GP73 é regulada no câncer gástrico e associado a tumor differentiation

GP73 é regulada no cancro gástrico e associada com a diferenciação do tumor da arte abstracta
Fundo
proteína Golgi 73 (GP73) é uma proteína transmembrana Golgi tipo II . É sobre-expressos em vários cancros, incluindo carcinoma hepatocelular, carcinoma do ducto biliar, o cancro do pulmão e cancro da próstata. No entanto, existem poucos relatos de GP73 em câncer gástrico. Este estudo teve como objetivo investigar a expressão de GP73 e sua relação com caracteres patológicos clínicos em câncer gástrico.
Métodos
mRNA GP73 nível foi determinado por quantitativo em tempo real RT-PCR em 41 pares de tecidos tumorais gástricas combinados e tecidos mucosos adjacentes não-tumoral. Western blotting foi também realizado para detectar o nível da proteína GP73. a expressão da proteína GP73 foi analisada por imuno-histoquímica em 52 pacientes com câncer gástrico clinicamente caracterizadas e 10 controles de tecido da mucosa gástrica não-tumorais.
Resultados
O nível de proteína de GP73 mRNA e foram significativamente regulada para baixo em tecidos tumorais gástricas em comparação com o tecidos mucosos não-tumoral. Na mucosa não-tumoral, forte coloração citoplasmática difusa pode ser observado nas células localizadas na superfície do compartimento glandular e foveolar; enquanto em tecidos tumorais, a coloração era muito mais fraco ou mesmo ausente, e, principalmente, em um padrão de coloração dot-like semi-granular. O nível de proteína GP73 expressão foi associada com o sexo dos pacientes e diferenciação do tumor.
Conclusões
GP73 foi normalmente expressos em mucosa gástrica não-tumoral e sub-regulada no cancro gástrico. A sua expressão em cancro gástrico foi correlacionada com a diferenciação do tumor. Palavras-chave

GP73 tumor do cancro gástrico diferenciação fundo
GP73, também conhecido como GOLM1 e GOLPH2, é uma proteína transmembranar do tipo II de Golgi. Estruturalmente, GP73 contém um curto domínio citoplasmático N-terminal, um domínio transmembranar e um domínio C-terminal do lúmen maior, que é composta de um domínio em espiral espiralada e uma cauda ácido. O domínio luminal do terminal C é a principal função do domínio de GP73 [1-3]. Os ratinhos com um truncamento grave do GP73 C-terminal mostrou diminuição da sobrevivência e anomalias graves epiteliais do rim e do fígado [4]. O domínio de filamento helicoidal poderia interagir com ambos precursora e madura sCLU, indicando que GP73 pode ajudar na modificação pós-tradução, transporte e secreção de sCLU [5]. Um local de reconhecimento proproteinconvertase R 52VRR 55 está localizado dentro do ectodomínio do terminal C; clivagem mediada por PC de GP73 transforma o intracelular, GP73 localizada-Golgi para uma proteína solúvel, secretora [6]. No entanto, a função de GP73 é ainda pouco claro.
GP73 foi identificado pela primeira vez a partir de uma biblioteca de ADNc derivada a partir do fígado de um paciente com hepatite de células gigantes adulto. É considerada uma proteína específica da célula epitelial, que é altamente expresso no cólon, estômago, próstata e traqueia em pessoas normais e saudáveis ​​[1]. doença do fígado, tais como a infecção pelo vírus e cirrose, pode sobre-regular a expressão de GP73 em hepatócitos [1, 7, 8]. Estudos recentes mostraram que GP73 foi sobre-expresso em vários tipos de câncer, como o carcinoma hepatocelular [9-11], carcinomas do ducto biliar [11], adenocarcinomas do pulmão [12], o câncer de próstata [13, 14] e seminomas [15]. A expressão de GP73 em cancro renal é muito mais abrangente. Foi relatado como sub-regulada na maioria dos cancros das células renais de células claras (RCC), mas altamente expresso em carcinomas renais papilares e chromophobe [16]. Soro GP73 também foi encontrado em elevados carcinomas hepatocelulares, carcinomas do ducto biliar e adenocarcinomas do pulmão. Ele ainda mostrou uma vantagem sobre α-fetoproteína (AFP) para o diagnóstico de carcinoma hepatocelular precoce [17, 18]. Além disso, a expressão do mRNA da GP73 na urina superou PSA na detecção de câncer de próstata [13].
O câncer gástrico é um dos cancros mais comuns e a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Tem frequências particularmente elevados na China [19]. Até agora, os fatores etiológicos e patogênese do câncer gástrico não foram totalmente compreendidos. Neste estudo, pretendemos investigar a expressão de GP73 e sua relação com caracteres patológicos clínicos em câncer gástrico medindo o nível de mRNA e expressão de proteína GP73 em tecidos da mucosa não-tumorais tumorais e adjacentes gástricas.
Métodos
materiais e pacientes
Quarenta e um pares de tecidos tumoral e ao lado da mucosa não tumoral gástrico combinados (> 5 centímetros da borda do tumor) foram obtidas de pacientes com câncer gástrico primário no Hospital Zhejiang Provincial Popular, China, de janeiro 2011 a dezembro de 2012. As características de 41 GCsare mostrado na Tabela 1. Após a remoção cirúrgica, os tecidos foram imediatamente congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até use.Table 1 Resumo das características clinicopatológicas de doentes com cancro gástrico
Clínica parâmetros
N (%)
Sexo Procurando Homens em 27 (65,9) Procurando Mulheres em 14 (34,1)
Tamanho
23 (56,1 ) Art < 20
18 (43,9)
≧ 20
diferenciação histológica
Bem Sims 3 (7.3)
Moderadamente
17 (41,5)
mal
21 (51,2)
linfática metástase
Sem
11 (26,8)
Sim
30 (73,2)
metástases à distância
Sem
34 (82,9)
Sim
7 (17,1)
estágio TNM
I
8 (19,5)
II
17 (41,5)
III
10 (24,4)
IV
6 (14,6)
Cinquenta e dois espécimes de parafina de câncer gástrico de tecido (GC) (43 homens e 9 mulheres) foram adquiridos de Hospital de Zhejiang Provincial Popular, coletados entre 2010 e 2011. Todos os casos de gástrica câncer foram classificados de acordo com a classificação da OMS e encenado por meio de sistema pTNM [20]. Os casos consistiu de 22 patientsaged < 60 anos, 30 pacientes com idades entre ≥60years; 20 pacientes com o tamanho < tumor de 5cm, 32 pacientes com a ≥5cm tamanho do tumor; 22 pacientes com câncer moderadamente diferenciado, 30 pacientes com câncer pouco diferenciado; 14 pacientes com T1 ou T2 invasão da parede, 38 pacientes com T3 ou T4 parede invasão; 39 pacientes com metástase ganglionar e 13 pacientes sem metástase ganglionar; 10 pacientes com metástases à distância e 42 pacientes sem metástases à distância. O número de pacientes classificados por TNM fase foram as seguintes: 18, na fase de TNM I ou II; 34 na fase TNM III ou IV. Os pacientes tinham entre 32 e 84 anos de idade, e não houve radioterapia ou quimioterapia antes da operação. Os espécimes foram fixados em formalina e embebidos em parafina. espécimes de tecidos Tennormal do estômago a partir de pacientes sem tumores malignos foram também obtidas por endoscopia como o grupo de controlo. Todos os pacientes
fornecida consentimento informado para a utilização dos seus tecidos antes da cirurgia. O uso de todas as amostras foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital de Zhejiang Provincial Popular.
Quantitative PCR em tempo real
qRT-PCR foi realizada para determinar o nível de mRNA de GP73. Resumidamente, ARN total foi extraído a partir de 40 pares de amostras tumorais e adjacentes gástricas correspondentes não-tumorais de tecidos de mucosa, utilizando Trizol (Invitrogen, Camarillo, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. a síntese de ADNc foi realizada com o kit PrimeScript primeira cadeia de cDNA Synthesis (Takara, DaLian, China), utilizando 1 ug de ARN total como molde e OligodT iniciador com menos de 65 ° C, 5 minutos, 42 ° C, 60 minutos e 70 ° C, 10 minutos de transcrição reversa. O ADNc resultante foi amplificado por qPCR utilizando iniciadores específicos com SYBR Premix Ex Taq (Takara, DaLian, China). GAPDH foi usada como um controlo interno. Primers para GP73 foram 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(sentido) e 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (anti-sentido). Os iniciadores para GAPDH foram 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(sentido) e 5'-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (anti-sentido). parâmetros de PCR foram as seguintes: 95 ° C durante 5 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 10s, 60 ° C durante 20s e 72 ° C durante 20s. No final dos ciclos de PCR, foi realizada a análise de fusão curva. A expressão relativa de GP73 para GAPDH foi calculada usando 2 -ΔCT método.

Blotting de Western blotting de Western foi realizada para investigar o nível de proteína GP73 em 5 de 41 pares de tecido tumoral adjacente gástrica e não-tumoral tecido da mucosa. A proteína foi isolada a partir de amostras de tecidos a seguir a extracção de ARN. E aproximadamente 30 ug de proteína foram separados em gel de poliacrilamida a 10% durante duas horas. Depois de ter sido transferido para uma membrana de polyvinylidenedifluoride (PVDF) (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut, EUA), as amostras foram sondadas com anticorpos primários contra GP73 (1: 2000, Sigma, St. Louis, MO, EUA) e β-actina ( 1: 5000, Sigma, EUA) a 4 ° Covernight. Após incubação com anticorpo secundário (1: 5.000, CapitalBio, Beijing, China) durante 2 horas, as membranas foram tratadas com electroquimioluminescência (ECL) reagente (Generay, Xangai, China) e expostos a autoradiographicfilms
coloração imuno-histoquímica
imuno-histoquímica. coloração foi realizada pelo método padrão. Resumidamente, 52 casos de tecidos tumorais gástricos embebidos em parafina e 10 casos de controlos de tecido da mucosa não-tumorais adjacentes foram cortadas com 5 um de espessura e colocadas em lâminas microscópicas e secou-se numa estufa a 60 ° C durante 2 h. Em seguida, as secções foram de-parafinado em xileno, re-hidratada usando um gradiente de concentrações de etanol, microondas em tampão de citrato 10 mM durante 15 minutos para recuperar o antigénio, bloquearam-se com peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 minutos, para inibir a actividade da peroxidase endógena e incubadas com 10 % de soro de cabra não imune durante 20 minutos para reduzir a coloração de fundo não específico. Depois disso, as secções foram incubadas com o anticorpo policlonal anti-GP73 de coelho (Abcam, Cambridge, Reino Unido) (diluição 1: 100) a 4 ° C durante a noite, em seguida, incubadas com o anticorpo secundário marcado com biotina (Invitrogen, EUA), à temperatura ambiente durante 20 minutos, seguida por incubação com estreptavidina conjugada com HRP (Invitrogen, EUA), à temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida, o desenvolvimento da cor foi realizada com um kit de substrato DAB (Dako, Carlsbad, EUA). Finalmente, as secções foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas, foi afastada e montado.
Avaliação dos immunohistochemicalstainings
Os immunohistochemicalstainings de GP73 foram marcados por dois patologistas de forma independente, com base na intensidade e a proporção de células coradas positivamente. intensidade da coloração foi avaliada com um sistema de classificação de quatro níveis: 0 = negativo, 1 = fraco, 2 = moderada e 3 = forte. A percentagem de células positivas foram pontuadas como se segue: 0 para não células coradas, uma a 1% a 25% de células coradas, 2 para 26 a 50% de células coradas, 3 para 51 a 75% de células coradas e 4 para mais do que 75% de células coradas. Pontuações para intensidade e porcentagem de células positivas foram multiplicados. Pontuações ≤ 3 foi utilizado para definir tumores com baixa expressão e dezenas GP73 ≥4 com expressão alta GP73.
Análise estatística
análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EUA). A-amostras pareadas t-teste foi utilizado para analisar as diferenças de expressão de mRNA GP73 entre tecidos tumorais e não tumorais. O teste do qui-quadrado foi aplicado para avaliar a significância estatística das associações entre a expressão GP73 e os parâmetros clínico. P Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Resultados
nível de expressão GP73 em tecido de tumor gástrico e não-tumoral
expressão de mRNA GP73 foi significativamente diminuída em tecidos tumorais gástricas em comparação com o lado não-tumoral. tecidos (33/41; 80,5%). Os níveis de GP73 em relação à expressão de GAPDH foram muito mais baixos em tecidos tumorais gástricas (0,259 ± 0,308) do que em tecidos da mucosa não-tumorais (0,584 ± 0,523; P
< 0,01; Figura 1). Consistente com a RT-qPCR, nível de proteína GP73 em amostras de tumor gástrico foi significativamente menor do que a das amostras não-tumorais, que foi testada por transferência de Western (Figura 2). Figura expressão GP73 um mRNA em tecidos tumorais e tecidos da mucosa gástrica não-tumorais adjacentes.
Figura 2 nível de proteína GP73 em amostras tumorais gástricas e amostras de mucosa não-tumorais adjacentes. A) nível de proteína GP73 em amostras tumorais gástricas e amostras de mucosa não-tumorais adjacentes. B) nível de ARNm GP73 nas mesmas amostras tumorais gástricas e amostras de mucosa não-tumorais adjacentes. C) câncer gástrico; N:. Normal)
Correlação entre a expressão da proteína GP73 e os parâmetros clínico-patológicas
IHC mostraram que GP73 foi altamente expressa no tecido da mucosa não tumoral adjacente, mas diminuiu ou mesmo ausentes em tecidos tumorais gástricas. Na mucosa não-tumoral, forte coloração citoplasmática difusa pode ser observado nas células localizadas na superfície do compartimento glandular e foveolar (Figura 3A). Em tecidos de tumor, a expressão GP73 foi expressa principalmente em um padrão de coloração distinta semi-granulado ponto semelhante (Figura 3B, C). Apenas alguns tecidos tumorais gástricas foram encontrados com forte expressão de GP73 (Figura 3D). Figura 3 a expressão da proteína GP73 em tecidos tumorais e tecidos da mucosa gástrica não-tumorais adjacentes. A) forte expressão de GP73 em tecidos não tumorais. B) fraca expressão de GP73 em tecidos tumorais gástricas. C) Moderado expressão de GP73 em tecidos tumorais gástricas. D) forte expressão de GP73 em tecidos tumorais gástricas. a, b, c, d: ampliação original 100 ×. A, B, C, D:. Ampliação original 200 ×
A correlação entre a expressão da proteína e variáveis ​​clínicas GP73 é mostrado na Tabela 2. O nível de expressão de GP73 foi significativamente relacionado com o sexo dos pacientes (P =
0,027) e diferenciação (P = 0,049
). A expressão de GP73 em tumores gástricos pouco diferenciadas era muito menor do que em tumores gástricos moderadamente diferenciadas. Um total de 21 dos 30 casos de tumor gástrico pouco diferenciados apresentaram baixa expressão GP73, enquanto que nos casos de tumor gástrico moderadamente diferenciadas apenas 9/22 era. Além disso, a expressão de GP73 em pacientes do sexo masculino foi regulada para baixo com mais freqüência do que em pacientes do sexo feminino. Não houve correlação significativa entre a expressão de GP73 e outras parameters.Table clinicopatológico 2 Relação de expressão GP73 com os parâmetros patológicos de tumor
parâmetros clínicos
GOLPH2
P-valor


Baixa
alta
número total
30
22
Sexo
0,027
Masculino
28
15
fêmea Página 2
7
Idade (anos)
0,456
< 60
12
10
≥60
18
12
O tamanho do tumor (cm2)
1.000 Art < 20
14
6
≥20
16
16
Diferenciação
0,049
moderadamente diferenciado
9
13
pouco diferenciado
21
9
Stage
0,390
I + II
12
6
III + IV
18
16
profundidade de invasão da parede
1.000
T1 + T2
8
6
T3 + T4
22
16
linfática metástase
0,757
Sem
7
6
Sim
23
16
Distante metástase
0,725
Sem
25
17
Sim
5
5
Discussão
recentemente, vários estudos mostraram que o GP73 é sobre-expresso em alguns tipos de câncer, incluindo o carcinoma hepatocelular, carcinoma do ducto biliar, o cancro do pulmão, cancro da próstata e seminomas [ ,,,0],9-15]. Em carcinomas hepatocelulares, de elevada expressão de GP73 foi associada com o tamanho do tumor, diferenciação, grau de invasão e veia [7-9]. Em carcinomas do ducto biliar, expressão GP73 correlacionada com a idade do paciente e sobrevivência [11]. No cancro do pulmão, expressão GP73 foi associada com a histologia do tumor e sexo do paciente; a sua expressão no adenocarcinoma foi significativamente mais elevada do que em outros tipos de cancro do pulmão [12]. No entanto, nenhuma correlação com os parâmetros clínico foi encontrado no cancro da próstata e seminomas [13, 15]. GP73 também foi encontrado regulada para baixo em RCC de células claras, que é o subtipo histológico mais comum de cancro das células renais, enquanto a sua expressão em papilar e cromófobo RCC era forte [18]. No presente estudo, verificou-se que tanto GP73 mRNA e os níveis de proteína foram altamente expresso nas mucosas gástricas não-tumorais, que eram oposto da maioria dos estudos anteriores em outros tipos de câncer.
O conhecimento da função do GP73 ainda é limitado. Até agora, sabemos que GP73 é essencial para o fígado e os rins para manter a função normal e aparência. Sabe-se também que GP73 pode funcionar para auxiliar no transporte de proteínas e secreção. Uma tal proteína, sCLU, já foi identificado. sCLU poderia impedir a apoptose e é sobre-expressos em vários cancros. GP73 poderia interagir com sCLU através de domínio de hélice enrolada e ajudar transporte e secreção de sCLU, o que pode explicar a associação entre a alta expressa GP73 e o comportamento agressivo de carcinoma hepatocelular [3]. No carcinoma hepatocelular (HCC), a sobre-expressão de GP73 não só foi detectado em tecidos de cancro, mas também no soro dos pacientes, o que indica o aumento significativo dos níveis de GP73 iria proporcionar um marcador para a detecção precoce. Alguns relatórios até mesmo afirmou que GP73 é um marcador melhor do que AFP para o diagnóstico de HCC [10, 11, 18, 21]. No entanto, qual é a função de GP73 no estômago e por que seria regulada no cancro gástrico? Este ainda é incerto. GP73 é uma proteína específica da célula epitelial e altamente expresso em numerosos tecidos humanos normais, especialmente no cólon e do estômago. Também é expressa predominantemente no intestino delgado, cólon e estômago de ratos [22]. Consistente com estes estudos, também descobrimos que GP73 foi altamente expressa por células localizadas na superfície do compartimento glandular e foveolar da mucosa gástrica humana normal. Desde a mais alta expressão de GP73 é nas células epiteliais dos órgãos digestivos, é razoável presumir que ele pode jogar alguns papéis importantes, desconhecidos no sistema digestivo.
Encontramos também a expressão de GP73 foi associada com a diferenciação do tumor. A expressão de GP73 em tumores gástricos pouco diferenciadas era muito menor do que em tumores gástricos moderadamente diferenciadas. Foi relatado que knock-down de GP73 em células HepG2.2.15 poderia causar uma redução na área de superfície do complexo de Golgi. Uma vez que o tamanho e o desenvolvimento do complexo de Golgi são positivamente correlacionados com a diferenciação do tumor, alguns investigadores a hipótese de que a expressão de GP73 pode ser associada com a manutenção da integridade estrutural do complexo de Golgi durante oncogénese [23, 24]. Estudos recentes demonstraram que a perda de GP73 causou a sobre-regulação de WT1, o que pode promover a formação de Glomus e inibir a diferenciação túbulo pronephric. É sugerido que GP73 desempenha um papel importante no desenvolvimento e diferenciação pronephros [25]. No carcinoma hepatocelular, a proteína GP73 foi fortemente associado com o tamanho do tumor, invasão veia e diferenciação tumoral, sugerindo expressão GP73 está correlacionada com o comportamento agressivo de cancro [10]. Além disso, a expressão de GP73 também foi associado com sexo do paciente. Pacientes do sexo masculino apresentaram baixa expressão GP73 mais freqüência do que pacientes do sexo feminino. Um fenómeno semelhante foi também relatada no cancro do pulmão. Pacientes do sexo feminino teve maior expressão de GP73 do que pacientes do sexo masculino [12]. Também está relatado que alterações fenotípicas observadas em ratinhos com GP73 truncados C-terminal está dependente do género [4]. Uma explicação é que GP73 ARNm é regulada por estrogénios e calcitriol [26]. Nosso trabalho novamente confirmou a hipótese de que a expressão GP73 está sob controle hormonal.
Conclusão
Em conclusão, verificou-se que tanto o mRNA GP73 e nível de proteína foi significativamente regulada para baixo em tecidos tumorais gástricas em comparação com a mucosa não-tumoral e a expressão de GP73 foi associada com a diferenciação do tumor e sexo do paciente. Nosso trabalho adicional incidirá sobre a investigar a função e o mecanismo de regulação de GP73 no estômago
abreviações
AFP:.
Α-fetoproteína
ECL :
eletroquimioluminescência
GC:
O câncer gástrico
GP73:
proteína Golgi 73

HCC:
carcinoma hepatocelular
PSA:
antígeno específico da próstata
PVDF:
Polyvinylidenedifluoride
RCC:.
câncer de células renais
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Provincial de Zhejiang para o cultivo de alto nível talentos saúde inovadores.
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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes. Autores
' contribuições
LGC e HJW estavam envolvidos no desenho do estudo, realizado a qRT-PCR, parafusos Ocidental e análise de coloração imuno-histoquímica, e elaborou o manuscrito. ZYY e HQT estavam envolvidos no desenho do estudo e supervisionou o estudo. HBY, FW e TPG dados coletados e ajudou a redigir o manuscrito. XJH e yym prestado apoio geral e ajudou a redigir o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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