av inkubering med HRP-konjugerat streptavidin (Invitrogen, USA) vid rumstemperatur under 20 minuter. Därefter tillsattes färgutveckling utförs med en DAB Substrate Kit (Dako, Carlsbad, USA). Slutligen tillsattes sektionerna motfärgades med hematoxylin, dehydratiserades, rensas och monteras.
Utvärdering av immunohistochemicalstainings sälja The immunohistochemicalstainings av GP73 poängsattes av två patologer självständigt, baserat på intensiteten och andelen av positivt färgade celler. Färgningsintensitet utvärderades med en fyra-tiered betygssystem: 0 = negativt, 1 = svag, 2 = måttlig och 3 = stark. Den procentuella andelen positiva celler poängsattes enligt följande: 0 för ingen cell färgas, en för 1% till 25% av cellerna färgas, 2 för 26-50% av cellerna färgas, 3 för 51 till 75% av celler som färgats och 4 för mer än 75% av cellerna färgas. Poäng för intensitet och andelen positiva celler multipliceras. Scores ≤3 användes för att definiera tumörer med låg GP73 uttryck och poängen ≥4 med hög GP73-uttryck.
Statistisk analys
Statistisk analys utfördes med användning av SPSS 13,0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Den parade prover t-test användes för att analysera skillnaderna i GP73-mRNA-uttryck mellan tumör och icke-tumörvävnad. Chi-square test användas för att bedöma den statistiska signifikansen av sambanden mellan GP73 uttryck och kliniskt patologiska parametrar. P Hotel < 0,05 ansågs statistiskt signifikant
Resultat
GP73 uttryck nivå i gastric tumör och icke-tumörvävnad
GP73-mRNA-expression minskade signifikant i mag tumörvävnad jämfört med den intilliggande icke-tumör. vävnader (33/41, 80,5%). De uttrycksnivåer av GP73 relativt GAPDH var mycket lägre i gastriska tumörvävnad (0,259 ± 0,308) än i icke-tumör slemhinnevävnader (0,584 ± 0,523, P Hotel < 0,01; Figur 1). I överensstämmelse med RT-qPCR, GP73 proteinnivå i mag tumörprover var betydligt lägre än för icke-tumörprover, som testades med Western blotting (figur 2). Figur 1 GP73-mRNA-uttryck i mag tumörvävnad och angränsande icke-tumör slemhinnevävnader.
Figur 2 GP73 proteinnivå i gastric tumörprover och angränsande icke-tumör slemhinnor prover. A) GP73 proteinnivå i gastric tumörprover och angränsande icke-tumör slemhinnor prover. B) GP73-mRNA-nivå i samma gastriska tumörprover och angränsande icke-tumör slemhinnor prover. C) gastric cancer; N:. Normal) Review Korrelation mellan GP73-proteinuttryck och clinicopathologic parametrar
IHC visade att GP73 starkt uttrycktes i angränsande icke-tumör slemhinnevävnaden, men minskade eller frånvarande i gastriska tumörvävnad. I icke-tumör slemhinna, kunde stark diffus cytoplasmisk färgning ses i celler lokaliserade vid ytan av den glandulära och foveolar facket (Figur 3A). I tumörvävnader, var GP73 uttryck uttrycks huvudsakligen på ett distinkt halv granulär dot-liknande färgningsmönster (figur 3B, C). Endast ett fåtal gastric tumörvävnader befanns med starkt uttryck av GP73 (Figur 3D). Figur 3 GP73-proteinuttryck i mag tumörvävnad och angränsande icke-tumör slemhinnevävnader. A) starkt uttryck av GP73 i icke-tumörvävnad. B) Svag uttryck av GP73 i gastriska tumörvävnad. C) Medel uttryck av GP73 i gastriska tumörvävnad. D) starkt uttryck av GP73 i gastriska tumörvävnad. a, b, c, d: ursprunglig förstoring 100 ×. A, B, C, D:. Ursprunglig förstoring 200 ×
korrelationen mellan uttryck av GP73-protein och kliniska variabler visas i tabell 2. GP73 expressionsnivån var signifikant relaterad till kön av patienterna (P
= 0,027) och differentiering (P
= 0,049). Uttrycket av GP73 i dåligt differentierade gastric tumörer var mycket lägre än i måttligt differentierade gastric tumörer. Totalt 21 av 30 dåligt differentierade gastric tumörfall visade låg GP73 uttryck, medan måttligt differentierade gastric tumör fall var endast 9/22. Även uttrycket av GP73 i manliga patienter var nedreglerade oftare än så hos kvinnliga patienter. Det fanns ingen signifikant korrelation mellan GP73 uttryck och andra clinicopathologic parameters.Table 2 Förhållandet mellan GP73 uttryck med patologiska parametrar tumör
kliniska parametrar
GOLPH2
P-värde

vid låg
Hög
Totalt antal
30
22
Kön
0,027
Man
28
15
Kvinna 2
7
Ålder (år) katalog 0,456 Hotel < 60
12
10
≥60
18
12
Tumörstorlek storlek~~POS=HEADCOMP (cm2) Review 1,000 Hotel <
20 14
6
≥20
16
16
Differentiering
0,049
Måttligt differentierade
9
13
Dåligt differentierade
21
9
Stage
0,390
I + II
12
6
III + IV
18
16
Djup vägg invasion
1,000
T1 + T2
8 6
T3 + T4
22
16
lymfatiska metastas
0,757
Ingen
7
6
Ja
23
16
fjärrmetastaser
0,725
Ingen
25
17
Ja
5
5
Diskussion
Nyligen har flera studier visat att GP73 är överuttryckt i vissa cancerformer, inklusive levercellscarcinom, gallgången karcinom, lungcancer, prostatacancer och seminom [ ,,,0],9-15]. I levercellscarcinom var hög expression av GP73 i samband med tumörstorlek, differentiering, kvalitet och ven invasion [7-9]. I galla kanalcancer, GP73 uttryck korrelerad till patientens ålder och överlevnad [11]. Vid lungcancer var GP73 uttryck i samband med tumör histologi och patientens kön; dess uttryck i adenokarcinom var betydligt högre än i andra typer av lungcancer [12]. Emellertid har ingen korrelation med kliniskt patologiska parametrar hittats i prostatacancer och seminom [13, 15]. GP73 har också visat sig nedregleras i klara cell RCC, som är den vanligaste histologiska subtyp av njurcellscancer, medan dess uttryck i papillär och chromophobe RCC var stark [18]. I den aktuella studien fann vi att både GP73-mRNA och proteinnivåer mycket uttrycktes i icke-tumör gastric slemhinnorna, som var motsatsen till de flesta tidigare studier i andra cancerformer.
Kunskap om GP73 funktion fortfarande begränsad. Hittills vet vi att GP73 är väsentligt för lever och njure för att upprätthålla normal funktion och utseende. Det är också känt att GP73 kan fungera för att hjälpa i protein transport och sekretion. Ett sådant protein, sCLU har redan identifierats. sCLU kan förhindra apoptos och är överuttryckt i olika cancerformer. GP73 kan interagera med sCLU genom coiled-coil-domänen och hjälpa transport och utsöndring av sCLU, vilket kan förklara sambandet mellan hög uttrycks GP73 och aggressivt beteende av hepatocellulära karcinom [3]. I hepatocellulär cancer (HCC), var överuttryck av GP73 inte bara detekteras i cancervävnader men även i patienternas serum, vilket indikerade signifikant ökning i GP73 nivåer skulle ge en markör för tidig upptäckt. Vissa rapporter uppgav även att GP73 är en bättre markör än AFP för att diagnostisera HCC [10, 11, 18, 21]. Men vad är funktionen av GP73 i magen och varför skulle det nedregleras i magcancer? Detta är fortfarande oklart. GP73 är en epitelcell-specifikt protein och uttrycks starkt i många normala humana vävnader, särskilt i tjocktarmen och magen. Det är också övervägande uttrycks i tunntarmen, tjocktarmen och magen hos möss [22]. I överensstämmelse med dessa studier, fann vi även att GP73 kraftigt uttrycktes av celler som är belägna vid ytan av den glandulära och foveolar utrymmet i normal human magslemhinna. Eftersom det högsta uttrycket för GP73 är i epitelceller i matsmältningsorganen, är det rimligt att anta att det kan spela en del viktiga, okända roller i matsmältningssystemet.
Vi fann också expressionen av GP73 var associerad med tumör differentiering. Uttrycket av GP73 i dåligt differentierade gastric tumörer var mycket lägre än i måttligt differentierade gastric tumörer. Det rapporterades att knock-down av GP73 i HepG2.2.15 celler kan orsaka en minskning av ytan i Golgi-komplexet. Eftersom storleken och utvecklingen av Golgi-komplexet är positivt korrelerade med tumördifferentiering, vissa forskare hypotesen att GP73 uttryck kan vara förknippade med att upprätthålla den strukturella integriteten av Golgi-komplexet under onkogenes [23, 24]. Nyligen genomförda studier har visat att förlusten av GP73 orsakas uppreglering av WT1, vilket kan främja glomus bildning och inhibera pronephric tubuli differentiering. Det föreslog att GP73 spelar en viktig roll i pronephros utveckling och differentiering [25]. I hepatocellulär cancer, var GP73-protein starkt förknippad med tumörstorlek, ven invasion och tumör differentiering, vilket tyder på GP73 uttryck korrelerade med aggressivt beteende av cancer [10]. Dessutom uttrycket av GP73 var också förenad med patienten kön. Manliga patienter uppvisade låg GP73 uttryck oftare än kvinnliga patienter. Ett liknande fenomen har också rapporterats i lungcancer. Kvinnliga patienter hade en högre uttryck av GP73 än manliga patienter [12]. Det har också rapporterats att fenotypiska förändringar som observerats i möss med stympade GP73 C-terminalen är könsberoende [4]. En förklaring är att GP73-mRNA regleras av östrogener och kalcitriol [26]. Vårt arbete bekräftade åter hypotesen att GP73 uttryck är under hormonell kontroll.
Slutsats
Sammanfattningsvis fann vi att både GP73-mRNA och proteinnivå var signifikant nedregleras i gastriska tumörvävnad jämfört med icke-tumör slemhinna , och uttrycket av GP73 var associerad med tumördifferentiering och patientens kön. Vårt fortsatta arbetet kommer att fokusera på att undersöka funktionen och mekanismen regleringen av GP73 i magen
Förkortningar
AFP.
Α-fetoprotein
ECL
elektrokemiluminiscens
GC:
Magcancer
GP73:
Golgi protein 73

HCC:
Hepatocellulär cancer
PSA:
prostataspecifikt antigen
PVDF:
polyvinylidendifluorid
RCC.
njurcancer
förklaringar
Bekräftelser
Detta arbete stöddes av Zhejiang Provincial Program för odling på hög nivå innovativa hälso Talents.
författar~~POS=TRUNC original lämnat filer för Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12957_2012_1362_MOESM1_ESM.tif Författaroriginalfilen för figur 1 12957_2012_1362_MOESM2_ESM.tif Författaroriginalfilen för figur 2 12957_2012_1362_MOESM3_ESM.tif Författaroriginalfilen för figur 3 konkurrerande intressen
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Författare " bidrag
LGC och HJW var inblandade i utformningen av studien utförde QRT-PCR, Western bultning och immunhistokemisk färgning analys, och utarbetade manuskriptet. ZYY och HQT var inblandade i utformningen av studien och övervakade studien. HBY, FW och TPG insamlade data och bidrog till att utarbeta manuskriptet. XJH och YYM tillhandahålls allmänt stöd och bidragit till att utarbeta manuskriptet. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Marginell grumlig band och ljusblå vapen, skyltar observerats i förstoringsglas smalbands imaging endoskopi, indikerar gastric intestinal metaplasi
• Flera primära maligniteter som inbegriper primär sporadisk kolorektal cancer i Japan: förekomsten av magsäckscancer med colorectal cancerpatienter kan vara högre än vad som tidigare redovisats