GP73 подавляется при раке желудка и связанных с опухолью differentiation

GP73 подавляется при раке желудка и связанной с дифференцировки опухоли
Аннотация
фон
Гольджи белок 73 (GP73) представляет собой Гольджи трансмембранный белок типа II , Это чрезмерно выраженное в некоторых форм рака, в том числе гепатоцеллюлярной карциномы, рака желчных протоков, рака легкого и рака простаты. Тем не менее, есть несколько сообщений о GP73 при раке желудка. Данное исследование направлено на изучение экспрессии GP73 и его связь с клиническими патологических характеров при раке желудка.
Методы
уровень GP73 мРНК определяли с помощью количественной в реальном времени RT-PCR в 41 пар совпавших желудка опухолевой ткани и смежных неопухолевой ткани слизистых оболочек. Вестерн-блоттинг также выполнены, чтобы определить уровень белка GP73. экспрессия белка GP73 анализировали с помощью иммуногистохимии в 52 клинически характеризуемых больных раком желудка и 10 неопухолевых желудка управления слизистой ткани.
Результаты
мРНК и уровня белка GP73 были значительно понижающей регуляции в желудочном опухолевой ткани по сравнению с неопухолевой ткани слизистой оболочки. В неопухолевой слизистой оболочки, сильное диффузное окрашивание цитоплазмы можно увидеть в клетках, расположенных на поверхности железистой и foveolar отсека; в то время как в опухолевых тканях, окрашивание было намного слабее или даже отсутствует, и, главным образом, в полу-зернистой точка-подобный рисунок окрашивания. Уровень экспрессии белка GP73 был связан с полом пациентов и дифференцировки опухоли.
Выводы
была как правило, выражается GP73 в неопухолевой слизистую оболочку желудка и понижающей регуляции при раке желудка. Его экспрессия при раке желудка коррелирует с дифференцировки опухоли.
Ключевые слова
GP73 Желудочный раковая опухоль дифференциации фона
GP73, также известный как GOLM1 и GOLPH2, является Гольджи трансмембранный белок типа II. Конструктивно GP73 содержит короткий N-концевой цитоплазматический домен, трансмембранный домен и больший люминальную домен C-терминал, который состоит из домена биспиральных и кислотным хвостом. Полостную C-концевой домен является основной функцией область GP73 [1-3]. Мыши с тяжелой усечения GP73 С-конца показали пониженную выживаемость и тяжелые эпителиальные аномалии почек и печени [4]. Домен биспиральных может взаимодействовать как с предшественником и зрелых sCLU, указывая, что GP73 может помочь в пост-трансляционной модификации, транспортировки и секреции sCLU [5]. Сайт распознавания proproteinconvertase R 52VRR 55 находится в C-концевой эктодомене; ПК-опосредованной расщепление GP73 превращает внутриклеточный, Гольджи локализованы GP73 в растворимую, секреторного белка [6]. Тем не менее, функция GP73 до сих пор неясно.
GP73 был впервые идентифицирован из библиотеки кДНК, полученной из печени пациента с взрослых гигантских клеток гепатита. Это считается эпителиальные клетки-специфический белок, который экспрессируется на высоком уровне в толстой кишке, желудке, предстательной железы и трахеи в нормальных, здоровых людей [1]. Заболевания печени, таких как вирусные инфекции и цирроза печени, может вверх регулировать экспрессию GP73 в гепатоцитах [1, 7, 8]. Недавние исследования показали, что GP73 был чрезмерно выражены в нескольких видов рака, таких как гепатоцеллюлярной карциномы [9-11], желчных протоков карцином [11], аденокарциномы легких [12], рака предстательной железы [13, 14] и семиномы [15]. Выражение GP73 в раке почек является гораздо более всеобъемлющим. Было сообщено, как вниз регулируется в большинстве прозрачных клеток рака почки клеток (РКЦ), но высоко выраженная в папиллярного и хромофобных почечных карцином [16]. Сыворотка GP73 Также было обнаружено, повышен в гепатоцеллюлярной карциномы, карциномы желчных протоков и аденокарциномы легких. Он даже показал преимущество по сравнению с альфа-фетопротеина (AFP) для диагностики ранних гепатоцеллюлярной карциномы [17, 18]. Кроме того, экспрессия мРНК GP73 в моче превзошла ПСА в выявлении рака предстательной железы [13].
Рак желудка является одним из наиболее распространенных видов рака и второй ведущей причиной рака, связанных смерти во всем мире. Он имеет особенно высокие частоты в Китае [19]. До сих пор, факторы этиологические и патогенез рака желудка не до конца не изучены. В данном исследовании мы стремимся исследовать экспрессию GP73 и его связь с клиническими патологических характеров при раке желудка путем измерения уровня мРНК и экспрессии белка из GP73 в желудочном опухолевыми и смежных неопухолевых тканей слизистых оболочек.
Методы
материалы и пациенты
Сорок один пар совпавших желудочных тканей опухолевого и прилегающих неопухолевой слизистых оболочек (> 5 см от края опухоли) были получены у пациентов с первичным раком желудка в провинции Чжэцзян Народной больницы, Китай с января 2011 по декабрь 2012 характеристики 41 GCsare приведены в таблице 1. После того, как хирургическое удаление, ткани сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° с до use.Table 1 Резюме клиникопатологическими характеристик больных раком желудка
Клиническое параметры

N (%) завод
Пол
Men
27 (65,9)
женщин
14 (34,1)
Размер
23 (56,1 )
&л; 20
18 (43,9)
≧ 20
Гистологическое дифференцировка
Ну
3 (7.3)
Умеренно
17 (41,5)
Плохо
21 (51,2)
лимфатической метастаз
нет
11 (26,8) не
Да
30 (73,2)
отдаленными метастазами
нет
34 (82,9)
Да
7 (17,1)
TNM стадии
I
8 (19.5)
II
17 (41,5)
III
10 (24,4)
IV
6 (14,6)
пятьдесят два парафиновые образцов рака желудка (GC) ткани (43 мужчин, 9 женщин) были приобретены из провинции Чжэцзян Народной больницы, собранные с 2010 по 2011 г. Все случаи желудка рак были классифицированы в соответствии с классификацией ВОЗ и поставлена ​​с помощью системы pTNM [20]. Случаи состояли из 22 patientsaged и ЛТ, 60 лет, 30 пациентов в возрасте ≥60years; 20 пациентов с размером опухоли < 5 см, 32 пациентов с размером опухоли ≥5cm; 22 больных с умеренно дифференцированным раком, у 30 пациентов со слабо дифференцированным раком; 14 пациентов с T1 или T2 стены вторжения, 38 пациентов с T3 или T4 стены вторжения; 39 пациентов с метастазами в лимфатических узлах и 13 больных без метастазов в лимфатических узлах; 10 больных с отдаленными метастазами и 42 пациентов без отдаленных метастазов. Количество пациентов, классифицированных по стадии TNM распределились следующим образом: 18 были на TNM стадии I или II; 34 на TNM стадии III или IV. Пациенты были в возрасте от 32 до 84 лет, и не было лучевой терапии или химиотерапии до операции. Образцы фиксировали формалином и заливали в парафин. Образцы Tennormal ткани желудка у пациентов без злокачественных опухолей были также получены эндоскопии в качестве контрольной группы.
Все пациенты дали информированное согласие на использование их тканей перед операцией. Использование всех образцов было одобрено этическим комитетом провинции Чжэцзян народной больницы.
Количественные ПЦР в реальном времени
Результаты QRT-ПЦР проводили с целью определения уровня мРНК GP73. Если коротко, то суммарную РНК экстрагировали из 40 пар совпавших желудка опухолевыми и смежных образцов неопухолевых слизистой ткани, используя Trizol (Invitrogen, Camarillo, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Синтез кДНК проводили с помощью набора PrimeScript 1-й цепи кДНК синтеза (Takara, Dalian, Китай), с использованием 1 мкг общей РНК в качестве матрицы и OligodT праймера при 65 ° С, 5 минут, 42 ° C, 60 минут и 70 ° C, 10 минут обратной транскрипции. Полученную кДНК амплифицировали КПЦР с использованием специфических праймеров с SYBR Премикс Ex Taq (Takara, Даляне, Китай). GAPDH, был использован в качестве внутреннего контроля. Праймеры для GP73 были 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(смысловой) и 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (антисмысловой). Праймеры для GAPDH были 5'- TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(смысловой) и 5'- CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (антисмысловой). Параметры ПЦР были следующими: 95 ° С в течение 5 мин, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 10 секунд, 60 ° С в течение 20 с и 72 ° С в течение 20-х годов. В конце циклов ПЦР, плавление анализ кривой была выполнена. Относительное выражение GP73 к GAPDH была рассчитана с использованием 2 -ΔCT метод.
Вестерн-блоттинга
Вестерн-блоттинг проводили для изучения уровня белка GP73 в 5 из 41 пар желудка опухолевой ткани и прилегающих к нему неопухолевой ткани слизистых оболочек. Белок был выделен из тканей образцов после экстракции РНК. А приблизительно 30 мкг белка разделяли на 10% полиакриламидном геле в течение двух часов. После перевода в polyvinylidenedifluoride (PVDF) мембрану (GE Healthcare, Fairfield, штат Коннектикут, США), образцы были исследованы с первичными антителами против GP73 (1: 2000, Sigma, Сент-Луис, штат Миссури, США) и β-актина ( 1: 5000, Sigma, США) при 4 ° Covernight. После инкубации с вторичным антителом (1: 5000, CapitalBio, Пекин, Китай) в течение 2 ч, мембраны обрабатывали Электрохемилюминесценцию (СТЭК) реагента (Generay, Шанхай, Китай) и подвергаются воздействию autoradiographicfilms
иммуногистохимического окрашивания
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ. окрашивание проводили стандартным методом. Вкратце, 52 случая парафиновых срезах тканей желудка опухолей и 10 случаев смежных неопухолевых управления слизистой ткани были разрезаны на 5 мкм и помещали на микроскопических слайдов и сушат в сушильном шкафу до 60 ° C в течение 2 часов. Затем срезы были де-paraffinized в ксилоле, регидратации с использованием градиента концентрации этанола, микроволновке в 10 мМ цитратном буфере в течение 15 минут для получения антигена, блокировали 3% перекиси водорода в течение 10 минут, чтобы ингибировать эндогенную активность пероксидазы и инкубируют с 10 % козья неиммунная сыворотки в течение 20 минут, чтобы уменьшить фоновый неспецифическое окрашивание. После этого срезы инкубировали с кроличьей анти-GP73 поликлональных антител (Abcam, Кембридж, Соединенное Королевство) (разведение 1: 100) при 4 ° С в течение ночи, затем инкубировали с биотин-меченого вторичного антитела (Invitrogen, США) при комнатной температуре в течение 20 минут с последующей инкубацией с конъюгированным с пероксидазой хрена стрептавидина (Invitrogen, США) при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем развитие окраски осуществляли с прикосновением Субстрат Kit (Dako, Карлсбад, США). И, наконец, секции были контрастно гематоксилином, обезвожены, очищены и установлены.
Оценка immunohistochemicalstainings
В immunohistochemicalstainings из GP73 были забиты два патологоанатомами самостоятельно, основываясь на интенсивности и доли положительно окрашенных клеток. Окрашивание интенсивность была оценена с четырехуровневой системы оценок: 0 = отрицательный результат, 1 = слабое, 2 = умеренное и 3 = сильная. Процент положительных клеток оценивали следующим образом: 0, если нет клетки окрашивали 1 на 1% до 25% клеток окрашиваются, 2 в течение 26 до 50% клеток окрашиваются, 3 для 51 до 75% клеток, окрашенных и 4 для более чем 75% клеток, окрашенных. Баллы за интенсивность и процент положительных клеток умножались. Счет ≤3 был использован для определения опухолей с низким уровнем экспрессии GP73 и оценки ≥4 с высоким уровнем экспрессии GP73.
Статистический анализ
Статистический анализ был проведен с использованием программного обеспечения SPSS 13.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Парных образцов Т-тест был использован для анализа различий экспрессии мРНК GP73 между опухолью и неопухолевых тканей. Хи-квадрат тест был применен для оценки статистической значимости связей между выражением GP73 и клинико-патологическими параметрами. P
&л; 0,05 считали статистически значимыми
Результаты
уровень экспрессии GP73 в желудочном опухоли и неопухолевой ткани
экспрессия мРНК GP73 значительно снизилась в желудочном опухолевых тканях по сравнению с прилегающей неопухолевой. тканей (33/41; 80,5%). Уровни экспрессии GP73 по отношению к GAPDH были значительно ниже в желудочном опухолевой ткани (0,259 ± 0,308), чем в неопухолевых тканях слизистой оболочки (0,584 ± 0,523; P
&л; 0,01; Рисунок 1). В соответствии с RT-КПЦР, GP73 уровень белка в образцах опухолей желудка была значительно ниже, чем у неопухолевых образцов, которые были протестированы методом вестерн-блоттинга (Рисунок 2). Рисунок 1 выражение мРНК GP73 в желудочном опухолевых тканях и прилегающих к ним неопухолевых тканей слизистых оболочек. Рисунок
уровень белка 2 GP73 в желудочном опухолевыми образцов и прилегающих к ним неопухолевых слизистых оболочек образцов. А) уровень GP73 белка в образцах опухолевой желудка и прилегающих к ним образцов слизистых оболочек неопухолевых. Б) уровень мРНК GP73 в тех же образцах опухолевой желудка и прилегающих к ним образцов слизистых оболочек неопухолевых. C) рак желудка; N:. Нормальная)
Корреляция экспрессии белка GP73 и клиникопатологическими параметров
IHC показали, что GP73 была высоко выражена в соседней неопухолевой ткани слизистой оболочки, но снижение или даже при отсутствии в желудочном опухолевых тканях. В неопухолевой слизистой оболочки, сильное диффузное окрашивание цитоплазмы можно было увидеть в клетках, расположенных на поверхности железистой и foveolar отсека (Рисунок 3А). В опухолевых тканях, в основном, выражается выражение GP73 в отдельном полу-зернистой точечными рисунка окрашивания (рис 3B, С). Лишь немногие желудочные ткани опухоли были обнаружены с сильным выражением GP73 (рис 3D). Рисунок 3 экспрессии белка GP73 в желудочном опухолевой ткани и прилегающих к ним неопухолевых тканей слизистых оболочек. A) Сильное выражение GP73 в неопухолевых тканях. Б) слабая выраженность GP73 в желудочном опухолевых тканях. C) Умеренная экспрессия GP73 в желудочном опухолевых тканях. D) Сильное выражение GP73 в желудочном опухолевых тканях. а, b, c, d: исходное увеличение 100 ×. А, В, С, D:. Исходное увеличение 200 ×
корреляция между экспрессией белка GP73 и клинических переменных приведены в таблице 2. Уровень экспрессии GP73 в значительной степени связано с полом пациентов (Р =
0,027) и дифференциации (P = 0,049
). Выражение GP73 в слабо дифференцированной опухоли желудка была значительно ниже, чем в умеренно дифференцированных опухолях желудка. В общей сложности 21 из 30 малодифференцированных желудка случаев опухоли показали низкую экспрессию GP73, в то время как в умеренно дифференцированной случаев опухоли желудка это было только 9/22. Кроме того, экспрессия GP73 у пациентов мужского пола подавлялась чаще, чем у пациентов женского пола. Там не было никакой значимой корреляции между экспрессией GP73 и других клинико-патологический parameters.Table 2 Связь выражения GP73 с патологическими параметрами опухоли
Клинические параметры

GOLPH2

P-значение
<бр>
Low

высокий

Общее количество
30
22
Пол
0,027
Мужчина
28
15 <бр> Женский страница 2 7
Возраст (лет)
0,456
&л; 60
12
10
≥60
18
12 <бр> размер опухоли (см 2)
1.000
&л; 20
14
6
≥20
16
16
Дифференциация
0,049
умереннодифференцированная
9
13
малодифференцированных
21
9
Этап
0,390
I + II
12
6
III + IV
18
16
Глубина вторжения стены
1.000
T1 + T2
8
6
T3 + T4
22
16
лимфатической метастазирование
0,757
нет
7
6
Да
23
16
отдаленными метастазами
0,725
нет
25
17
Да
5 страница 5 Обсуждение
Недавно несколько исследований показали, что GP73 сверхэкспрессируется в некоторых видов рака, в том числе гепатоцеллюлярной карциномы, рака желчных протоков, рака легкого, рака простаты и семином [ ,,,0],9-15]. В гепатоцеллюлярной карциномой, высокая экспрессия GP73 была связана с размером опухоли, дифференциации, сорта и инвазии вены [7-9]. В желчных протоков карцином, экспрессия GP73 коррелирует с возрастом пациента и выживаемость [11]. При раке легкого, экспрессия GP73 была связана с гистологии опухоли и пола пациента; его экспрессия в аденокарцинома была значительно выше, чем в других типах рака легких [12]. Тем не менее, никакой корреляции с клинико-патологическими параметрами не найдено при раке предстательной железы и семиномы [13, 15]. GP73 также был найден вниз регулируется в прозрачных РКЦ клеток, что является наиболее распространенным гистологический подтип почечно-клеточного рака, в то время как его экспрессия в папиллярного и хромофобной RCC был сильным [18]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что оба GP73 мРНК и уровни белка были высоко выражены в неопухолевых желудка слизистых оболочек, которые были противоположны и в большинстве предыдущих исследований в области других видов рака.
Знание функции GP73 по-прежнему остается ограниченным. До сих пор мы знаем, что GP73 имеет важное значение для печени и почек, для поддержания нормальной функции и внешний вид. Известно также, что GP73 может функционировать при оказании помощи в перевозке белков и секреции. Одним из таких белков, sCLU, уже определены. sCLU может предотвратить апоптоз и чрезмерно экспрессируются в различных раковых заболеваний. GP73 может взаимодействовать с sCLU через домен биспиральных и помогать транспортировку и секрецию sCLU, что может объяснить связь между высокой выраженной GP73 и агрессивное поведение гепатоцеллюлярной карциномы [3]. В гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), чрезмерная экспрессия GP73 был не только обнаружен в раковых тканях, но и в сыворотке крови больных, что указывало на значительное увеличение уровней GP73 обеспечило бы маркер для раннего обнаружения. По некоторым данным, даже заявил, что GP73 является лучшим показателем, чем AFP для диагностики ГЦК [10, 11, 18, 21]. Тем не менее, какова функция GP73 в желудке и почему бы это быть понижающей регуляции при раке желудка? Это до сих пор неясно. GP73 представляет собой эпителиальные клетки-специфический белок и экспрессируется на высоком уровне в многочисленных нормальных человеческих тканях, особенно в толстой кишке и желудке. Она также преимущественно выражены в тонкой кишке, толстой кишки и желудка у мышей [22]. В соответствии с этими исследованиями, мы также обнаружили, что GP73 был высоко экспрессируется клетками, расположенными на поверхности железистой и foveolar отсек нормальной человеческой слизистой оболочки желудка. Так как самое высокое выражение GP73 в эпителиальных клетках органов пищеварения, то разумно предположить, что она может играть некоторые важные роли, неизвестные в пищеварительной системе.
Мы также нашли выражение GP73 было связано с дифференцировки опухоли. Выражение GP73 в слабо дифференцированной опухоли желудка была значительно ниже, чем в умеренно дифференцированных опухолях желудка. Было сообщено, что нокдауна из GP73 в клетках HepG2.2.15 может привести к уменьшению площади поверхности комплекса Гольджи. Поскольку размер и развитие комплекса Гольджи положительно коррелируют с дифференцировки опухоли, некоторые исследователи предположили, что GP73 выражение может быть связано с сохранением структурной целостности комплекса Гольджи во время онкогенеза [23, 24]. Недавние исследования показали, что потеря GP73 вызвало повышающей регуляции WT1, которые могут способствовать образованию гломусной и ингибировать pronephric дифференцировки канальцев. Он предположил, что GP73 играет важную роль в развитии Предпочка и дифференцировки [25]. В печеночно-клеточного рака, GP73 белок был сильно связан с размером опухоли, жильные инвазии и дифференцировки опухоли, что указывает экспрессия GP73 коррелирует с агрессивным поведением рака [10]. Кроме того, экспрессия GP73 также была связана с полом пациента. Пациенты мужского пола показали низкую экспрессию GP73 чаще, чем пациентов женского пола. Подобное явление также сообщалось при раке легкого. Пациентки имели более высокую экспрессию GP73, чем пациентов мужского пола [12]. Он также сообщил, что фенотипические изменения, наблюдаемые у мышей с укороченными GP73 С-конец являются гендерно-зависимыми [4]. Одно из возможных объяснений является то, что GP73 мРНК регулируется эстрогенами и кальцитриола [26]. Наша работа еще раз подтвердили гипотезу о том, что экспрессия GP73 находится под гормональным контролем.
Заключение
В заключение, мы обнаружили, что как мРНК GP73 и уровень белка был значительно понижающей регуляции в желудочном опухолевой ткани по сравнению с неопухолевой слизистой оболочки , а выражение GP73 было связано с дифференцировки опухоли и пола пациента. Наша дальнейшая работа будет сосредоточена на исследовании функции и механизм регуляции GP73 в желудке
Сокращения
AFP:.
Α-фетопротеин


СТЭК :
Электрохемилюминесценцию


GC:
рак желудка


GP73:
белка Гольджи 73


HCC:
Гепатоцеллюлярная карцинома


PSA:
специфического антигена простаты


PVDF:
Polyvinylidenedifluoride


RCC:.
Почечная рак


декларациях
Подтверждения
Эта работа была поддержана Программой провинциальной Чжэцзян для выращивания высокоактивных инновационных талантов здоровья.
Авторы 'оригинальные представлены файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинальных представленных файлов для изображений. 'Исходный файл для Рисунок 1 12957_2012_1362_MOESM2_ESM.tif Авторского 12957_2012_1362_MOESM1_ESM.tif авторов исходного файла для Рисунок 2 12957_2012_1362_MOESM3_ESM.tif Авторского исходного файла для фигурного 3 конкурирующими интересами
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Авторы " вклады
LGC и HJW были вовлечены в дизайн исследования, выполнил QRT-PCR, Western болтовые и иммуногистохимического анализа окрашивания, и подготовил рукопись. ZYY и HQT были вовлечены в проект исследования и руководил исследованием. HBY, FW и TPG собрали данные и помогли подготовить рукопись. XJH и YYM обеспечивала общую поддержку и помог подготовить рукопись. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Маргинальный мутная полоса и светло-голубой гребень, признаки, наблюдаемые в увеличительным узкополосного э…
• Множественные первичные злокачественные опухоли, связанные с первичной спорадических колоректального рака…