GP73 er ​​nedregulert i magekreft og assosiert med tumor differensiering

GP73 er ​​nedregulert i magekreft og assosiert med tumor differensiering
Abstract
Bakgrunn
Golgi protein 73 (GP73) er en type II Golgi transmembrane protein. Det er over-uttrykt i flere krefttyper, inkludert hepatocellulær karsinom, gallegang karsinom, lungekreft og prostatakreft. Men det er få rapporter om GP73 i magekreft. Denne studien tar sikte på å undersøke uttrykket av GP73 og sitt forhold til kliniske patologiske tegn i magekreft.
Metoder
GP73 mRNA nivå ble bestemt ved kvantitativ real-time RT-PCR i 41 par med matchet mage tumor vev og tilstøtende ikke-tumorslimhinnevevet. Western blotting ble også utført for å påvise GP73 proteinnivå. GP73 protein uttrykk ble analysert ved immunhistokjemi i 52 klinisk preget mage kreftpasienter og 10 ikke-tumor mage kontroller slimhinnevevet.
Resultater
mRNA og proteinnivå GP73 var signifikant nedregulert i mage tumorøse vev sammenlignet med ikke-tumorslimhinnevevet. I ikke-tumor slimhinner, kan sterk diffus cytoplasmatisk farge sees i celler lokalisert ved overflaten av kjertel og foveolar rom; mens i tumorøse vev, fargingen var mye svakere, eller til og med fraværende, og hovedsakelig i en semi-granulær dot-lignende fargemønster. Uttrykket nivået av GP73 protein var forbundet pasientenes kjønn og tumor differensiering med.
Konklusjoner
GP73 ble vanligvis uttrykt i ikke-tumorous mageslimhinnen og nedregulert i magekreft. Dens uttrykk i magekreft var korrelert med tumor differensiering.
Nøkkelord
GP73 Magekreft Tumor differensiering Bakgrunn
GP73, også kjent som GOLM1 og GOLPH2, er en type II Golgi transmembrane protein. Strukturelt inneholder GP73 et kort N-terminalt cytoplasmatisk domene, et transmembrandomene og et større luminal C-terminale domenet som er sammensatt av en kveil-spole domene og et syre hale. Luminal C-terminale domene er den viktigste funksjon domenet til GP73 [1-3]. Mus med en alvorlig avkutting av GP73 C-terminalen viste redusert overlevelse og alvorlige epitelceller abnormaliteter i nyrene og leveren [4]. Kveil-kveil domene kan interagere med både forløperen og modne sCLU, noe som indikerer at GP73 kan hjelpe til i post-translasjonell modifikasjon, transport og sekresjon av sCLU [5]. En proproteinconvertase anerkjennelse reiser R 52VRR 55 ligger innenfor C-terminal ectodomain; PC-mediert spaltning av GP73 forvandler det intracellulære, Golgi-lokalisert GP73 til en oppløselig, sekretorisk protein [6]. Imidlertid er funksjonen til GP73 fortsatt uklart.
GP73 ble først identifisert fra et cDNA-bibliotek avledet fra leveren til en pasient med voksen gigant-celle-hepatitt. Det er ansett som en epitelial celle-spesifikt protein, som er sterkt uttrykt i kolon, mage, prostata og trakea hos normale, friske personer, [1]. Leversykdom, slik som cirrhose og virus infeksjon, kunne oppregulerer ekspresjonen av GP73 i hepatocytter [1, 7, 8]. Nyere studier viste at GP73 var over-uttrykt i flere kreftformer, som levercellekarsinom [9-11], galle duct carcinoma [11], lunge adenokarsinomer [12], prostatakreft [13, 14] og nomas [15]. Uttrykket av GP73 i nyrekreft er mye mer omfattende. Det ble rapportert som nedregulert i de fleste klare cellenyrecellekreft (RCC), men svært uttrykt i papillær og chromophobe nyre karsinom [16]. Serum GP73 er ​​også funnet forhøyet i hepatocellulært karsinom, gallegang karsinomer og lunge adenokarsinomer. Det viste selv en fordel over α-fetoprotein (AFP) for å diagnostisere tidlig levercellekarsinom [17, 18]. Også mRNA ekspresjon av GP73 i urin utkonkurrerte serum PSA i påvisning av prostatakreft [13].
Magekreft er en av de mest vanlige kreftformer og den andre ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Det har spesielt høye frekvenser i Kina [19]. Til nå har de etiologiske faktorer og patogenesen av magekreft er ikke fullt ut forstått. I denne studien ønsker vi å undersøke uttrykk for GP73 og sitt forhold til kliniske patologiske tegn i magekreft ved å måle mRNA og protein uttrykk nivå av GP73 i mage tumorous og tilstøtende ikke-tumorslimhinnevevet.
Metoder
materialer og pasienter
Førti-en par matchet mage tumorous og tilstøtende ikke-tumorous slimhinnevevet (> 5 cm fra kanten av svulsten) ble innhentet fra pasienter med primær magekreft på Zhejiang Provincial Folkets sykehus, Kina fra januar 2011 til desember 2012. egenskapene til 41 GCsare vist i tabell 1. Etter kirurgisk fjerning, vev ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil use.Table en oppsummering av clinicopathologic egenskapene av mage kreftpasienter
Clinical parametere Book N (%)
Kjønn
menn
27 (65,9)
kvinner
14 (34,1)
Størrelse
23 (56,1 )
< 20
18 (43,9)
≧ 20
Histologisk differensiering
Vel
3 (7,3)
Moderat
17 (41,5)
Dårlig
21 (51,2)
lymphatic metastase
Ingen
11 (26,8)
Ja
30 (73,2)
Fjernmetastaser
Ingen
34 (82,9)
Ja
7 (17,1)
TNM stadium
jeg
8 (19,5)
II
17 (41,5)
III
10 (24,4)
IV
6 (14,6)
femtito parafin eksemplarer av magekreft (GC) vev (43 hanner, 9 kvinner) ble anskaffet fra Zhejiang Provincial Folkets sykehus, samlet inn fra 2010 til 2011. Alle tilfeller av mage kreft ble klassifisert i henhold til WHO klassifisering og iscenesatt ved hjelp av pTNM systemet [20]. Sakene besto av 22 patientsaged < 60 år, 30 pasienter i alderen ≥60years; 20 pasienter med tumorstørrelsen < 5cm, 32 pasienter med tumorstørrelsen ≥5cm; 22 pasienter med moderat differensierte kreft, 30 pasienter med dårlig differensiert kreft; 14 pasienter med T1 eller T2 vegg invasjon, 38 pasienter med T3 eller T4 vegg invasjon; 39 pasienter med lymfeknutemetastase og 13 pasienter uten lymfeknutemetastase; 10 pasienter med fjernmetastaser og 42 pasienter uten fjernmetastaser. Antall pasienter klassifisert av TNM fasen var som følger: 18 var på TNM stadium I eller II; 34 ved TNM stadium III eller IV. Pasientene var mellom 32 og 84 år, og det var ingen radioterapi eller kjemoterapi før operasjonen. Prøvene ble løst av formalin og innstøpt i parafin. Tennormal vevsprøver i magesekken fra pasienter uten maligne tumorer ble også oppnådd ved endoskopi som kontrollgruppen.
Alle pasienter gitt informert samtykke til bruk av sine vev før kirurgi. Bruken av alle prøvene ble godkjent av etisk komité av Zhejiang Provincial Folkets sykehus.
Kvantitativ real-time PCR
QRT-PCR ble utført for å bestemme mRNA nivået av GP73. I korthet, ble total RNA ekstrahert fra 40 parene av passet gastrisk tumor og tilstøtende ikke-tumor mucosal vevsprøver, ved hjelp av Trizol (Invitrogen, Camarillo, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA-syntese ble utført med PrimeScript første Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, Kina), ved anvendelse av 1 pg av total RNA som templat og OligodT primer under 65 ° C, 5 minutter, 42 ° C, 60 minutter og 70 ° C, 10 minutter av revers transkripsjon. Den resulterende cDNA ble forsterket av qPCR bruke spesifikke primere med SYBR Premiks Ex Taq (Takara, Dalian, Kina). GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Primere for GP73 var 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(sense) og 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (antisens). Primere for GAPDH var 5'- TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(sense) og 5'- CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (antisens). PCR-parametrene var som følger: 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 10s, 60 ° C i 20 sekunder og 72 ° C i 20 sekunder. Ved slutten av PCR-sykluser, smelter kurve analyse utført. Den relative uttrykk for GP73 til GAPDH ble beregnet ved hjelp av to -ΔCT metode.
Western blotting
Western blotting ble utført for å undersøke GP73 protein nivå i fem av 41 par av mage tumorous vev og tilstøtende ikke-tumorous mukosalt vev. Protein ble isolert fra vevsprøver følgende RNA-ekstraksjon. Og omtrent 30 ug protein ble separert på 10% polyakrylamidgel i to timer. Etter å ha blitt overført til en polyvinylidenedifluoride (PVDF) membran (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut, USA), ble prøvene analysert med primære antistoffer mot GP73 (1: 2000, Sigma, St. Louis, MO, USA) og β-aktin ( 1: 5000, Sigma, USA) ved 4 ° Covernight. Etter inkubering med sekundært antistoff (1: 5000, CapitalBio, Beijing, Kina) i 2 timer, membranene ble behandlet med elektrokjemiluminescens (ECL) reagens (Generay, Shanghai, Kina) og utsatt for autoradiographicfilms
Immunhistokjemisk farging
Immunhistokjemisk. farging ble utført ved standardmetoden. Kort sagt ble 52 tilfeller av parafininnstøpte gastrisk svulster vev og 10 tilfeller av tilstøtende ikke-tumor mucosal vev kontroller kuttet på 5 um tykt og plassert på mikroskopiske objektglass og tørket i en 60 ° C ovn i 2 timer. Deretter ble seksjonene de-paraffinized i xylen, rehydrert ved anvendelse av en gradient av etanolkonsentrasjoner, varmes i mikrobølgeovn i 10 mM citrat-buffer i 15 minutter for å hente antigen, blokkert med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter for å inhibere endogen peroksidaseaktivitet og inkubert med 10 % geit non-immunserum i 20 minutter for å redusere bakgrunns ikke-spesifikk farging. Deretter ble seksjonene inkubert med kanin anti-GP73 polyklonalt antistoff (Abcam, Cambridge, UK) (1: 100 fortynning) ved 4 ° C over natten og deretter inkubert med biotin-merket sekundært antistoff (Invitrogen, USA) ved romtemperatur i 20 minutter, etterfulgt av inkubasjon med HRP-konjugert streptavidin (Invitrogen, USA) ved romtemperatur i 20 minutter. Deretter ble fargeutvikling utført med en DAB Substrat Kit (Dako, Carlsbad, USA). Til slutt ble seksjonene kontra med hematoxylin, dehydrert, ryddet og montert.
Evaluering av immunohistochemicalstainings
Den immunohistochemicalstainings av GP73 ble scoret av to patologer uavhengig, basert på intensiteten og andelen positivt fargede celler. Fargeintensitet ble evaluert med en fire-lags karaktersystem: 0 = negativ, 1 = svak, 2 = moderat og 3 = sterk. Prosentandelen av positive celler ble bedømt som følger: 0 til ingen celle-farget, 1 i 1% til 25% av cellene farget, 2 med 26 til 50% av cellene farget, 3 i 51 til 75% av cellene farget og 4 for mer enn 75% av cellene farget. Poeng for intensitet og andelen positive celler ble mangedoblet. Poeng ≤ 3 ble brukt til å definere svulster med lav GP73 uttrykk og score ≥4 med høy GP73 uttrykk.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS programvare 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Den sammenkoblede-samples t-test ble brukt til å analysere forskjeller i GP73 mRNA uttrykk mellom svulst og ikke-tumorvevet. Chi-kvadrat test ble brukt for å vurdere den statistiske betydningen av sammenhengen mellom GP73 uttrykk og clinicopathological parametere. P
< 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
GP73 uttrykk nivå i mage tumor og ikke-tumorous vev
GP73 mRNA uttrykk ble betydelig redusert i mage tumorvev i forhold til tilstøtende ikke-tumorous. vev (33/41; 80,5%). Uttrykket nivåer av GP73 i forhold til GAPDH var mye lavere i mage-tumorøse vev (0,259 ± 0,308) enn det i ikke-tumorøse slimhinnevev (0,584 ± 0,523; P
< 0,01; figur 1). I samsvar med RT-qPCR, GP73 proteinnivå i gastrisk tumorprøver var signifikant lavere enn den til ikke-tumorprøver, som ble testet ved hjelp av Western blotting (figur 2). Figur 1 GP73 mRNA uttrykk i mage tumorøse vev og tilstøtende ikke-tumorslimhinnevevet.
Figur 2 GP73 protein nivå i mage tumorprøver og tilstøtende ikke-tumorous slimhinneprøver. A) GP73 protein nivå i mage tumorprøver og tilstøtende ikke-tumorous slimhinneprøver. B) GP73 mRNA-nivå i de samme gastrisk tumorprøver og tilstøtende ikke-tumorslimhinneprøver. C) magekreft; N:. Normal)
Sammenheng mellom GP73 protein uttrykk og clinicopathologic parametere
IHC viste at GP73 ble sterkt uttrykt i tilstøtende ikke-tumorous mucosal vev, men redusert eller fraværende i mage tumorvevet. I ikke-tumor mukosa, kan sterk diffus cytoplasmatisk farge sees i celler lokalisert ved overflaten av kjertel og foveolar rommet (figur 3A). I tumorvev, ble GP73 ekspresjon hovedsakelig uttrykt i en distinkt semi-granulære dot-lignende fargemønster (figur 3B, C). Bare noen få gastriske tumorvev ble funnet med sterk ekspresjon av GP73 (figur 3D). Figur 3 GP73 protein uttrykk i mage tumorøse vev og tilstøtende ikke-tumorslimhinnevevet. A) Sterk ekspresjon av GP73 i ikke-tumorvevet. B) Svak uttrykk for GP73 i mage tumorvevet. C) Moderat uttrykk for GP73 i mage tumorvevet. D) Sterk uttrykk for GP73 i mage tumorvevet. a, b, c, d: original forstørrelse 100 ×. A, B, C, D.: Opprinnelig forstørrelse 200 x
korrelasjon mellom ekspresjon av protein GP73 og kliniske variabler er vist i tabell 2. GP73 Ekspresjonsnivået var signifikant relatert til kjønn av pasienten (P =
0,027) og differensiering (P
= 0,049). Ekspresjonen av GP73 i dårlig differensiert gastriske svulster var mye lavere enn i moderat differensierte gastriske tumorer. Totalt 21 av 30 dårlig differensierte magekreft tilfeller viste lav GP73 uttrykk, mens i moderat differensierte magekreft tilfeller var det bare 9/22. Også uttrykk for GP73 i mannlige pasienter ble nedregulert oftere enn hos kvinnelige pasienter. Det var ingen signifikant sammenheng mellom GP73 uttrykk og andre clinicopathologic parameters.Table 2 Forholdet GP73 uttrykk med patologiske parametre for svulst
Kliniske parametre
GOLPH2
P-verdi


lav
Høy
Totalt antall
30
22
Kjønn
0,027
Mann fra 28
15
Kvinne
2
7
Alder (år)
0,456
< 60
12
10
≥60
18
12
Tumor størrelse (cm2)
1,000
< 20
14
6
≥20
16
16
Differensiering
0,049
Moderat differensiert
9
13
Dårlig differensiert
21
9
Stage
0,390
I + II
12
6
III + IV
18
16
Dybde på veggen invasjon
1,000
T1 + T2
8
6
T3 + T4
22
16
lymphatic metastase
0,757
Ingen
7
6
Ja
23
16
Distant metastase
0,725
Ingen
25
17
Ja
5
5
diskusjon
Nylig har flere studier viste at GP73 er ​​over-uttrykt i visse typer kreft, inkludert hepatocellulær karsinom, gallegang karsinom, lungekreft, prostatakreft og nomas [ ,,,0],9-15]. I levercellekarsinom ble høy uttrykk for GP73 forbundet med tumorstørrelse, differensiering, klasse og vene invasjonen [7-9]. I galle duct carcinoma, GP73 uttrykk sammenheng med pasientens alder og overlevelse [11]. I lungekreft, ble GP73 uttrykk forbundet med tumorhistologi og pasient kjønn; sitt uttrykk i adenokarsinom var betydelig høyere enn i andre typer lungekreft [12]. Imidlertid har ingen sammenheng med clinicopathological parametre er funnet i prostata cancer og nomas [13, 15]. GP73 har også blitt funnet nedregulert i klare celle RCC, som er den vanligste histologisk undertype av nyrecellecancer, mens dets ekspresjon i den papillære og chromophobe RCC var sterk [18]. I denne studien fant vi at både GP73 mRNA og proteinnivåer ble sterkt uttrykt i ikke-tumor mage mucosas, som var motsatt av de fleste tidligere studier i andre kreftformer.
Kunnskap GP73 funksjon er fremdeles begrenset. Så langt vi vet at GP73 er ​​avgjørende for lever og nyre for å opprettholde normal funksjon og utseende. Det er også kjent at GP73 kan fungere i å assistere i protein transport og sekresjon. Et slikt protein, sCLU, har allerede blitt identifisert. sCLU kunne forhindre apoptose og blir over-uttrykt i ulike kreftformer. GP73 kunne samhandle med sCLU gjennom coiled-spole domene og bistå transport og utskillelse av sCLU, noe som kan forklare sammenhengen mellom høyt uttrykt GP73 og aggressiv atferd av hepatocellulært karsinom [3]. I hepatocellulær karsinom (HCC), ble det over-ekspresjon av GP73 ikke bare detektert i kreftvev, men også i pasientens serum, noe som indikerte den betydelige økningen i GP73 nivåer ville gi en markør for tidlig deteksjon. Noen rapporter uttalt at GP73 er ​​en bedre markør for diagnostisering av HCC [10, 11, 18, 21] enn AFP. Men hva er funksjonen til GP73 i magen og hvorfor skulle det bli nedregulert i magekreft? Dette er fortsatt uklart. GP73 er ​​en epitelial celle-spesifikt protein og sterkt uttrykt i en rekke normale humane vev, spesielt i tykktarmen og magen. Det er også hovedsakelig uttrykt i tynntarmen, tykktarmen og maven til mus [22]. I samsvar med disse studiene har vi også funnet at GP73 ble sterkt uttrykt av celler lokalisert ved overflaten av kjertel og foveolar avdeling av normal human gastrisk mukosa. Siden det høyeste uttrykk for GP73 er ​​i epitelceller fordøyelsesorganer, er det rimelig å anta at det kan spille noen viktige, ukjente roller i fordøyelsessystemet.
Vi fant også uttrykk for GP73 ble assosiert med tumor differensiering. Ekspresjonen av GP73 i dårlig differensiert gastriske svulster var mye lavere enn i moderat differensierte gastriske tumorer. Det ble rapportert at knock-down av GP73 i HepG2.2.15-celler kan føre til en reduksjon i overflatearealet til Golgi-komplekset. Siden den størrelse og utvikling av Golgi-komplekset er positivt korrelert med tumor differensiering, noen forskere hypotese at GP73 ekspresjon kan være forbundet med å opprettholde den strukturelle integriteten til Golgi-komplekset ved onkogenese [23, 24]. Nyere studier har vist at tap av GP73 forårsaket oppregulering av WT1, som kan fremme dannelsen glomus og hemme pronephric tubule differensiering. Det foreslått at GP73 spiller en viktig rolle i pronephros utvikling og differensiering [25]. I leverkreft, ble GP73 protein sterkt assosiert med tumorstørrelse, vein invasjon og tumor differensiering, noe som tyder GP73 ekspresjon er korrelert med den aggressive oppførsel av kreft [10]. Videre er ekspresjon av GP73 var også assosiert med pasientens kjønn. Mannlige pasienter viste lav GP73 uttrykk oftere enn kvinnelige pasienter. Et lignende fenomen er også blitt rapportert i lungekreft. Kvinnelige pasienter hadde en høyere uttrykk for GP73 enn mannlige pasienter [12]. Det er også rapportert at fenotypiske endringer observert i mus med avkortede GP73 C-terminal er kjønnsavhengig [4]. En forklaring er at GP73 mRNA er regulert av østrogener og kalsitriol [26]. Vårt arbeid igjen bekreftet hypotesen om at GP73 uttrykk er under hormonell kontroll.
Konklusjon
konklusjon, fant vi at både GP73 mRNA og protein nivået var signifikant nedregulert i mage tumorøse vev sammenlignet med ikke-tumorous slimhinner og ekspresjon av GP73 var assosiert med tumor differensiering og pasientens kjønn. Vårt videre arbeid vil fokusere på å undersøke funksjonen og Reguleringen av GP73 i magen
Forkortelser
AFP.
Α-fetoprotein
ECL :
elektrokjemiluminescens
GC:
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP
GP73:
Golgi protein 73

HCC:
leverkreft
PSA:
prostataspesifikt antigen
PVDF:
Polyvinylidenedifluoride
RCC.
nyrecellekreft
Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet av Zhejiang Provincial Program for dyrking høyt nivå Innovative Helse Talenter.
forfatter~~POS=TRUNC opprinnelige legges filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale innsendte filer for bilder. 12957_2012_1362_MOESM1_ESM.tif Forfatteroriginalfilen for figur 1 12957_2012_1362_MOESM2_ESM.tif Forfatteroriginalfilen for figur 2 12957_2012_1362_MOESM3_ESM.tif Forfatteroriginalfilen for figur 3 konkurrerende interesser
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Forfattere ' bidrag
LGC og HJW var involvert i utformingen av studien, utførte QRT-PCR, Western bolting og immunhistokjemisk farging analyse, og utarbeidet manuskriptet. ZYY og HQT var involvert i utformingen av studien og veiledet studien. HBY, FW og TPG innsamlede data og bidratt til å utarbeide manuskriptet. XJH og yym gitt generell støtte og bidratt til å utarbeide manuskriptet. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Marginal grumset band og lyseblå kam, skilt observert i forstørrelses smale bånd bildebehandling endoskopi, er tegn på mage tarm metaplasia
• Flere primære kreftsykdom som involverer primær sporadisk kolorektal kreft i Japan: forekomsten av magekreft med pasienter med kolorektal kreft kan være høyere enn tidligere recognized