GP73 es el regulado en el cáncer gástrico y se asocia con la diferenciación del tumor

GP73 es el regulado en el cáncer gástrico y se asocia con la diferenciación del tumor
Resumen Antecedentes

proteína de Golgi 73 (GP73) es una proteína transmembrana de tipo II de Golgi. Es sobre-expresado en varios tipos de cáncer, incluyendo los carcinomas hepatocelulares, carcinomas del conducto biliar, cáncer de pulmón y cáncer de próstata. Sin embargo, hay pocos informes de GP73 en el cáncer gástrico. Este estudio tiene como objetivo investigar la expresión de GP73 y su relación con los caracteres patológicos clínicos en cáncer gástrico.
Métodos
nivel de ARNm de GP73 se determinaron por cuantitativa en tiempo real RT-PCR en 41 pares de tejidos tumorales gástricas y pareados tejidos de la mucosa no tumorales adyacentes. transferencia de Western también se realizó para detectar el nivel de proteína GP73. expresión de la proteína GP73 se analizó mediante técnicas de inmunohistoquímica en 52 pacientes con cáncer gástrico clínicamente caracterizados y 10 controles de tejido de la mucosa gástrica no tumorales.
Resultados
El nivel de ARNm y proteína de GP73 fueron significativamente las reguladas en los tejidos tumorales gástricas en comparación con el tejidos de la mucosa no tumorales. En mucosa no tumoral, fuerte tinción citoplásmica difusa se puede ver en las células situadas en la superficie del compartimento glandular y foveolar; mientras que en los tejidos tumorales, la tinción era mucho más débil o incluso ausente, y principalmente en un patrón de tinción punteado semi-granular. El nivel de expresión de la proteína GP73 se asoció con el sexo de los pacientes y la diferenciación del tumor.
Conclusiones
GP73 se expresa normalmente en la mucosa gástrica no tumoral y de las reguladas en el cáncer gástrico. Su expresión en el cáncer gástrico se correlacionó con la diferenciación del tumor.
Palabras clave
GP73 gástrico Tumor cáncer diferenciación Antecedentes
GP73, también conocido como GOLM1 y GOLPH2, es una proteína transmembrana de tipo II de Golgi. Estructuralmente, GP73 contiene un corto dominio citoplásmico N-terminal, un dominio transmembrana y un dominio C-terminal luminal más grande que se compone de un dominio de espiral de la bobina y una cola de ácido. El dominio luminal C-terminal de dominio es la función principal de la GP73 [1-3]. Los ratones con un truncamiento severa de la GP73 C-terminal mostró disminución de la supervivencia y severas anormalidades epiteliales del riñón y el hígado [4]. El dominio espiral de la bobina podría interactuar tanto con precursor y maduro sCLU, lo que indica que GP73 podría ayudar en la modificación post-traduccional, transporte y secreción de sCLU [5]. Un sitio de reconocimiento proproteinconvertase R 52VRR 55 está situado dentro del ectodominio C-terminal; escisión PC-mediada de GP73 transforma el intracelular, GP73 Golgi-localizada a una proteína soluble, secretora [6]. Sin embargo, la función de GP73 todavía no está claro.
GP73 fue identificado primero de una biblioteca de ADNc derivada de hígado de un paciente con hepatitis de células gigantes adulto. Se considera una proteína específica de la célula epitelial, que es altamente expresado en el colon, de estómago, de próstata y de la tráquea en las personas normales, sanos [1]. enfermedad hepática, tales como infección por el virus y la cirrosis, podría hasta de regular la expresión de GP73 en los hepatocitos [1, 7, 8]. Estudios recientes mostraron que la GP73 fue sobre-expresado en varios tipos de cáncer, como los carcinomas hepatocelulares [9-11], carcinomas del conducto biliar [11], los adenocarcinomas de pulmón [12], el cáncer de próstata [13, 14] y los seminomas [15]. La expresión de GP73 en el cáncer renal es mucho más amplio. Se informó que las reguladas en la mayoría de los teléfonos cánceres de células renales claras (RCC), pero altamente expresado en carcinomas papilares y renales cromófobo [16]. Serum GP73 también se ha encontrado elevada en carcinomas hepatocelulares, carcinomas del conducto biliar y adenocarcinomas de pulmón. Incluso mostró una ventaja sobre α-fetoproteína (AFP) para el diagnóstico de carcinomas hepatocelulares primeros [17, 18]. Además, la expresión de ARNm de GP73 en la orina superó niveles séricos de PSA para detectar el cáncer de próstata [13].
El cáncer gástrico es uno de los cánceres más comunes y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. Tiene frecuencias particularmente altas en China [19]. Hasta ahora, los factores etiológicos y patogénesis del cáncer gástrico no han sido completamente entendidos. En este estudio, se puede investigar la expresión de GP73 y su relación con los caracteres patológicos clínicos en cáncer gástrico mediante la medición del nivel de ARNm y la expresión de la proteína de GP73 en los tejidos de las mucosas no tumorales y tumorales adyacentes gástricos.
Métodos
materiales y pacientes
Cuarenta y un pares de tejidos mucosos no tumoral tumoral y adyacente gástricos emparejados (> 5 cm desde el borde del tumor) se obtuvieron a partir de pacientes con cáncer gástrico primario en el hospital Popular de la provincia de Zhejiang, china a partir de enero 2011 a diciembre de 2012. Las características de los 41 GCsare muestran en la Tabla 1. Después de la extirpación quirúrgica, los tejidos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta use.Table 1 Resumen de las características clínico-patológicas de los pacientes con cáncer gástrico
clínica parámetros
N (%) guía empresas Género hombres
27 (65,9) Buscando Mujeres en 14 (34,1)
Tamaño
23 (56,1 ) Hotel < 20
18 (43,9)
≧ 20
diferenciación histológica de
Bueno página 3 (7.3)
Moderadamente
17 (41,5)
mal
21 (51,2)
linfático metástasis
n página 11 (26,8)
Sí
30 (73,2)
metástasis a distancia
Sin
34 (82,9) Sí
página 7 (17.1)
estadio TNM
I
8 (19,5)
II
17 (41,5)
III
10 (24,4)
IV página 6 (14,6)
Cincuenta y dos bloques de parafina de tejidos de cáncer gástrico (CG) (43 varones, 9 mujeres) fueron adquiridos de hospital Popular Provincial de Zhejiang, recogidos entre 2010 y 2011. Todos los casos de cáncer gástrico el cáncer se clasificaron según la clasificación de la OMS y la puesta en escena por medio del sistema de pTNM [20]. Los casos consistieron en 22 patientsaged < 60 años, 30 pacientes ≥60years de edad; 20 pacientes con el tamaño tumoral < 5 cm, 32 pacientes con la ≥5cm el tamaño del tumor; 22 pacientes con cáncer moderadamente diferenciado, 30 pacientes con cáncer pobremente diferenciado; 14 pacientes con T1 o T2 invasión de la pared, 38 pacientes con T3 o T4 pared de la invasión; 39 pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos y 13 pacientes sin metástasis en los ganglios linfáticos; 10 pacientes con metástasis a distancia y 42 pacientes sin metástasis a distancia. El número de pacientes clasificados por estadio TNM fueron los siguientes: 18 estaban en el estadio TNM I o II; 34 en el estadio TNM III o IV. Los pacientes tenían entre 32 y 84 años de edad, y no había radioterapia o quimioterapia antes de la operación. Las muestras fueron fijadas por formalina y embebidos en parafina. muestras de tejido Tennormal del estómago de los pacientes sin tumores malignos también se obtuvieron mediante endoscopia como grupo de control. MyBestPlay Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para el uso de sus tejidos antes de la cirugía. El uso de todas las muestras fue aprobado por el comité de ética del Hospital Popular Provincial de Zhejiang.
Cuantitativa en tiempo real PCR
QRT-PCR se realizó para determinar el nivel de ARNm de GP73. Brevemente, el ARN total fue extraído a partir de 40 pares de muestras de tejido de la mucosa gástrica pareados tumorales y no tumorales adyacentes, utilizando Trizol (Invitrogen, Camarillo, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. la síntesis de ADNc se llevó a cabo con el kit de PrimeScript primera Strand cDNA Synthesis (Takara, Dalian, China), utilizando 1 g de RNA total como molde y el cebador oligodT bajo 65 ° C, 5 minutos, 42 ° C, 60 minutos y 70 ° C, 10 minutos de transcripción inversa. El cDNA resultante fue amplificado por PCR cuantitativa usando cebadores específicos con SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, Dalian, China). GAPDH se utilizó como control interno. Los cebadores para la GP73 fueron 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(sentido) y 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (antisentido). Los cebadores para GAPDH fueron 5'TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(sentido) y 5'-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (antisentido). parámetros de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 20 seg y 72 ° C durante 20 seg. Al final de los ciclos de PCR, se realizó la fusión de análisis de la curva. La expresión relativa de GP73 para GAPDH se calculó utilizando 2 -ΔCT método.
Blotting
Western Blot Western se realizó para investigar el nivel de proteína GP73 en 5 de 41 pares de tejido tumoral gástrico y adyacente no tumoral tejido de la mucosa. La proteína se aisló de muestras de tejidos después de la extracción de RNA. Y aproximadamente 30 g de proteína se separó en gel de poliacrilamida al 10% durante dos horas. Después de ser transferido a una membrana de polivinilideno (PVDF) (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut, EE.UU.), las muestras se probaron con anticuerpos primarios contra GP73 (1: 2.000, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y β-actina ( 1: 5.000, Sigma, EE.UU.) a 4 ° Covernight. Después de la incubación con el anticuerpo secundario (1: 5.000, CapitalBio, Pekín, China) durante 2 h, las membranas fueron tratados con electroquimioluminiscencia (ECL) reactivo (Generay, Shanghai, China) y se expone a autoradiographicfilms
La tinción inmunohistoquímica
inmunohistoquímica. tinción se realizó por el método estándar. En pocas palabras, se cortaron 52 casos de tumores gástricos tejidos incluidos en parafina y 10 casos de controles de tejido de la mucosa no tumorales adyacentes a las 5 micras de espesor y se colocan en portaobjetos de microscopio y se secan en un horno a 60 ° durante 2 h. A continuación, las secciones se-parafinadas des en xileno, se rehidrataron utilizando un gradiente de concentraciones de etanol, al microondas en tampón de citrato 10 mM durante 15 minutos para recuperar el antígeno, se bloquearon con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos para inhibir la actividad de peroxidasa endógena y se incubaron con 10 % suero de cabra no inmune durante 20 minutos para reducir la tinción de fondo no específica. Después de eso, las secciones se incubaron con el anticuerpo anti-GP73 anticuerpo policlonal de conejo (Abcam, Cambridge, UK) (dilución 1: 100) a 4 ° C durante la noche, después se incubaron con anticuerpo secundario marcado con biotina (Invitrogen, EE.UU.) a temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido de incubación con estreptavidina conjugada con HRP (Invitrogen, EE.UU.) a temperatura ambiente durante 20 minutos. Entonces, el desarrollo del color se realizó con un sustrato Kit DAB (Dako, Carlsbad, EE.UU.). Por último, las secciones se contratiñeron con hematoxilina, se deshidrataron, se aclararon y montados.
Evaluación de los immunohistochemicalstainings México La immunohistochemicalstainings de GP73 se puntuaron por dos patólogos de forma independiente, en base a la intensidad y la proporción de células teñidas positivamente. intensidad de la tinción se evaluó con un sistema de clasificación de cuatro niveles: 0 = negativo, 1 = débil, 2 = moderado y 3 = fuerte. El porcentaje de células positivas se obtuvo como sigue: 0 para ninguna célula teñida, 1 para 1% a 25% de células teñidas, 2 de 26 a 50% de células teñidas, 3 de 51 a 75% de células teñidas y 4 para más del 75% de células teñidas. se multiplicaron Las puntuaciones para la intensidad y el porcentaje de células positivas. Las puntuaciones ≤ 3 se utilizan para definir los tumores con expresión de GP73 y anota baja ≥4 con alta expresión de GP73.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Se utilizó el-muestras pareadas t-test para analizar las diferencias de expresión de ARNm de GP73 entre tejidos tumorales y no tumorales. Se aplicó la prueba de chi-cuadrado para evaluar la significación estadística de la asociación entre la expresión de GP73 y los parámetros clínico-patológicos. P Hotel < 0,05 se consideró estadísticamente significativa
: Resultados de la GP73 nivel de expresión en tejido de tumor gástrico y no tumoral
expresión de ARNm de GP73 fue significativamente menor en los tejidos tumorales gástricas en comparación con el adyacente no tumoral. tejidos (33/41; 80,5%). Los niveles de expresión de GP73 en relación con GAPDH fueron mucho menores en los tejidos tumorales gástricas (0,259 ± 0,308) que en los tejidos de la mucosa no tumorales (0,584 ± 0,523; P
< 0,01; Figura 1). Consistente con RT-qPCR, el nivel de proteína GP73 en las muestras de tumor gástrico fue significativamente menor que la de las muestras no tumorales, que se ensayó por transferencia Western (Figura 2). Figura expresión 1 GP73 mRNA en tejidos tumorales gástricas y tejidos de la mucosa no tumorales adyacentes.
Figura 2 el nivel de proteína GP73 en las muestras tumorales gástricas y muestras de la mucosa no tumorales adyacentes. A) el nivel de proteína GP73 en las muestras tumorales gástricas y muestras de la mucosa no tumorales adyacentes. B) nivel de GP73 mRNA en las mismas muestras tumorales gástricas y muestras de la mucosa no tumorales adyacentes. C) el cáncer gástrico; N:. Normal)
Correlación entre la expresión de la proteína GP73 y parámetros clínico
IHC mostraron que la GP73 fue altamente expresado en el tejido de la mucosa no tumoral adyacente, pero disminuyó o incluso ausentes en los tejidos tumorales gástricas. En mucosa no tumoral, fuerte tinción citoplásmica difusa se podía ver en las células situadas en la superficie del compartimento glandular y foveolar (Figura 3A). En los tejidos tumorales, la expresión de GP73 se expresa principalmente en un semi-granular dot-como patrón de tinción distintivo (Figura 3B, C). Sólo se encontraron unos pocos tejidos tumorales gástricas con una fuerte expresión de GP73 (Figura 3D). Figura expresión de la proteína 3 GP73 en tejidos tumorales gástricas y tejidos de la mucosa no tumorales adyacentes. A) Fuerte expresión de GP73 en los tejidos no tumorales. B) la debilidad de expresión de GP73 en los tejidos tumorales gástricas. C) una expresión moderada de GP73 en tejidos tumorales gástricas. D) Fuerte expresión de GP73 en tejidos tumorales gástricas. a, b, c, d: aumento original × 100. A, B, C, D: aumento original. 200 × Francia El correlación entre la expresión de proteínas de variables clínicas y de GP73 se muestran en la Tabla 2. El nivel de expresión de GP73 fue significativamente relacionados con el sexo de los pacientes (P =
0,027) y la diferenciación (P
= 0,049). La expresión de GP73 en los tumores pobremente diferenciados gástricos era mucho menor que en los tumores gástricos moderadamente diferenciados. Un total de 21 de los 30 casos de tumores gástricos pobremente diferenciados mostró una baja expresión de GP73, mientras que en los casos de tumor gástrico moderadamente diferenciados sólo 9/22 era. Además, la expresión de GP73 en pacientes de sexo masculino se había reducido regulado con mayor frecuencia que en los pacientes de sexo femenino. No hubo correlación significativa entre la expresión de GP73 y otra parameters.Table clínico-2 Relación de expresión de GP73 con los parámetros patológicos de tumor
parámetros clínicos
GOLPH2
valor P


bajo
alta
número total
30
22
Sexo Masculino
0,027

28
15
Mujer
2 7
Edad (años)
0,456 Hotel < 60 página 12
10
≥60
18 página 12
El tamaño del tumor (cm2) 1.000
Hotel < 20 página 14 página 6
≥20
16
16
Diferenciación
0,049
moderadamente diferenciado página 9 página 13
pobremente diferenciado
21 página 9
Etapa
0,390
I + II página 12 página 6
III + IV
18
16
Profundidad de invasión de la pared
1.000
T1 + T2 página 8 página 6
T3 + T4
22
16
linfático metástasis
0.757
Sin página 7 página 6
Sí
23
16
metástasis a distancia
0,725
Sin
25 17
Sí
página 5 página 5
Discusión
Recientemente, varios estudios mostraron que la GP73 es sobreexpresado en algunos tipos de cáncer, incluyendo los carcinomas hepatocelulares, carcinomas del conducto biliar, cáncer de pulmón, cáncer de próstata y los seminomas [ ,,,0],9-15]. En carcinomas hepatocelulares, de alta expresión de GP73 se asoció con el tamaño del tumor, la diferenciación, el grado y la vena invasión [7-9]. En carcinomas de los conductos biliares, la expresión de GP73 correlacionada con la edad del paciente y la supervivencia [11]. En el cáncer de pulmón, la expresión de GP73 se asoció con la histología del tumor y el sexo del paciente; su expresión en adenocarcinoma fue significativamente mayor que en otros tipos de cáncer de pulmón [12]. Sin embargo, no hay correlación con parámetros clínico se ha encontrado en el cáncer de próstata y seminomas [13, 15]. GP73 también se ha encontrado el regulado en RCC de células claras, que es el subtipo histológico más común de cáncer de células renales, mientras que su expresión en papilar y cromófobo RCC era fuerte [18]. En el presente estudio, encontramos que tanto GP73 ARNm y los niveles de proteína fueron altamente expresado en mucosas gástricas no tumorales, que eran opuesta a la mayoría de los estudios previos en otros tipos de cáncer. Comentario El conocimiento de la función de GP73 todavía sigue siendo limitada. Hasta el momento, se sabe que la GP73 es esencial para el hígado y el riñón para mantener la función normal y la apariencia. También se sabe que GP73 puede funcionar para ayudar en el transporte y secreción de proteínas. Una de estas proteínas, sCLU, ya ha sido identificado. sCLU podría prevenir la apoptosis y está sobreexpresado en varios tipos de cáncer. GP73 podría interactuar con sCLU a través de dominio doblemente arrollado y ayudar transporte y secreción de sCLU, lo que puede explicar la asociación entre la alta expresado GP73 y el comportamiento agresivo de los carcinomas hepatocelulares [3]. En el carcinoma hepatocelular (HCC), la sobre expresión de GP73 no sólo se detecta en tejidos de cáncer, sino también en el suero de los pacientes, lo que indica el aumento significativo de los niveles de GP73 proporcionaría un marcador para la detección temprana. Algunos informes indicaron que incluso GP73 es un mejor marcador que la AFP para el diagnóstico de HCC [10, 11, 18, 21]. Sin embargo, ¿cuál es la función de GP73 en el estómago y por qué iba a ser el regulado en el cáncer gástrico? Esto todavía no está claro. GP73 es una proteína específica de la célula epitelial y altamente expresado en numerosos tejidos humanos normales, especialmente en el colon y el estómago. También se expresa predominantemente en el intestino delgado, colon y estómago de ratones [22]. De acuerdo con estos estudios, también se encontró que GP73 fue altamente expresado por las células situadas en la superficie del compartimiento glandular y foveolar de mucosa gástrica humana normal. Desde la más alta expresión de GP73 en las células epiteliales de los órganos digestivos, es razonable suponer que puede desempeñar algunas funciones importantes, desconocidos en el sistema digestivo.
También encontramos la expresión de GP73 se asoció con la diferenciación del tumor. La expresión de GP73 en los tumores pobremente diferenciados gástricos era mucho menor que en los tumores gástricos moderadamente diferenciados. Se informó de que knock-down de GP73 en las células HepG2.2.15 podría causar una reducción en el área de la superficie del complejo de Golgi. Dado que el tamaño y el desarrollo del complejo de Golgi se correlacionan positivamente con la diferenciación del tumor, algunos investigadores plantearon la hipótesis de que la expresión de GP73 podría estar asociado con el mantenimiento de la integridad estructural del complejo de Golgi durante la oncogénesis [23, 24]. Estudios recientes demostraron que la pérdida de GP73 causó la sobre regulación de WT1, que puede promover la formación de glomus e inhibir la diferenciación túbulo pronephric. Se sugirió que GP73 juega un papel importante en el desarrollo de pronefros y diferenciación [25]. En el carcinoma hepatocelular, la proteína GP73 está fuertemente asociada con el tamaño del tumor, la vena invasión y la diferenciación del tumor, lo que sugiere la expresión de GP73 se correlaciona con el comportamiento agresivo de cáncer [10]. Por otra parte, la expresión de GP73 también se asoció con el sexo del paciente. Los pacientes varones mostraron una expresión de GP73 baja con mayor frecuencia que los pacientes de sexo femenino. Un fenómeno similar también se ha informado en el cáncer de pulmón. Las pacientes tenían una mayor expresión de GP73 que los pacientes masculinos [12]. También se informa de que los cambios fenotípicos observados en ratones con truncadas GP73 C-terminal son dependientes de género [4]. Una explicación es que GP73 mRNA está regulada por estrógenos y calcitriol [26]. Nuestro trabajo confirma una vez más la hipótesis de que la expresión de GP73 está bajo control hormonal.
Conclusión
En conclusión, hemos encontrado que tanto el ARNm de GP73 y el nivel de proteínas fue significativamente las reguladas en los tejidos tumorales gástricas en comparación con la mucosa no tumoral , y la expresión de GP73 se asoció con la diferenciación del tumor y el sexo del paciente. Nuestro trabajo se centrará más en la investigación de la función y el mecanismo de regulación de GP73 en el estómago
abreviaciones
AFP:.
Α-fetoproteína
ECL :
electroquimioluminiscencia
GC: El cáncer gástrico
GP73:
proteína de Golgi 73

CHC: carcinoma hepatocelular

PSA: antígeno específico de próstata

PVDF:
polivinilideno
RCC:.
el cáncer de células renales
Declaraciones
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Programa Provincial de Zhejiang para el cultivo de alto nivel talentos innovadores para la salud.
los autores originales presentados archivos de imágenes
a continuación se presentan los enlaces a los autores originales presentados archivos de imágenes. 'archivo original para la figura 1 12957_2012_1362_MOESM2_ESM.tif autores 12957_2012_1362_MOESM1_ESM.tif Autores archivo original para la figura 2 12957_2012_1362_MOESM3_ESM.tif autores archivo original para la figura 3 Conflicto de intereses México La autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Autores' contribuciones
LGC y HJW estaban involucrados en el diseño del estudio, realizó el QRT-PCR, los pernos de Western y análisis de tinción inmunohistoquímica, y redactó el manuscrito. ZYY y de HQT estuvieron involucrados en el diseño del estudio y supervisó el estudio. HBY, FW y TPG recogieron datos y ayudó a redactar el manuscrito. XJH y YYM proporcionado apoyo general y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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