GP73 je dolje regulirano raka želuca i povezane s tumorom differentiation

GP73 je dolje regulirano kod raka želuca, a koja je povezana s diferencijacijom tumora
apstraktne pregled pozadini pregled Golgijev protein 73 (GP73) je tip II Golgijev transmembranski protein , Je prekomjerno izražen u nekoliko vrsta raka, uključujući i hepatocelularne karcinome, žuči, raka pluća i raka prostate. Međutim, postoji nekoliko izvješća o GP73 u raka želuca. Ova studija je usmjeren na istražuje izražavanje GP73 i njegov odnos s kliničkim patoloških likova u raka želuca.
Metode pregled GP73 mRNA razina je određena kvantitativnom realnom vremenu RT-PCR u 41 pari podudaraju želučane tumorskih tkiva i susjedna non-tumorskih sluznice. Western blot je također provedena za određivanje razine GP73 proteina. GP73 ekspresija proteina analizirana je imunokemijski u 52 klinički karakteriziranih pacijenata rak želuca i 10 bez tumorskih želučane kontrola mukoznih tkiva. Rezultati pregled
mRNA i proteina iz GP73 bile značajno podregulirani u želučanim tumorskog tkiva u usporedbi s ne-tumorskih mukoznim tkivima. U ne-tumorske stanice sluznice, jaka difuzni citoplazmatski bojenje se može vidjeti u stanicama koje se nalaze na površini žljezdanog i foveolar prostor; dok je u tumorskim tkivima, bojanje je mnogo slabiji ili je uopće nema, a uglavnom u polu-zrnatog dot-poput bojenja uzorak. Razina ekspresije GP73 proteina je povezano sa starošću pacijenata i diferencijacije tumora.
Zaključci pregled GP73 obično je izražen u ne-tumorske stanice sluznice želuca i podregulirani u raka želuca. Njegov izraz lica kod raka želuca je povezana s diferencijacijom tumora. Pregled Ključne riječi
GP73 rak želuca tumorske diferencijacije Pozadina
GP73, također poznat kao GOLM1 i GOLPH2 je tip II Golgijev transmembranski protein. Strukturno, GP73 sadrži kratku N-terminalnu citoplazmatske domene, transmembransku domenu i veći luminalne C-terminalne domene koja se sastoji od regije smotanog klupka domene i kiselog repa. Luminalni C-terminalna domena je Glavna funkcija domena GP73 [1-3]. Miševi s teškim skraćivanjem GP73 C-kraju je pokazala smanjeni preživljavanje i teške epitela abnormalnosti bubrega i jetre. [4] Namotana-coil domene može komunicirati s obje preteče i zrele sCLU, što znači da GP73 može pomoći u post-translacijske modifikacije, transporta i izlučivanja sCLU [5]. Stranica priznanje proproteinconvertase R 52VRR 55 nalazi se u C-terminalnom ektodomene; PC posredovano cijepanje GP73 pretvara intracelularni, Golgijev lokalizirani GP73 na topivi, sekretorni protein [6]. Međutim, funkcija GP73 još nejasna. Pregled GP73 prvi put identificiran iz cDNA knjižnice dobivene iz jetre pacijenta s odraslih div-stanica hepatitisa. Smatra se da je stanica epitela specifični protein koji je visoko izražen u crijeva, želuca, prostate i dušnik kod normalnih, zdravih osoba [1]. bolesti jetre, kao što su virusne infekcije i ciroze, može se reguliraju ekspresiju GP73 u hepatocitima [1, 7, 8]. Nedavne studije su pokazale da GP73 je pretjerano izražen u nekoliko vrsta raka, kao što su hepatocelularnim karcinomima [9-11], žučovoda karcinoma [11], pluća adenokarcinoma [12], raka prostate [13, 14] i seminoma [15]. Ekspresija GP73 u karcinom bubrega mnogo je konačan. To je bio prijavljen kao dolje regulira u većini raka jasnih stanica bubrežnih stanica (RCCs), ali je visoko izražen u papilarni i chromophobe bubrežnih karcinoma [16]. Serum GP73 je također pronađen povišena u hepatocelularne karcinome, žuči i karcinomi pluća adenokarcinoma. To je čak pokazao prednost u odnosu na alfa-fetoprotein (AFP) za dijagnosticiranje rane hepatocelularnog karcinoma [17, 18]. Također, mRNA ekspresija GP73 u urinu nadmašio serumu PSA u otkrivanju raka prostate [13].
Rak želuca je jedan od najčešćih oblika raka i drugi vodeći uzrok raka povezanih smrti u svijetu. Ona ima posebno visoke frekvencije u Kini [19]. Do sada su faktori etiološki i patogenezi želučanog raka nisu u potpunosti razumjeli. U ovom istraživanju, cilj nam je istražiti ekspresiju GP73 i njegov odnos s kliničkim patoloških likova u rak želuca mjerenjem mRNA i proteina razina GP73 u želučanim tumorskih i susjednih ne-tumorskih sluznice.
Metode pregled Materijali i pacijenti
četrdeset jedan para podudarnih želučane tumoroznih i uz ne-tumoroznih sluznice (> 5cm od ruba tumora) dobiveni su od bolesnika s primarnim karcinomom želuca u Zhejiang Provincial Narodne bolnice, Kina je od siječnja 2011 do prosinca 2012. karakteristike 41 GCsare je prikazano u tablici 1. Nakon kirurškog uklanjanja, tkiva se odmah zamrznute u tekućem dušiku i pohranjeno na -80 ° C do use.Table 1. Sažetak kliničko karakteristike pacijenata oboljelih od raka želuca
Clinical parametri pregled
N (%)
Spol
Men
27 (65,9)
žena
14 (34,1)
Veličina pregled 23 (56,1 ) pregled, < 20 pregled, 18 (43,9) pregled ≧ 20 pregled Histološka diferencijacija pregled Pa pregled 3 (7.3) pregled Umjereno pregled 17 (41,5) pregled Loše pregled, 21 (51,2) pregled Limfna metastaze pregled Bez pregled 11 (26,8)
Da
30 (73,2) pregled udaljenih metastaza pregled Bez pregled 34 (82,9) pregled Da
7 (17,1)
TNM stadij pregled sam
8 (19,5) pregled II
17 (41,5) pregled, III
10 (24,4)
IV pregled 6 (14,6)
pedeset i dva parafinske primjeraka karcinoma želuca (GC) tkiva (43 muških, 9 ženki) stečena iz Zhejiang Provincial narodne bolnice, prikupljenih u razdoblju od 2010. do 2011. Svi slučajevi želuca rak klasificirani su prema klasifikaciji SZO i postavio pomoću pTNM sustava [20]. Slučajevi se sastojao od 22 patientsaged < 60 godina, 30 pacijenata u dobi od ≥60years; 20 bolesnika s veličinom tumora < 5cm, 32 bolesnika s veličinom tumora ≥5cm; 22 bolesnika s umjereno diferencirani karcinom, 30 pacijenata sa slabo diferenciranim rakom; 14 bolesnika s T1 ili T2 zidne invazije, 38 bolesnika s T3 ili T4 zida invazije; 39 bolesnika s limfnih čvorova metastaza i 13 pacijenata bez limfnih čvorova metastaze; 10 bolesnika s udaljenim metastazama i 42 bolesnika bez udaljenih metastaza. Broj pacijenata klasificiranih prema TNM fazi bili su kako slijedi: 18 su u TNM stadij I ili II; 34 na TNM stadiju III ili IV. Pacijenti su bili između 32 i 84 godina, a nije bilo radioterapiju ili kemoterapiju prije operacije. Uzorci su fiksirane i uklopljene u parafin. Tennormal Uzorci tkiva želuca kod pacijenata bez zloćudnim tumorima su također dobiveni endoskopije kao kontrolne skupine.
Svi pacijenti pod uvjetom pristanak za korištenje njihovih tkiva prije kirurškog zahvata. Korištenje svih uzoraka je odobren od strane Etičkog povjerenstva Zhejiang Provincial Narodne bolnice.
Kvantitativnih realnom vremenu PCR pregled QRT-PCR za određivanje razine mRNA za GP73. Ukratko, ukupna RNA je ekstrahirana iz 40 parova podudaraju tumorskih i susjednih uzoraka želučanom non-tumorskih mukozna tkiva pomoću Trizola (Invitrogen, Camarillo, USA) prema uputama proizvođača. Sinteza cDNA bila je provedena s PrimeScript 1. Strand cDNA Synthesis Kit-a (Takara Dalian, Kina), koristeći 1 ug ukupne RNA kao predložak i OligodT primera u 65 ° C, od 5 minuta, 42 ° C, 60 minuta do 70 ° C, 10 minuta reverznu transkripciju. Dobivena cDNA je od qPCR pomoću specifičnih početnica s SYBR premiks Ex Taq (Takara, Dalian, Kina). GAPDH korištena je kao interna kontrola. Primjeri za GP73 su 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(smislena) i 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (antisense). Primjeri za GAPDH bile su 5'TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(smislena) i 5'CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (antisense). PCR parametri bili su kako slijedi: 95 ° C tijekom 5 minuta, a zatim 40 ciklusa od 95 ° C za 10 s, 60 ° C, 20-i 72 ° C tijekom 20-ih. Na kraju ciklusa PCR, taljenje analiza krivulje je izvedena. Relativna izraz GP73 za GAPDH je izračunata pomoću 2 -ΔCT metoda. Pregled, Western blot pregled Western blot je izvedena istražiti razinu GP73 proteina u 5 od 41 parova želučane tumorskog tkiva i uz ne-tumoroznih za sluznicu tkiva. Protein je izoliran iz uzoraka tkiva nakon ekstrakcije RNA. I oko 30 ug proteina je odvojena na 10% poliakrilamidnom gelu dva sata. Nakon što je prebačen u polyvinylidenedifluoride (PVDF) membranu (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut, SAD), uzorci su ispitane s primarnim protutijelima na GP73 (1: 2000, Sigma, St. Louis, MO, USA) i β-aktin ( 1: 5000, Sigma, SAD) na 4 ° Covernight. Nakon inkubacije sa sekundarnim protutijelom (1: 5000, CapitalBio, Peking, Kina) 2h, membrane su tretirani s elektro (ECL) reagensa (Generay, Šangaju, Kina) i izloženi autoradiographicfilms
imunohistokemijsku bojenje
su imunohistokemijski. bojenje provedena je standardnom metodom. Ukratko, 52 slučajeva parafin uklopljenih želučanih tumora tkiva i 10 slučajeva susjednih non-tumorskih kontrola mukozna tkiva su rezani na 5 um debele i stavljen na mikroskopska objektna stakalca te osuši u pećnici C tijekom 2 h 60 °. Zatim, sekcije su uklonjena je parafin u ksilenu, rehidratirano koristeći gradijent koncentracijama etanola, mikrovalovima, u 10 mM citratnom puferu 15 minuta za pronalaženje antigen, blokirani sa 3% -tnim vodikovim peroksidom na 10 minuta da inhibiraju Aktivnost endogene peroksidaze i inkubirane s 10 % kozjeg neimunim seruma tijekom 20 minuta kako bi se smanjila pozadinsku nespecifičnog bojanja. Nakon toga, rezovi su inkubirani s zečjim anti-GP73 poliklonskim protutijelom (Abcam, Cambridge, UK) (1: 100 razrjeđenje) pri 4 ° C preko noći, zatim se inkubira s biotinom obilježenim sekundarnim protutijelom (Invitrogen, USA), na sobnoj temperaturi 20 minuta, nakon čega slijedi inkubacija sa HRP-konjugiranim streptavidina (Invitrogen, USA), na sobnoj temperaturi 20 minuta. Zatim, razvoj boje je izvedena sa DAB supstrat Kit (Dako, Carlsbad, USA). Na kraju, sekcije su prebrojane s hematoksilinom, dehidrirana, očišćena i montiran. Pregled Evaluacija immunohistochemicalstainings
immunohistochemicalstainings od GP73 je postigao dva patologa samostalno, na temelju intenziteta i udjela pozitivno obojenih stanica. Bojenje intenzitet je ocijenjena sa četiri kata sustav ocjenjivanja: 0 = negativan, 1 = slabo, 2 = umjereno i 3 = jak. Postotak pozitivnih stanica, postignuto na slijedeći način: 0 bez stanica obojenog, 1, 1% do 25% stanica koje su obojene, 2 za 26 do 50% stanica koje su obojene, 3 za 51 do 75% stanica koje su označene i 4 dulje od 75% stanica koje su označene. Bodovi za intenzitet i postotak pozitivnih stanica množe. Bodovi ≤3 se koristi za definiranje tumori s niskom ekspresijom GP73 i rezultate ≥4 s visokim GP73 izražavanja.
Statistička analiza pregled, Statistička analiza je provedena pomoću SPSS programa 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Uparenog-uzorci t-test je korišten za analizu razlike u ekspresiji GP73 mRNA između tumora i ne-tumorskih tkiva. Hi-kvadrat test je primijenjen za procjenu statističke značajnosti povezanosti izražavanja GP73 i kliničkopatološkim parametara. P pregled i 0.05 se smatra statistički signifikantnim pregled rezultata pregled GP73 razine ekspresije u želučanom tumora i ne-tumorskog tkiva pregled ekspresija GP73 mRNA znatno smanjena u želučanim tumorskim tkivima u odnosu na susjedni nisu tumoroznih. tkiva (33/41, 80.5%). Razina ekspresije GP73 odnosu GAPDH bile su znatno niže u želučanim tumorskih tkiva (0,259 ± 0,308) u odnosu na ne-tumorskih sluznice (0.584 ± 0,523 P pregled-0.01; slika 1). U skladu s RT-qPCR, GP73 razini proteina u uzorcima želučanih tumora bio značajno niži nego u ne-tumorskih uzoraka, koji je testiran Western blot metodom (slika 2). Slika izraz 1 GP73 mRNA u želučanim tumorskih tkiva i susjednih ne-tumorskih sluznice. pregled Slika razina 2 GP73 proteina u želučanim tumorskih uzoraka i susjednih ne-tumorskih sluznice uzoraka. A) Razina GP73 proteina u želučanim tumorskih uzoraka i susjednih ne-tumorskih uzoraka sluznice. B) GP73 mRNA razina u istim želučane tumorskih uzoraka i susjednih ne-tumorskih uzoraka sluznice. C) rak želuca; N:. Normalno) pregled Korelacija GP73 ekspresije proteina i kliničko parametara pregled IHC pokazala da GP73 je vrlo izražena u susjedstvu ne-tumorske sluznice tkiva, ali manji je ili je uopće nema u želučanim tumorskog tkiva. U ne-tumorske stanice sluznice, jaka difuzni citoplazmatski bojenje se može vidjeti iz stanica koje su smještene na površini žljezdanog i foveolar pregradak (slika 3A). U tumorskim tkivima, ekspresija GP73 uglavnom izražen u zasebnom polu-granuliranog Točkasti bojanja (slika 3B, C). Samo nekoliko želučani tumorsko tkivo pronađeno sa snažnom ekspresijom GP73 (Slika 3D). Slika izraz 3 GP73 proteina u želučanim tumorskih tkiva i susjednih ne-tumorskih sluznice. A) Jaka ekspresija GP73 u ne-tumorskih tkiva. B) Slab izraz GP73 u želučanim tumorskog tkiva. C) Blaga ekspresija GP73 u želučanim tumorskog tkiva. D) Jaka ekspresija GP73 u želučanim tumorskog tkiva. a, b, c, d: izvorno povećanje 100 ×. A, B, C, D:. Izvorno povećanje 200 ×
korelacija između ekspresije GP73 proteina i kliničkim varijablama prikazana je u tablici 2. Razina GP73 izražavanje bilo značajno povezano s spolu bolesnika (P pregled = 0,027) i diferencijaciju (P pregled = 0,049). Ekspresija GP73 u slabo diferenciranim tumorima želuca bila je znatno niža od one u srednje diferenciranim želučanih tumora. Ukupno 21 od 30 slabo diferenciranih tumora slučajevima želučanog pokazali slabu ekspresiju GP73, dok se u umjereno diferenciranim želučani tumor slučajeva to je samo 9/22. Isto tako, izraz GP73 kod muških pacijenata je lijepo regulirano češće nego u ženskih osoba. Nije bilo značajne korelacije između izražavanja GP73 i drugih kliničko parameters.Table 2 odnos GP73 izražavanja s patološkim parametrima tumora pregled Klinički parametri
GOLPH2
P-vrijednost pregled
pregled, Low

visoke
Ukupan broj
30 pregled, 22 pregled Spol pregled 0,027 pregled Muški pregled 28 pregled 15
Ženski pregled 2 pregled, 7 pregled doba (godine)
0,456 pregled < 60 pregled, 12 pregled, 10 pregled ≥60 pregled 18 pregled 12
veličina tumora (cm2) pregled 1,000 izvoznici < 20 pregled, 14 pregled 6
≥20 pregled 16 pregled, 16 pregled Diferencijacija
0,049 pregled umjereno diferencirani pregled, 9
13 pregled, slabo diferencirani pregled 21
9
Stage
0.390 pregled, I + II
12 pregled 6
III + IV
18 pregled, 16 pregled Dubina zida invazije
1.000 pregled T1 + T2 pregled 8
6 pregled T3 + T4 pregled 22 pregled, 16 pregled Limfna metastaze pregled 0.757 pregled, br pregled 7
6 pregled Yes pregled 23
16
udaljenih metastaza pregled 0,725 pregled Bez pregled 25 pregled, 17 pregled da pregled 5
5
Rasprava pregled Nedavno, nekoliko studija je pokazala da GP73 je prekomjerno ekspresivan kod nekih vrsta raka, uključujući i hepatocelularne karcinome, žuči, raka pluća, raka prostate i seminoma [ ,,,0],9-15]. U hepatocelularne karcinome, velike izraz GP73 je bio povezan s veličinom tumora, diferencijacije razreda i vene invazije [7-9]. U žučovoda karcinoma, GP73 izraz povezan s dobi bolesnika i opstanak [11]. Kod raka pluća, GP73 izraz bio povezan s tumorom histologiju i spol pacijenta; njegova ekspresija u adenokarcinoma bila je značajno viša nego u drugim vrstama raka pluća [12]. Međutim, korelacija sa klinikopatološkim parametrima nađeno je kod raka prostate i seminoma [13, 15]. GP73 Također je utvrđeno dolje regulirana jasnim stanica RCCs, što je najčešći histološki podtip karcinomom bubrega, a njegova ekspresija u papilarni i chromophobe RCC bio jak [18]. U ovom istraživanju, otkrili smo da su i GP73 mRNA i razina proteina je vrlo izražena u ne-tumorskih želučane mucosas, koji su nasuprot većini prethodnih studija u drugih vrsta raka.
Znanje GP73 je funkcija i dalje ograničen. Do sada, znamo da GP73 je neophodna za jetre i bubrega za održavanje normalne funkcije i izgled. Također je poznato da GP73 može funkcionirati u pomoći u transportu proteina i izlučivanje. Jedan takav protein, sCLU, već je identificiran. sCLU mogu spriječiti apoptozu i prekomjerno izražava u različitim oblicima raka. GP73 mogao komunicirati s sCLU kroz spiralno-spiralnu domenu i dovodu i lučenje sCLU, što može objasniti povezanost između visokog izraženom GP73 i agresivnog ponašanja hepatocelularnih karcinoma [3]. U hepatocelularnog karcinoma (HCC), prekomjerna ekspresija GP73 nije samo otkrivena u tkivima oboljelih od raka, ali također u serumu bolesnika, što ukazuje na značajan porast razine GP73 će osigurati marker za rano otkrivanje. Neki izvještaji čak je izjavio da GP73 je bolji marker nego AFP dijagnosticiranja HCC [10, 11, 18, 21]. Međutim, ono što je funkcija GP73 u želucu i zašto bi se dolje regulirana raka želuca? To je još uvijek nejasno. GP73 je stanica epitela specifičan protein i vrlo je izražena u mnogim normalnim ljudskim tkivima, naročito u debelo crijevo i želuca. Također je predominantno eksprimiran u tankom crijevu, debelog crijeva i želuca kod miševa [22]. U skladu s tim se studijama također pronašli da GP73 je visoko ekspresirana u stanice koje se nalaze na površini žljezdanog i foveolar odjeljka normalne humane sluznice želuca. Budući da je najviši izraz GP73 je u epitelnim stanicama probavnih organa, razumno je pretpostaviti da se može reproducirati neke važne, nepoznate uloge u probavnom sustavu.
Također smo otkrili izraz GP73 je povezana s diferencijacijom tumora. Ekspresija GP73 u slabo diferenciranim tumorima želuca bila je znatno niža od one u srednje diferenciranim želučanih tumora. To je izvijestio da je knock-down GP73 u jetrenog karcinoma linije HepG2.2.15 stanica može uzrokovati smanjenje površine Golgi kompleks. Budući da je veličina i razvoj Golgi kompleks u pozitivnoj korelaciji sa diferencijacijom tumora, neki su istraživači pretpostavili da GP73 izraz može biti povezana s održavanjem strukturalni integritet Golgi kompleks u onkogcnczom [23, 24]. Skorijih studija pokazalo da uzrokuje gubitak GP73 doreguliranjem WT1, koji može potaknuti stvaranje Glomus i inhibiraju pronephric tubula diferencijaciju. To sugerira da GP73 igra važnu ulogu u razvoju i diferencijaciji pronephros [25]. U hepatocelularni karcinom, GP73 protein je snažno povezana s veličinom tumora, invaziju vena i diferencijacije tumora ukazuje GP73 ekspresija je povezana s agresivnim ponašanjem raka [10]. Štoviše, izraz GP73 je također bio povezan s spolu pacijenta. Muški pacijenti su pokazali nisku ekspresiju GP73 češće od pacijentica. Sličan je fenomen je također bio prijavljen u pluća. Pacijentice su viši izraz GP73 od muških bolesnika [12]. Također je izvijestio da fenotipske promjene koje su uočene u miševa sa skraćenim GP73 C-terminalnom kraju su spol ovisne [4]. Jedno objašnjenje je da GP73 mRNA je regulirano estrogena i kalcitriol [26]. Naš rad jednom potvrdio tezu da GP73 ekspresija pod hormonskom kontrolom. Pregled Zaključak
U zaključku, pronašli smo da su i GP73 mRNA i razina proteina je značajno pale regulirano u želučanim tumorskog tkiva u odnosu na ne-tumorske sluznice , a izraz GP73 je bio povezan s tumorom diferencijacije i spol pacijenta. Naš daljnji rad će se usredotočiti na istraživanje funkciju i mehanizam regulacije za GP73 u želucu pregled Kratice pregled AFP. Pregled, α-fetoprotein
ECL : pregled elektro
GC: pregled rak želuca
GP73: pregled Golgi proteina 73
pregled HCC: pregled hepatocelularnog karcinoma
PSA: pregled, prostata specifičnog antigena
PVDF: pregled Polyvinylidenedifluoride
RCC:. pregled bubrega stanica raka
deklaracijama
Priznanja
ovaj rad je podržan od strane Zhejiang Provincial program za podizanje visoke razine inovativnih zdravstvenih talente.
autorov izvorni podnio datoteke za slike
Ispod su linkovi na autora originalnih dostavljenih datoteka za slike. 12957_2012_1362_MOESM1_ESM.tif autora izvorna datoteka za Slika 1 12957_2012_1362_MOESM2_ESM.tif autorskim izvorne datoteke za sliku 2 12957_2012_1362_MOESM3_ESM.tif autorskim izvorne datoteke na Slici 3 suprotstavljenih interesa
Autori izjavljuju da nemaju konkurentne interese. Pregled Autori ' doprinosi pregled LGC i HJW su uključeni u dizajnu studija, provedena QRT-PCR, Zapadna sidrenja i imunohistokemijske analize za bojanje, a izrađen rukopis. ZYY i HQT su sudjelovali u izradi studije i nadzirao studiju. HBY, FW i TPG prikupljaju podatke i pomogao izraditi rukopis. XJH i YYM pruža opću potporu i pomogao izraditi rukopis. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Granični mutna bend i svijetlo plava grb, znakovi su uočene u povećalo uski-band imaging endoskopiju, ukazuju na želučane intestinalne metaplazije
• Više primarne maligne bolesti koje uključuju primarnu sporadično raka debelog crijeva u Japanu: incidencija karcinoma želuca s pacijentima kolorektalnog karcinoma može biti veća od prethodno pri…