GP73 je navzdol ureja rakom želodca in povezana z diferenciacijo tumorja

GP73 je navzdol ureja rakom želodca in povezana z diferenciacijo tumorja
Abstract
ozadju
Golgi beljakovin 73 (GP73) je vrsta II Golgi transmembranski protein. To je preveč izražena v več vrst raka, vključno z hepatocelularnih karcinomov, žolčevod karcinomov, pljučnega raka in raka na prostati. Vendar pa obstaja nekaj poročil o GP73 pri raku želodca. Ta študija je namenjen preiskuje izražanje GP73 in odnose z kliničnih bolezenskih znakov pri bolnikih z rakom želodca.
Metode
GP73 mRNA ravni je bila določena s kvantitativno realnem času RT-PCR v 41 parov izravnanih želodca tumorskih tkiv in sosednji non-tumorozne sluznice tkiva. Western blot smo izvedli tudi za odkrivanje nivoja GP73 beljakovin. GP73 protein izražanja je bila analizirana z imunohistokemijo v 52 klinično značilna želodca bolnikov z rakom in 10 ne-tumorskih želodca kontrol sluznice tkiva.
Rezultati
mRNA in raven beljakovin GP73 bili občutno navzdol urejeno v želodčnih tumorskih tkivih, v primerjavi s non-tumorozne sluznice tkiva. V non-tumorskega sluznico, lahko močno difuzno citoplazemskega obarvanje treba gledati v celicah, ki se nahajajo na površini žleznega in foveolar oddelka; medtem ko je v tumorskih tkivih, je obarvanje precej manjša ali celo odsoten, in v glavnem v semi-zrnatega dot podobnih barvanja vzorca. Stopnja izraz GP73 beljakovin je bila povezana s spolom bolnikov in diferenciacijo tumorja.
Sklepe
je GP73 običajno izražene v ne-tumorskega želodčne sluznice in navzdol ureja rakom želodca. Njegov izraz v rakom želodca je bila povezana z diferenciacijo tumorja.
Ključne besede
GP73 želodčni rak tumorje diferenciacije Ozadje
GP73, znan tudi kot GOLM1 in GOLPH2, je tipa II Golgi transmembranski protein. Strukturno GP73 vsebuje kratek N-terminalno citoplazemsko domeno, transmembransko domeno in večji luminalnega C-terminalno domeno, ki je sestavljeno iz domene navito tuljavo in kislem rep. C-terminalna domena luminalne je glavna naloga domena GP73 [1-3]. Miši s hudo krajšanjem z GP73 C-koncu pokazala zmanjšano preživetje in hude epitelijskih nenormalnosti ledvic in jeter [4]. domena navito-coil lahko interakcijo z obema predhodnik in zrel sCLU, kar pomeni, da bi lahko GP73 pomoč pri post-translacijske modifikacije, transport in izločanje sCLU [5]. Prepoznavno mesto proproteinconvertase R 52VRR 55 se nahaja v C-terminalnem ektodomene; PC-posredovano cepitev GP73 transformira znotrajcelično,-Golgi lokalizirani GP73 v topni, sekretorni proteina [6]. Vendar pa je funkcija GP73 še vedno nejasen.
GP73 bila prvič opredeljena v knjižnici cDNA, ki izhaja iz jeter bolnika z odrasle velikanski celic hepatitisa. Se šteje kot epitelijskih celic specifičen protein, ki je zelo izražena v črevesju, želodcu, prostate in sapnika v normalnih, zdravih osebah [1]. bolezni jeter, kot so virusne okužbe in cirozo, lahko up-regulira ekspresijo GP73 v hepatocitov [1, 7, 8]. Nedavne študije so pokazale, da je bila GP73 preveč izražena v več rakavih obolenj, kot so hepatoceličnih karcinomov [9-11], žolčevod karcinomov [11], pljuč adenokarcinome [12], raka na prostati [13, 14] in seminoma [15]. Izraz GP73 pri raku ledvic je veliko bolj celovita. Je bilo, kot navzdol urejeno v večini jasnih celic raka ledvičnih celic (RCCs), vendar visoko izraženo v papilarni in chromophobe ledvičnih karcinomov [16]. Serum GP73 je bil ugotovljen tudi povišano hepatocelularnih karcinomov, žolčevod karcinomov in pljuč adenokarcinome. To je tudi pokazala prednost pred alfa-fetoproteina (AFP), za ugotavljanje zgodnje Hepatocelularna karcinomov [17, 18]. Tudi mRNA izraz GP73 v urinu prekosila serumskega PSA pri odkrivanju raka na prostati [13].
Rak želodca je eden najpogostejših rakov in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka po vsem svetu. Ima [19], zlasti visokih frekvenc na Kitajskem. Do sedaj, je etiološki dejavniki in patogeneza raka želodca niso bili v celoti razumeli. V tej študiji želimo raziskati izražanje GP73 in odnose z kliničnih bolezenskih znakov raka želodca z merjenjem nivoja mRNA in izražanja proteina z GP73 v želodčnih tumorskih in sosednjih non-tumorskih tkivih sluznice.
Metode
materiali in bolniki
enainštirideset parov izravnanih želodčnih tumorske in ob ne-tumorske sluznice tkiv (> 5 cm od roba tumorja) so bili pridobljeni pri bolnikih s primarnim rakom želodca v Zhejiang province Ljudska bolnišnica, Kitajska od januarja 2011 do decembra 2012. značilnosti 41 GCsare prikazano v tabeli 1. po kirurški odstranitvi tkiva so bili takoj zamrznili v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C do use.Table 1 Povzetek clinicopathologic značilnosti bolnikov z rakom želodca
Klinični parametri
N (%)
Spol
Men
27 (65,9)
žensk
14 (34,1)
Velikost
23 (56,1 )
< 20
18 (43,9)
≧ 20
histološki razlikovanje
No
3 (7.3)
Zmerno
17 (41,5)
Slabo
21 (51,2)
Limfna metastaze
št
11 (26,8)
Da
30 (73,2)
Distant metastaze
št
34 (82,9)
Da
7 (17,1)
stopnjo TNM
sem
8 (19.5)
II
17 (41,5)
III
10 (24,4)
IV
6 (14,6)
dvainpetdeset parafinskih vzorcev raka želodca (GC) tkiva (43 moških, 9 žensk) so bili pridobljeni iz province Zhejiang Ljudska bolnišnica, zbranih od leta 2010 do leta 2011. Vsi primeri želodca rak so bili razvrščeni po klasifikaciji Svetovne zdravstvene organizacije in zastavljeni s pomočjo sistema pTNM [20]. Primeri sestavljalo 22 patientsaged < 60 let, 30 bolnikov, starih ≥60years; 20 bolnikov z velikostjo tumorja < 5cm, 32 bolnikov z velikostjo tumorja ≥5cm je; 22 bolnikov z zmerno diferenciranega raka, 30 bolnikov s slabo rakom diferencirano; 14 bolnikov s T1 ali T2 stene invazije, 38 bolnikov s T3 in T4 stene invazije; 39 bolnikov z bezgavk metastaz in 13 bolnikov brez bezgavkah metastaze; 10 bolnikov z oddaljenih metastaz in 42 bolnikov brez oddaljenih metastaz. Število bolnikov, razvrščenih po stopnji TNM so bili naslednji: 18 so bili na TNM stopnji I ali II; 34 na TNM stadija III ali IV. Bolniki so bili med 32 in 84 let, in ni bilo radioterapijo ali kemoterapijo pred operacijo. Osebki so bile določene s formalinom in vdelali v parafin. Tennormal vzorci tkiva želodca pri bolnikih brez malignih tumorjev smo pridobili tudi z endoskopijo kot v kontrolni skupini.
Vsi bolniki, če soglasja za uporabo njihovih tkiv pred operacijo. Uporaba vseh vzorcev je odobrila etični odbor province Zhejiang ljudske Hospital.
Kvantitativno PCR v realnem času
QRT-PCR smo izvedli za določitev ravni mRNA za GP73. Na kratko, je bilo skupno RNA, pridobljen iz 40 parov izravnanih želodčnih tumorskih in sosednjih non-tumorskih vzorcev sluznice tkiva, s pomočjo TRIzola (Invitrogen, Camarillu, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Sinteza cDNA je bila izvedena z PrimeScript 1. Sklop cDNA zbirnem komplet (Takara, Dalian, Kitajska), z uporabo 1 ig celotne RNA kot predlogo in OligodT temeljni premaz pod 65 ° C, 5 minut, 42 ° C, 60 minut in 70 ° C, 10 minut reverzno transkripcijo. Dobljeno cDNA smo pomnožili s qPCR uporabo posebnih temeljni premazi s SYBR premiks Ex Taq (Takara, Dalian, Kitajska). GAPDH smo uporabili kot notranje kontrole. Primerji za GP73 bili 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(čut) in 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (antisense). Primerji za GAPDH bili 5'TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(čut) in 5'CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (antisense). Parametri PCR so bili naslednji: 95 ° C za 5 minut, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 10 s, 60 ° C za 20-ih in 72 ° C za 20-ih. Ob koncu ciklov PCR, je taljenje analiza krivulja izvedli. Relativna izraz GP73 za GAPDH bila izračunana na podlagi 2 -ΔCT način.
Western blot
Western blot smo izvedli za preiskavo raven GP73 beljakovin pri 5 od 41 parov želodca tumorskega tkiva, ki meji ne-tumorske sluznicami. Protein izoliramo iz tkiva vzorcev po ekstrakcijo RNA. In približno 30 mikrogramov proteina smo ločili na 10% poliakrilamidnem gelu za dve uri. Potem ko se je preselil v polyvinylidenedifluoride (PVDF) membrane (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut, ZDA), so bili vzorci skeniran s primarnimi protitelesi proti GP73 (1: 2000, Sigma, St. Louis, MO, ZDA) in β-aktina ( 1: 5000, Sigma, ZDA) pri 4 ° Covernight. Po inkubaciji pri sekundarnih protiteles (1: 5000, CapitalBio, Peking, Kitajska) za 2h, membrane so zdravili z electrochemiluminescence (ECL) reagenta (Generay, Šanghaj, Kitajska) in izpostavljena autoradiographicfilms
Imunohistokemijsko
imunohistokemičnim. obarvanje smo izvedli s standardno metodo. Na kratko, smo izrezali 52 primerov, parafinski vgrajeni želodčnih tumorjev tkiv in 10 primerov sosednjih kontrol niso tumorskih sluznični tkiva pri 5 um debela in postavi na mikroskopskih preparatov in sušimo pri 60 ° C peč za 2h. Nato so odseki bila odpravljena paraffinized v ksilenu, hidracijo uporabi gradienta koncentracije etanola, microwaved v 10 mM citratnem pufru za 15 minut za pridobivanje antigen blokirane s 3% vodikovega peroksida 10 minut, da zavira endogenega peroksidaze aktivnost in inkubiramo pri 10 % koza niso imuni serum za 20 minut, da se zmanjša obarvanje ozadja nespecifično. Po tem so odseki inkubirali s kunčjim anti-GP73 poliklonskega protitelesa (Abcam, Cambridge, Velika Britanija) (1: 100 razredčitev) pri 4 ° C preko noči, nato inkubiramo s pomočjo biotina označeni sekundarnega protitelesa (Invitrogen, ZDA) pri sobni temperaturi 20 minut, čemur sledi inkubacijo s HRP-konjugirano streptavidin (Invitrogen, ZDA) pri sobni temperaturi 20 minut. Nato se je razvijanje barve izvedemo s substratom Kit DAB (Dako, Carlsbad, ZDA). Na koncu so bili odseki jih nasprotno s hematoksilinom, dehidrirani, obračunavajo in montiran.
Ocena immunohistochemicalstainings
bili dosegel immunohistochemicalstainings za GP73 z dvema patologi neodvisno, glede na intenzivnost in delež pozitivno obarvanih celic. Obarvanje intenzivnost je bila ocenjena s štirimi stopenjski ocenjevalni sistem: 0 = negativna, 1 = slabo, 2 = zmerna in 3 = močno. Odstotek pozitivnih celic, je bilo doseženih takole: 0 brez celic obarvajo 1 za 1% do 25% celic obarvanih, 2 za 26 do 50% celic obarvanih, 3 za 51 do 75% celic, obarvanih in 4 dlje kot 75% celic obarvajo. Rezultati za intenzivnost in odstotek pozitivnih celic se je povečal. Rezultati ≤3 je bila uporabljena za opredelitev tumorjev z nizko GP73 izražanja in rezultati ≥ 4 z visoko ekspresijo GP73.
Statistična analiza
Statistična analiza je bila opravljena s pomočjo SPSS programske opreme 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Seznanjene-vzorce, t-test smo uporabili za analizo razlike v GP73 mRNA izražanja med tumorjem in ne-tumorskih tkivih. Hi-kvadrat test je bil uporabljen za oceno statistične značilnosti združenj, med GP73 izražanja in clinicopathological parametrov. P
< 0.05 smo imeli statistično značilno
rezultate
GP73 izraz ravni v želodčni tumorja in ne-tumorskega tkiva
je GP73 mRNA izraz bistveno nižja v želodčnih tumorskih tkivih, v primerjavi s sosednjim non-tumorske. tkiva (33/41; 80,5%). Je ekspresijski nivoji GP73 glede na GAPDH bili v želodčnih tumorskih tkiv (0,259 ± 0,308), kot da je veliko nižje v non-tumorskih tkiv sluznici (0.584 ± 0.523 P
< 0,01; slika 1). V skladu z RT-qPCR, ravni GP73 beljakovin v vzorcih tumorja želodca je bila bistveno nižja kot pri ne-tumorskih vzorcev, ki so jih preverili Western blot (slika 2). Slika 1 GP73 mRNA izražanja v želodčnih tumorskih tkiv in sosednjih non-tumorskih sluznice tkivih.
Slika raven beljakovin 2 GP73 v želodčnih tumorskih vzorcev in sosednjih non-tumorskih vzorcev sluznice. A) Raven GP73 beljakovin v želodcu tumorskih vzorcev in sosednjih non-tumorskih vzorcev sluznice. B) raven GP73 mRNA v istih želodčne tumorskih vzorcev in sosednjih non-tumorskih vzorcih sluznice. C) rak želodca; N:. Normal)
Korelacija med GP73 beljakovin izražanja in clinicopathologic parametrov
IHC so pokazale, da je bila GP73 visoko izraženo v sosednjem non-tumorskega sluznice tkiva, vendar zmanjšan ali celo odsotnosti v želodčnih tumorskih tkivih. V non-tumorskega sluznico, lahko močno difuzno citoplazemskega obarvanje treba gledati v celicah, ki se nahajajo na površini žleznega in foveolar predelku (slika 3A). V tumorskih tkivih, je GP73 izraz izraža predvsem v izrazito semi-zrnat dot podobnih barvanja vzorec (slika 3B, C). nekaj želodčne tumor tkiva so bile ugotovljene le z močno ekspresijo GP73 (slika 3D). Slika 3 GP73 protein izražanje v želodčnih tumorskih tkiv in sosednjih non-tumorskih sluznice tkivih. A) Močna ekspresijo GP73 v ne-tumorskih tkiv. B) Slab izraz GP73 v želodčnih tumorskih tkivih. C) Zmerno ekspresijo GP73 v želodčnih tumorskih tkiv. D) Močna ekspresijo GP73 v želodčnih tumorskih tkiv. a, b, c, d: izvirnik povečava 100 x. A, B, C, D:. Izvirna povečava 200 x
korelacijo med ekspresijo GP73 proteinskih in kliničnih spremenljivk so prikazani v tabeli 2. nivo GP73 ekspresijo signifikantno povezana s spolom bolnikov (P
= 0,027) in diferenciacijo (P
= 0,049). Izraz GP73 v slabo diferenciranih želodčnih tumorjev je bila precej nižja kot v zmerno diferenciranimi želodčnih tumorjev. Skupno 21 od 30 slabo diferenciranih želodca primerih tumorjev pokazala nizko GP73 ekspresije v zmerno diferenciranih primerih želodčni tumor, ko je bila le 9/22. Tudi izraz GP73 pri moških bolnikih je navzdol urejeno pogosteje kot pri bolnicah. Ni bilo pomembno korelacijo med GP73 izražanja in drugih clinicopathologic parameters.Table 2 Povezava z GP73 izražanja s patološkimi parametrov tumorja
Klinične parametre
GOLPH2
P-vrednost


Low

Visoka
Skupno število
30
22
Spol
0,027
Moški
28
15
Ženska
2
7
Starost (leta)
0,456
< 60
12
10
≥60
18
12
velikost tumorja (cm2)
1.000
< 20
14
6
≥20
16
16
Diferenciacija
0,049
zmerno razlikuje
9
13
Slabo razlikujejo
21
9
Stage
0,390
I + II
12
6
III + IV
18
16
Globina stene invazije
1.000
T1 + T2
8
6
T3 + T4
22
16
limfatičnega metastaze
0,757
št
7
6
Da
23
16
Distant metastaze
0.725
št
25
17
da
5
5
Razprava
Nedavno številne študije so pokazale, da je GP73 prekomerno izražen v nekatere vrste raka, vključno z hepatocelularnih karcinomov, žolčevoda karcinomov, pljučnega raka, raka na prostati in seminoma [ ,,,0],9-15]. V hepatocelularnih karcinomov, je visoko izraz GP73 povezana z velikostjo tumorja, diferenciacijo, stopnjo in vene invazije [7-9]. V žolčevoda karcinomov, GP73 izraz povezana s starostjo bolnika in preživetja [11]. V pljučnega raka, je GP73 izraz povezan s histologijo tumorja in spola bolnika; njen izraz v adenokarcinom je bila bistveno višja kot v drugih vrstah pljučnega raka [12]. Vendar pa ni bilo nobene povezave z clinicopathological parametri našel pri raku prostate in seminoma [13, 15]. GP73 je bila najdena tudi navzdol urejeno z jasnimi celic OCV, ki je najpogostejša histološka podtip raka ledvičnih celic, medtem ko je bil njen izraz v papilarnega in chromophobe RKC močna [18]. V tej raziskavi smo ugotovili, da sta bila GP73 mRNA in vsebnosti beljakovin zelo izražene v ne-tumorskih želodčne sluznice, ki so bili nasproti večini prejšnjih študij v druge oblike raka.
Poznavanje delovanja GP73 še vedno ostaja omejena. Tako zdaj vemo, da je GP73 bistvenega pomena za jetra in ledvice, da se ohrani normalno delovanje in videz. Znano je tudi, da lahko GP73 deluje pomagajo pri proteina prevoz in izločanja. Eden takšnih beljakovin, sCLU, je že opredeljena. sCLU lahko prepreči apoptozo in se prekomerno izražen v različnih rakavih obolenj. GP73 lahko interakcijo z sCLU z navito tuljavo domene in pomagajo prevoz in izločanje sCLU, ki lahko pojasni povezavo med visoko izraženo GP73 in agresivnega vedenja hepatocelularnih karcinomov [3]. V karcinomom jetrnih celic (HCC), prevelike izraz GP73 ni bil le odkrita v tumorskih tkivih, ampak tudi v serumu bolnikov, ki je naveden na ravni GP73 znatno povečanje bi zagotovila marker za zgodnje odkrivanje. Nekatera poročila celo izjavil, da je GP73 boljši dvojno podajo, kot AFP za diagnosticiranje HCC [10, 11, 18, 21]. Vendar, kaj je funkcija GP73 v želodcu in zakaj bi se navzdol urejeno v rakom želodca? To je še vedno nejasno. GP73 je epitelijska celica specifične beljakovine in močno izraženi pri številnih normalnih človeških tkiv, zlasti pri debelega črevesa in želodca. Prav tako je pretežno izražena v tankem črevesu, debelega črevesa in želodca miši [22]. Skladen z teh študijah smo tudi ugotovili, da je GP73 s celicami, ki se nahajajo na površini žleznega in foveolar predelu normalne človeške želodčne sluznice zelo izražena. Ker je najvišji izraz GP73 v epitelnih celic prebavil, je smiselno domnevati, da lahko igrajo nekatere pomembne, neznane vlogo v prebavnem sistemu.
Tudi Ugotovili smo izraz GP73 je bilo povezano z diferenciacijo tumorja. Izraz GP73 v slabo diferenciranih želodčnih tumorjev je bila precej nižja kot v zmerno diferenciranimi želodčnih tumorjev. poročali, da je bil to knock navzdol od GP73 v celicah HepG2.2.15 lahko povzroči zmanjšanje površine kompleksa Golgi. Ker sta velikost in razvoj Golgi kompleksa v pozitivni korelaciji z diferenciacijo tumorja, nekateri raziskovalci hipotezo, da bi lahko GP73 ekspresijo povezani z ohranjanjem strukturno celovitost Golgi kompleksa med onkogenezo [23, 24]. Nedavne študije so pokazale, da izguba GP73 povzročil up-regulacijo WT1, ki lahko spodbudi nastanek Glomus in zavira pronephric diferenciacijo Cjevčica. Predlagala je, da ima GP73 pomembno vlogo pri razvoju pronephros in diferenciacije [25]. V karcinomom jetrnih celic, je GP73 protein močno povezana z velikostjo tumorja, vene invazijo in diferenciacijo tumorja, kar kaže, GP73 izraz je v korelaciji z agresivnim obnašanjem raka [10]. Poleg tega je izraz GP73 povezana tudi s spolom pacientov. Moški bolniki so pokazali nizko GP73 izraz pogosteje kot ženske bolnikov. Podoben pojav so poročali tudi pri pljučnem raku. Bolnice so imeli višjo izraz GP73 kot pri moških [12]. To je tudi poročali, da so fenotipske spremembe opazili pri miših z okrnjenih GP73 C-terminalnem spol odvisen [4]. Ena od razlag je, da je GP73 mRNA ureja estrogenov in kalcitriola [26]. Naše delo še enkrat potrdili hipotezo, da je GP73 izraz pod hormonskim nadzorom.
Zaključek
Na koncu smo ugotovili, da je bilo tako GP73 mRNA in raven beljakovin občutno navzdol urejeno v želodčnih tumorskih tkivih, v primerjavi z ne-tumorskega sluznice in je izraz GP73 povezano z diferenciacijo tumorja in spol pacienta. Naše nadaljnje delo bo osredotočeno na preiskuje delovanje in mehanizem za regulacijo GP73 v želodcu
Kratice
AFP.
Α-fetoproteina
ECL :
Electrochemiluminescence
GC:
rak želodca
GP73:
Golgi beljakovin 73

HCC:
jetrnih karcinom
PSA:
prostato specifičnega antigena
PVDF:
Polyvinylidenedifluoride
RCC.
rak ledvičnih celic
deklaracij
Priznanja
to delo je podprl program deželnega Zhejiang, ki za gojenje High-ravni inovativna zdravje talente.
avtorjev prvotni predložiti datoteke za slike
Spodaj so povezave do avtorjev izvirnih predloženih spisov za slike. "Izvirno datoteko na sliki 1 12957_2012_1362_MOESM2_ESM.tif avtorjev 12957_2012_1362_MOESM1_ESM.tif avtorjev prvotni datoteki Slika 2 12957_2012_1362_MOESM3_ESM.tif avtorjev prvotni datoteki slika 3 Konkurenca interesov
Avtorji izjavljajo, da nimajo konkurenčnih interesov.
Avtorji" prispevki
LGC in HJW so sodelovali pri oblikovanju študije, opravljene na QRT-PCR, Western sejanje in imunohistokemičnim analizo obarvanje, in pripravila rokopis. ZYY in HQT so sodelovali pri oblikovanju študije in nadziral študijo. HBY, FW in TPG zbrali podatke in pomagali pripraviti rokopis. XJH in YYM pod splošno podporo in pomagala pripraviti rokopis. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Mejni motna pasu in svetlo modra greben, znaki opaženi v povečevalno ozkopasovno slikovni endoskopijo, so okvirni želodčnih črevesnih metaplasia
• Več primarnih malignosti, ki vključujejo glavno občasne kolorektalnega raka na Japonskem: incidenca raka želodca z bolniki z rakom debelega črevesa sme biti višja od prej recognized