GP73 est régulée à la baisse dans le cancer gastrique et associé à une tumeur differentiation

GP73 est régulée à la baisse dans le cancer gastrique et associé à la différenciation de la tumeur
protéine Golgi 73 (GP73) de résumé de l'arrière-plan est une Golgi protéine transmembranaire de type II . Il est surexprimée dans plusieurs types de cancers, y compris le carcinome hépatocellulaire, carcinome des voies biliaires, cancer du poumon et le cancer de la prostate. Cependant, il y a peu de rapports de GP73 dans le cancer gastrique. Cette étude vise à étudier l'expression de GP73 et sa relation avec les caractères cliniques pathologiques dans le cancer gastrique.
Méthodes
GP73 ARNm niveau a été déterminée par quantitative en temps réel RT-PCR dans 41 paires de tissus tumoraux gastriques appariés et les tissus de la muqueuse non tumorales adjacentes. Transfert de Western a également été effectuée pour détecter le niveau de la protéine GP73. GP73 expression de la protéine a été analysée par immunohistochimie dans 52 patients atteints de cancer gastrique caractérisé cliniquement et 10 témoins non-tumoraux tissus de la muqueuse gastrique.: Résultats
L'ARNm et le niveau de GP73 de protéines étaient significativement régulée à la baisse dans les tissus tumoraux gastriques par rapport à la les tissus de la muqueuse non tumorales. Dans la muqueuse non tumorale, une forte coloration cytoplasmique diffuse peut être observée dans les cellules situées à la surface du compartiment glandulaire et fovéolaire; tandis que dans les tissus tumoraux, la coloration était beaucoup plus faible voire absent, et surtout dans un motif de coloration de points analogue à semi granulaire. Le niveau de la protéine GP73 d'expression a été associée à l'égalité entre les patients et la différenciation de la tumeur.
Conclusions
GP73 a été normalement exprimée dans la muqueuse gastrique non-tumoraux et régulée à la baisse dans le cancer gastrique. Son expression dans le cancer gastrique a été corrélée avec la différenciation de la tumeur.
Mots-clés
GP73 gastrique tumeur cancéreuse différenciation fond
GP73, également connu sous GOLM1 et GOLPH2, est une protéine de type II de Golgi transmembranaire. Structurellement, GP73 contient un domaine court N-terminal cytoplasmique, un domaine transmembranaire et un domaine C-terminal luminal plus grand qui est composé d'un domaine à enroulement en spirale et une queue acide. Le domaine luminal C-terminal est le principal domaine de fonction de GP73 [1-3]. Des souris présentant une troncature sévère de la GP73 C-terminale a montré une diminution des anomalies sévères epitheliales du rein et la survie et le foie [4]. Le domaine de superhélice peut interagir à la fois précurseur et mature sCLU, ce qui indique que la GP73 pourrait contribuer à la modification post-traductionnelle, le transport et la sécrétion de sCLU [5]. Un site de reconnaissance de proproteinconvertase R 52VRR 55 est situé dans l'ectodomaine C-terminal; le clivage à médiation par PC de GP73 transforme le intracellulaire, GP73 localisée de Golgi, une protéine sécrétoire soluble dans [6]. Cependant, la fonction de GP73 est encore peu clair.
GP73 a été identifié à partir d'une banque d'ADNc dérivée à partir du foie d'un patient atteint d'hépatite adulte à cellules géantes. Elle est considérée comme une protéine spécifique d'une cellule épithéliale, qui est fortement exprimé dans le côlon, de l'estomac, de la prostate et de la trachée chez des personnes normales en bonne santé, [1]. Les maladies du foie, telles que l'infection virale et une cirrhose, pourrait réguler à la hausse l'expression de la GP73 dans des cellules hépatiques [1, 7, 8]. Des études récentes ont montré que GP73 est surexprimée dans plusieurs types de cancers, tels que les carcinomes hépatocellulaires [9-11], les carcinomes des voies biliaires [11], des adénocarcinomes du poumon [12], le cancer de la prostate [13, 14] et séminomes [15]. L'expression de la GP73 dans le cancer du rein est beaucoup plus complet. Il a été rapporté comme régulé à la baisse dans la majorité des cancers des cellules rénales de cellules claires (RCC), mais hautement exprimé dans les carcinomes rénaux papillaires et chromophobes [16]. Sérum GP73 a également été trouvé élevée dans hépatocarcinomes, les cancers des voies biliaires et des adénocarcinomes pulmonaires. Il a même montré un avantage par rapport α-foetoprotéine (AFP) pour le diagnostic précoce des carcinomes hépatocellulaires [17, 18]. En outre, l'expression de l'ARNm de GP73 dans l'urine a surperformé PSA sérique pour détecter le cancer de la prostate [13].
Le cancer gastrique est l'un des cancers les plus fréquents et la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde entier. Il a particulièrement hautes fréquences en Chine [19]. Jusqu'à présent, les facteurs étiologiques et la pathogenèse du cancer gastrique ont pas été entièrement compris. Dans cette étude, nous cherchons à étudier l'expression de la GP73 et sa relation avec les caractères cliniques pathologiques dans le cancer gastrique en mesurant le niveau de GP73 ARNm et l'expression des protéines dans les tissus des muqueuses non-tumoraux tumoraux et adjacentes gastriques.
Méthodes
Matériaux et patients
Quarante et une des paires de tissus de la muqueuse non-tumoraux tumoraux et adjacent gastriques appariés (> 5cm à partir du bord de la tumeur) ont été obtenus chez les patients atteints de cancer gastrique primaire à l'Hôpital du Zhejiang populaire de la province, la Chine de Janvier 2011 à Décembre 2012. Les caractéristiques des 41 GCsare présentés dans le tableau 1. Après l'ablation chirurgicale, les tissus ont été immédiatement congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à ce que use.Table 1 Résumé des caractéristiques clinico-pathologiques des patients atteints de cancer gastrique clinique
paramètres
N (%)
Sexe
14 (34.1)
Taille homme
27 (65,9)
Femmes
23 (56,1 )
< 20
18 (43,9)
≧ 20
différenciation histologiques
bien
3 (7.3)
Modérément
17 (41,5)
mal
21 (51,2)
lymphatique métastase
No
11 (26,8)
Oui
30 (73,2)
métastases à distance
Non
34 (82,9)
Oui
7 (17.1)
stade TNM
I
8 (19,5)
II
17 (41,5)
III
10 (24,4)
IV
6 (14,6)
Cinquante-deux échantillons de paraffine de cancer gastrique (GC) de tissu (43 hommes, 9 femmes) ont été acquis auprès de l'Hôpital populaire de la province du Zhejiang, recueillies de 2010 à 2011. Tous les cas de l'estomac le cancer ont été classés selon la classification de l'OMS et mis en scène par le biais du système de pTNM [20]. Les cas se composait de 22 patientsaged < 60 ans, 30 patients de ≥60years ans; 20 patients atteints de la taille de la tumeur < 5cm, 32 patients avec le ≥5cm de taille de la tumeur; 22 patients atteints d'un cancer modérément différencié, 30 patients atteints d'un cancer peu différencié; 14 patients avec T1 ou invasion de la paroi T2, 38 patients avec T3 ou T4 paroi invasion; 39 patients avec métastases ganglionnaires et 13 patients sans métastase ganglionnaire; 10 patients atteints de métastases à distance et 42 patients sans métastases à distance. Le nombre de patients classés par stade TNM étaient les suivants: 18 étaient au stade TNM I ou II; 34 au stade TNM III ou IV. Les patients étaient âgés de 32 et 84 ans, et il n'y a pas eu de radiothérapie ou une chimiothérapie avant l'opération. Les spécimens ont été fixés par du formol et inclus dans de la paraffine. des échantillons de tissus Tennormal de l'estomac de patients sans tumeurs malignes ont également été obtenus par endoscopie comme groupe témoin.
Tous les patients ont donné leur consentement éclairé pour l'utilisation de leurs tissus avant la chirurgie. L'utilisation de tous les échantillons a été approuvé par le comité d'éthique de l'Hôpital populaire de la province du Zhejiang.
Quantitative PCR en temps réel
qRT-PCR a été effectuée pour déterminer le niveau de GP73 de l'ARNm. En bref, l'ARN total a été extrait de 40 paires de spécimens tumoraux gastriques et adjacents appariés non tumorales tissu muqueux, en utilisant du Trizol (Invitrogen, Camarillo, USA) selon les instructions du fabricant. la synthèse d'ADNc a été réalisée avec le kit PrimeScript premier brin d'ADNc Synthèse (Takara, Dalian, Chine), en utilisant 1 pg d'ARN total comme matrice et oligodT amorce de moins de 65 ° C, 5 minutes, 42 ° C, 60 minutes et 70 ° C, 10 minutes de transcription inverse. L'ADNc résultant a été amplifié par qPCR en utilisant des amorces spécifiques avec SYBR Premix Taq Ex (Takara, DaLian, Chine). GAPDH a été utilisé comme témoin interne. Qu'amorces pour GP73 étaient 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(sens) et 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (anti-sens). Amorces pour GAPDH étaient 5'TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(sens) et 5'CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (antisens). paramètres de la PCR étaient les suivantes: 95 ° C pendant 5 minutes, suivi par 40 cycles de 95 ° C pendant 10 secondes, 60 ° C pendant 20s et 72 ° C pendant 20s. A la fin des cycles de PCR, analyse de la courbe de fusion a été effectuée. L'expression relative de GP73 à GAPDH a été calculé en utilisant 2 -ΔCT méthode.
Blot
Western blot Western a été réalisée pour étudier le niveau de la protéine GP73 dans 5 41 paires de tissus tumoraux gastrique et adjacent non-tumoraux le tissu muqueux. La protéine a été isolé à partir d'un échantillon tissulaire suite à l'extraction de l'ARN. Et d'environ 30 pg de protéine a été séparé sur un gel de polyacrylamide à 10% pendant deux heures. Après avoir été transféré à un polyvinylidène (PVDF) (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut, États-Unis), les échantillons ont été sondés avec des anticorps primaires contre GP73 (1: 2000, Sigma, St. Louis, MO, USA) et β-actine ( 1: 5000, Sigma, USA) à 4 ° Covernight. Après incubation avec un anticorps secondaire (1: 5000, CapitalBio, Beijing, Chine) pendant 2 heures, les membranes ont été traitées avec électrochimiluminescence (ECL) réactif (Generay, Shanghai, Chine) et exposé à autoradiographicfilms
coloration immunohistochimique
immunohistochimique. la coloration a été réalisée par la méthode standard. En bref, 52 cas de tissus gastriques tumeurs de paraffine et 10 cas de contrôles de tissus muqueux adjacents non-tumoraux ont été coupées à 5 um d'épaisseur et placés sur des lames microscopiques et séchées dans un four à 60 ° C pendant 2 heures. Ensuite, les sections ont été retirés de paraffinées dans le xylene, réhydratées en utilisant un gradient de concentrations d'éthanol, microwaved dans 10 mM de tampon citrate pendant 15 minutes pour extraire l'antigène, bloquées avec 3% de peroxyde d'hydrogène pendant 10 minutes pour inhiber l'activité de peroxydase endogène et mises en incubation avec 10 % de sérum de chèvre non immun pendant 20 minutes pour réduire la coloration de fond non spécifique. Après cela, les sections ont été incubées avec l'anticorps de lapin anti-GP73 polyclonal anticorps (Abcam, Cambridge, UK) (dilution 1: 100) à 4 ° C pendant une nuit, puis incubées avec un anticorps secondaire marqué à la biotine (Invitrogen, Etats-Unis) à la température ambiante pendant 20 minutes, suivi d'une incubation avec de la streptavidine conjuguée à HRP (Invitrogen, Etats-Unis) à la température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, le développement de la couleur a été réalisée avec un kit DAB Substrate (Dako, Carlsbad, États-Unis). Évaluation des Enfin, les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline, déshydratées, effacés et montés. Des immunohistochemicalstainings
Les immunohistochemicalstainings de GP73 ont été marqués par deux pathologistes indépendamment, en fonction de l'intensité et de la proportion de cellules colorées positivement. intensité de coloration a été évaluée à l'aide d'un système de classement à quatre niveaux: 0 = négatif, 1 = faible, 2 = modérée et 3 = forte. Le pourcentage de cellules positives ont été notés comme suit: 0 pour aucune cellule colorée, 1 à 1% à 25% des cellules colorées, 2 26 à 50% des cellules colorées, 3 51 à 75% des cellules colorées et 4 pour plus d' de 75% des cellules colorées. Scores pour l'intensité et le pourcentage de cellules positives ont été multipliées. Scores ≤3 a été utilisé pour définir les tumeurs avec une faible expression de GP73 et les scores ≥4 avec l'expression élevée de GP73.
Analyse statistique
analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Le test t pour des échantillons appariés a été utilisé pour analyser les différences d'expression GP73 ARNm entre la tumeur et les tissus non tumoraux. test du chi carré a été utilisé pour évaluer la signification statistique des associations entre l'expression de GP73 et les paramètres clinicopathologiques. P
< 0,05 a été considérée comme statistiquement significative
Résultats
niveau d'expression GP73 dans le tissu tumoral gastrique et non-tumoraux
expression GP73 ARNm a été significativement diminué dans les tissus tumoraux gastriques par rapport à la adjacente non-tumoraux. tissus (33/41; 80,5%). Les niveaux de GP73 par rapport à la GAPDH d'expression étaient beaucoup plus faibles dans les tissus tumoraux gastriques (0,259 ± 0,308) que celle dans les tissus muqueux non tumorales (0,584 ± 0,523; P
< 0,01; figure 1). Compatible avec la RT-PCR quantitative, GP73 teneur en protéines dans les échantillons de tumeur gastrique était significativement inférieure à celle des échantillons non tumorales, qui a été testée par Western blot (figure 2). Figure 1 GP73 expression de l'ARNm dans les tissus tumoraux gastriques et les tissus non tumoraux adjacents muqueuses.
Figure 2 GP73 niveau de protéines dans des échantillons tumoraux gastriques et des échantillons muqueuses adjacentes non-tumoraux. A) le niveau de la protéine GP73 dans des échantillons tumoraux gastriques et des échantillons de muqueuses adjacentes non-tumoraux. B) au niveau de l'ARNm GP73 dans les mêmes échantillons tumoraux gastriques et des échantillons de muqueuse adjacents non tumorales. C) de cancer de l'estomac; N:. Normal)
Corrélation entre GP73 expression de la protéine et les paramètres clinicopathologiques
IHC ont montré que GP73 a été fortement exprimée dans les tissus non-tumoraux adjacente muqueuse, mais a diminué ou même absentes dans les tissus tumoraux gastriques. Dans la muqueuse non tumorale, une forte coloration cytoplasmique diffuse peut être observée dans les cellules situées à la surface du compartiment glandulaire et fovéolaire (figure 3A). Dans les tissus tumoraux, l'expression GP73 a été principalement exprimé dans un semi-granulaire coloration motif de points comme distincte (figure 3B, C). Seuls quelques tissus tumoraux gastriques ont été trouvés avec une forte expression de GP73 (Figure 3D). La figure 3 GP73 l'expression des protéines dans les tissus tumoraux et les tissus de la muqueuse gastrique adjacentes non tumorales. A) Une forte expression de la GP73 dans les tissus non tumoraux. B) Une faible expression de GP73 dans les tissus tumoraux gastriques. C) expression modérée de GP73 dans les tissus tumoraux gastriques. D) Une forte expression de GP73 dans les tissus tumoraux gastriques. a, b, c, d: grossissement 100 ×. A, B, C, D:. Grossissement original 200 ×
La corrélation entre l'expression des protéines et des variables cliniques GP73 est présentée dans le tableau 2. Le niveau d'expression de GP73 était significativement liée au sexe des patients (P =
0,027) et de différenciation (P = 0,049
). L'expression de la GP73 dans les tumeurs gastriques mal différenciées était beaucoup plus faible que dans les tumeurs gastriques modérément différenciées. Un total de 21 cas sur 30 de tumeurs gastriques peu différenciés a montré une faible expression de GP73, tandis que dans les cas de tumeur gastrique modérément différenciées, il était seulement 9/22. En outre, l'expression du GP73 chez les patients de sexe masculin a été régulée à la baisse plus fréquemment que chez les patients de sexe féminin. Il n'y avait pas de corrélation significative entre l'expression de GP73 et d'autres parameters.Table clinicopathologique 2 Relation d'expression GP73 avec des paramètres pathologiques de la tumeur
paramètres cliniques
GOLPH2
P-valeur

High
nombre total de
Low
30
22
Sexe
0,027
Homme
28
15
Femme 2
7
âge (années)
0,456
< 60
12
10
≥60
18
12
taille de la tumeur (cm2)
1.000
< 20
14
6
≥20
16
16
Différenciation
0,049
Modérément différenciée
9
13
mal différencié
21
9
Stage
0,390
I + II
12
6
III + IV
18
16
Profondeur d'invasion de la paroi
1.000
T1 + T2 8
6
T3 + T4
22
16
lymphatique métastase
0,757
Non
7
6
Oui
23
16
métastases à distance
0,725
No
25
17
Oui
5
5
Discussion
récemment, plusieurs études ont montré que GP73 est surexprimé dans certains cancers, y compris les carcinomes hépatocellulaires, les carcinomes des voies biliaires, cancer du poumon, le cancer de la prostate et seminomas [ ,,,0],9-15]. Dans les carcinomes hépatocellulaires, haute expression de GP73 a été associée à la taille de la tumeur, la différenciation, la qualité et l'invasion de la veine [7-9]. Dans les carcinomes des conduits biliaires, l'expression GP73 en corrélation avec l'âge du patient et de la survie [11]. Dans le cancer du poumon, l'expression GP73 a été associée à l'histologie de la tumeur et le sexe du patient; son expression dans les adénocarcinomes était significativement plus élevée que dans les autres types de cancers du poumon [12]. Toutefois, aucune corrélation avec les paramètres clinico a été trouvé dans le cancer de la prostate et séminomes [13, 15]. GP73 a également été trouvé régulée à la baisse dans les CCOS à cellules claires, ce qui est le sous-type histologique la plus fréquente de cancer des cellules rénales, tandis que son expression dans papillaire et chromophobe RCC a été forte [18]. Dans la présente étude, nous avons constaté que les deux niveaux de protéine GP73 ARNm et ont été fortement exprimées dans les muqueuses gastriques non-tumoraux, qui étaient en face de la plupart des études antérieures dans d'autres cancers.
La connaissance de la fonction de GP73 reste encore limitée. Jusqu'à présent, nous savons que GP73 est essentiel pour le foie et les reins pour maintenir la fonction normale et l'apparence. Il est également connu que GP73 peut fonctionner pour aider dans le transport des protéines et la sécrétion. L'une de ces protéines, sCLU, a déjà été identifiée. sCLU pourrait empêcher l'apoptose et est surexprimé dans divers cancers. GP73 pourrait interagir avec sCLU par domaine superhélice et aider le transport et la sécrétion de sCLU, ce qui peut expliquer l'association entre haute exprimé GP73 et le comportement agressif des carcinomes hépatocellulaires [3]. Dans un carcinome hépatocellulaire (HCC), la surexpression de GP73 n'a pas été détectée que dans les tissus cancéreux, mais également dans le sérum de patients, ce qui indique l'augmentation significative du taux GP73 fournirait un marqueur pour une détection précoce. Certains rapports ont indiqué que même GP73 est un meilleur marqueur de l'AFP pour le diagnostic de CHC [10, 11, 18, 21]. Cependant, quelle est la fonction de GP73 dans l'estomac et pourquoi serait-il être régulée à la baisse dans le cancer gastrique? Ceci est encore incertain. GP73 est une protéine spécifique d'une cellule épithéliale et fortement exprimé dans de nombreux tissus humains normaux, en particulier dans le côlon et de l'estomac. Il est également exprimé de manière prédominante dans l'intestin grêle, du côlon et de l'estomac de souris [22]. En accord avec ces études, nous avons également constaté que GP73 était fortement exprimé par les cellules situées à la surface du compartiment glandulaire et fovéolaire de la muqueuse gastrique humaine normale. Depuis la plus haute expression de GP73 est dans les cellules épithéliales des organes digestifs, il est raisonnable de supposer qu'il peut jouer certains rôles inconnus importants dans le système digestif.
Nous avons également trouvé l'expression de GP73 a été associée à la différenciation de la tumeur. L'expression de la GP73 dans les tumeurs gastriques mal différenciées était beaucoup plus faible que dans les tumeurs gastriques modérément différenciées. Il a été rapporté que le knock-down de la GP73 dans les cellules HepG2.2.15 pourrait entraîner une diminution de la surface spécifique du complexe de Golgi. Étant donné que la taille et le développement de l'appareil de Golgi sont positivement corrélés à la différenciation de la tumeur, les chercheurs ont émis l'hypothèse que certaines expression GP73 pourrait être associée au maintien de l'intégrité structurelle de l'appareil de Golgi pendant oncogenèse [23, 24]. Des études récentes ont démontré que la perte de GP73 a provoqué une régulation positive de WT1, qui peut favoriser la formation de glomus et inhiber la différenciation des tubules pronephrique. Il a suggéré que GP73 joue un rôle important dans le développement et la différenciation pronéphros [25]. Dans le carcinome hépatocellulaire, la protéine GP73 a été fortement associée à la taille de la tumeur, la veine invasion et la différenciation de la tumeur, ce qui suggère l'expression de GP73 est en corrélation avec le comportement agressif du cancer [10]. De plus, l'expression de GP73 a également été associée au sexe du patient. Les patients masculins ont montré une faible expression de GP73 plus fréquemment que chez les femmes. Un phénomène similaire a également été rapportée dans le cancer du poumon. Les patientes avaient une expression plus élevée de GP73 que chez les hommes [12]. Il est également signalé que les changements phénotypiques observées chez les souris avec GP73 extrémité C-terminale tronquée sont le sexe dépendant [4]. Une explication est que GP73 ARNm est régulée par les œstrogènes et calcitriol [26]. Notre travail a confirmé à nouveau l'hypothèse que l'expression GP73 est sous contrôle hormonal.
Conclusion
En conclusion, nous avons trouvé que les deux GP73 ARNm et la protéine était significativement régulée à la baisse dans les tissus tumoraux gastriques par rapport à la muqueuse non tumorale et l'expression de GP73 a été associée à la différenciation de la tumeur et le sexe du patient. Notre poursuite des travaux se concentrera sur l'étude de la fonction et le mécanisme de régulation de la GP73 dans l'estomac
abréviations
AFP:.
Α-foetoprotéine
ECL :
électrochimioluminescence
GC: Le cancer gastrique
GP73:
protéines Golgi 73

HCC:
carcinome hépatocellulaire
PSA:
antigène spécifique de la prostate
PVDF:
polyvinylidène
RCC:. le cancer des cellules rénales
Déclarations de
Remerciements Ce travail a été soutenu par le Programme de la province du Zhejiang pour la culture de haut niveau talents de santé novateurs.
Auteurs »soumis d'origine des fichiers pour les images
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Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.
Auteurs ' contributions
LGC et HJW ont été impliqués dans la conception de l'étude, réalisée le qRT-PCR, boulonnage Western et l'analyse de la coloration immunohistochimique, et rédigé le manuscrit. ZYY et HQT ont été impliqués dans la conception de l'étude et a supervisé l'étude. HBY, FW et TPG a recueilli des données et a contribué à la rédaction du manuscrit. XJH et YYM ont fourni un appui général et ont contribué à la rédaction du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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