GP73 è down-regolato in cancro gastrico e associata a tumore differentiation

GP73 è down-regolato in cancro gastrico e associata a tumore differenziazione
Abstract
sfondo
proteina Golgi 73 (GP73) è un tipo II Golgi proteina transmembrana . Si tratta di over-espressa in diversi tumori, tra cui carcinomi epatocellulari, carcinomi dei dotti biliari, cancro del polmone e il cancro alla prostata. Tuttavia, ci sono alcune segnalazioni di GP73 nel cancro gastrico. Questo studio si propone di indagare l'espressione della GP73 e il suo rapporto con i caratteri patologici clinici nel carcinoma gastrico.
Metodi
livello di mRNA GP73 è stata determinata dalla quantitativa real-time RT-PCR in 41 coppie di tessuti tumorali gastriche abbinati e adiacenti mucose non tumorali. Western blotting è stato effettuato anche per rilevare il livello della proteina GP73. espressione della proteina GP73 è stato analizzato mediante immunoistochimica in 52 pazienti affetti da cancro gastrico clinicamente caratterizzati e 10 controlli dei tessuti della mucosa gastrica non tumorali.
Risultati
L'mRNA e il livello di proteine ​​di GP73 erano significativamente down-regolato nei tessuti tumorali rispetto al gastrici mucose non tumorali. In mucosa non-tumorale, forte colorazione citoplasmatica diffusa può essere visto in cellule situate sulla superficie del vano ghiandolare e foveolar; mentre nei tessuti tumorali, la colorazione era molto più debole o assente, e principalmente in un pattern di colorazione puntiforme semi-granulare. Il livello di espressione della proteina GP73 è stata associata con il sesso dei pazienti e la differenziazione del tumore.
Conclusioni
GP73 era normalmente espressa nella mucosa gastrica non tumorale e down-regolato nel cancro gastrico. La sua espressione nel carcinoma gastrico è stata correlata con la differenziazione del tumore.
Parole
GP73 cancro gastrico Tumore differenziazione Sfondo
GP73, noto anche come golm1 e GOLPH2, è un tipo II Golgi proteina transmembrana. Strutturalmente, GP73 contiene un dominio breve citoplasmatica N-terminale, un dominio transmembrana e un dominio più grande luminal C-terminale che si compone di un dominio coiled-coil e una coda acida. Il dominio luminale C-terminale è il principale dominio funzione della GP73 [1-3]. Topi con una grave troncamento del GP73 C-terminale mostrato ridotta sopravvivenza e gravi anomalie epiteliali del rene e del fegato [4]. Il dominio coiled-coil poteva interagire sia con precursore e maturo sCLU, indicando che GP73 potrebbe aiutare nel post-traslazionale modifica, il trasporto e la secrezione di sCLU [5]. Un sito di riconoscimento proproteinconvertase R 52VRR 55 si trova all'interno del ectodomain C-terminale; PC-mediata scissione della GP73 trasforma il intracellulare, GP73 Golgi-localizzato ad una proteina secretoria solubili [6]. Tuttavia, la funzione di GP73 è ancora chiaro.
GP73 è stato identificato da una libreria di cDNA derivato da fegato di un paziente con epatite adulti a cellule giganti. E 'considerato un epiteliali cellule-specifiche proteine, che è altamente espresso nel colon, stomaco, prostata e trachea in normali persone sane [1]. Malattia del fegato, come l'infezione da virus e la cirrosi, potrebbe up-regolare l'espressione dei GP73 in epatociti [1, 7, 8]. Recenti studi hanno dimostrato che GP73 era over-espresso in diversi tipi di cancro, come il carcinoma epatocellulare [9-11], carcinomi dei dotti biliari [11], gli adenocarcinomi polmonari [12], il cancro alla prostata [13, 14] e [15] seminoma. L'espressione di GP73 nel cancro renale è molto più completo. E 'stato riferito come down-regolato nella maggior parte dei casi di cancro renale a cellule chiare (RCC), ma altamente espresso in papillare e carcinomi renali cromofobi [16]. Serum GP73 è stata trovata anche elevata in carcinomi epatocellulari, carcinomi dei dotti biliari e adenocarcinomi polmonari. E 'anche mostrato un vantaggio rispetto α-fetoproteina (AFP) per la diagnosi precoce dei carcinomi epatocellulari [17, 18]. Inoltre, l'espressione di mRNA di GP73 nelle urine ha superato PSA sierico nel rilevare il cancro alla prostata [13].
Cancro gastrico è uno dei tumori più comuni e la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo. Ha particolarmente alte frequenze in Cina [19]. Fino ad ora, i fattori eziologici e patogenesi del cancro gastrico non sono stati pienamente compreso. In questo studio, ci proponiamo di indagare l'espressione della GP73 e il suo rapporto con i caratteri patologici clinici nel carcinoma gastrico misurando il livello di mRNA e l'espressione della proteina di GP73 nei tessuti della mucosa non tumorali tumorali e adiacenti gastrici.
Metodi
materiali e pazienti
Quarantuno coppie di mucose non tumorale tumorale e adiacente gastrici abbinati (> 5 centimetri dal bordo del tumore) sono stati ottenuti da pazienti con cancro gastrico primario presso l'Ospedale del Popolo Zhejiang provinciale, la Cina da gennaio 2011 al dicembre 2012. Le caratteristiche di 41 GCsare riportate nella Tabella 1. Dopo la rimozione chirurgica, i tessuti sono stati congelati immediatamente in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino use.Table 1 Riassunto delle caratteristiche clinico-patologiche di pazienti affetti da cancro gastrico
clinica parametri
N (%)
genere
Uomini in 27 (65,9)
Donne in 14 (34,1)
Dimensioni
23 (56.1 )
< 20
18 (43,9)
≧ 20
differenziazione istologica
Bene
3 (7.3)
moderatamente
17 (41,5)
mal
21 (51,2)
linfatico metastasi
No
11 (26,8)
Sì
30 (73,2)
metastasi a distanza
No
34 (82,9)
Sì
7 (17.1)
TNM fase
I
8 (19,5)
II
17 (41,5)
III
10 (24,4)
IV
6 (14,6)
Cinquantadue esemplari paraffina di cancro gastrico tessuti (GC) (43 maschi, 9 femmine) sono stati acquisiti da Ospedale Zhejiang popolare della Provincia, raccolti dal 2010 al 2011. Tutti i casi di gastrica il cancro sono stati classificati secondo la classificazione dell'OMS e messo in scena per mezzo del sistema di pTNM [20]. I casi consistevano in 22 patientsaged < 60 anni, 30 pazienti di età compresa tra ≥60years; 20 pazienti con la dimensione del tumore < 5 cm, 32 pazienti con il ≥5cm dimensioni del tumore; 22 pazienti con cancro moderatamente differenziato, 30 pazienti con carcinoma differenziato male; 14 pazienti con T1 o T2 invasione a muro, 38 pazienti con T3 o T4 parete invasione; 39 pazienti con metastasi linfonodali e 13 pazienti senza metastasi linfonodali; 10 pazienti con metastasi a distanza e 42 pazienti senza metastasi a distanza. Il numero di pazienti classificati da stadio TNM sono i seguenti: 18 erano al TNM stadio I o II; 34 allo stadio TNM III o IV. I pazienti sono stati tra i 32 ei 84 anni di età, e non c'era la radioterapia o la chemioterapia prima dell'operazione. I campioni sono stati fissati dal formalina e inclusi in paraffina. campioni di tessuto Tennormal dello stomaco da pazienti senza tumori maligni sono stati ottenuti anche per via endoscopica, come il gruppo di controllo.
Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato per l'uso dei loro tessuti prima dell'intervento chirurgico. L'uso di tutti i campioni è stato approvato dal comitato etico dell'ospedale Zhejiang popolare della Provincia.
Quantitativa real-time PCR
qRT-PCR è stata effettuata per determinare il livello di mRNA della GP73. In breve, l'RNA totale è stato estratto da 40 coppie di campioni di tessuto della mucosa gastrica abbinati tumorali e adiacenti non tumorali, utilizzando Trizol (Invitrogen, Camarillo, USA) secondo le istruzioni del produttore. sintesi del cDNA è stata condotta con il kit PrimeScript 1a Strand cDNA Synthesis (Takara, DaLian, Cina), utilizzando 1 mg di RNA totale come modello e oligodT innesco sotto i 65 ° C, 5 minuti, 42 ° C, 60 minuti e 70 ° C, 10 minuti di trascrizione inversa. Il cDNA risultante è stato amplificato da qPCR utilizzando primer specifici con SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, Cina). GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. Primer per GP73 erano 5'-GCAAAGCAACATCTTCCCTA-3 '(senso) e 5'-CCACAACAAACTTGCCCTC-3' (antisenso). Primer per GAPDH erano 5'- TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 '(senso) e 5'- CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3' (antisenso). parametri di PCR erano come segue: 95 ° C per 5 minuti, seguito da 40 cicli di 95 ° C per 10s, 60 ° C per 20s e 72 ° C per 20s. Al termine dei cicli di PCR, analisi della curva di fusione è stata eseguita. L'espressione relativa dei GP73 per GAPDH è stato calcolato utilizzando 2 -ΔCT metodo.
Blotting
Western blotting occidentale è stata effettuata per indagare il livello della proteina GP73 in 5 su 41 coppie di tessuto tumorale gastrica e adiacente non-tumorale tessuto della mucosa. Proteina è stato isolato da campioni tessuti dopo l'estrazione di RNA. E circa 30 mg di proteine ​​è stato separato su gel di poliacrilammide 10% per due ore. Dopo essere stato trasferito in una polyvinylidenedifluoride (PVDF) membrana (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut, USA), i campioni sono stati sondati con anticorpi primari contro GP73 (1: 2.000, Sigma, St. Louis, MO, USA) e β-actina ( 1: 5.000, Sigma, Stati Uniti d'America) a 4 ° Covernight. Dopo l'incubazione con anticorpo secondario (1: 5.000, CapitalBio, Pechino, Cina) per 2 ore, le membrane sono stati trattati con elettrochemiluminescenza (ECL) reagente (Generay, Shanghai, Cina) e esposto a autoradiographicfilms
colorazione immunoistochimica
immunoistochimica. colorazione è stata eseguita con il metodo standard. Brevemente, 52 casi di tessuti tumori gastrici inclusi in paraffina e 10 casi di controlli di tessuto mucosale non tumorali adiacenti sono stati tagliati a 5 micron di spessore e poste su vetrini microscopici ed essiccati in forno a 60 ° per 2 ore. Quindi, le sezioni sono state de-paraffinized in xilene, reidratate usando un gradiente di concentrazione di etanolo, scaldati in 10 mM tampone citrato per 15 minuti per recuperare l'antigene, bloccato con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti per inibire l'attività perossidasica endogena e incubate con 10 % di capra siero non immune per 20 minuti per ridurre la colorazione di fondo aspecifica. Dopo di che, le sezioni sono state incubate con il coniglio anti-GP73 anticorpo policlonale (Abcam, Cambridge, UK) (diluizione 1: 100) a 4 ° C per una notte, poi incubate con anticorpo secondario marcato con biotina (Invitrogen, USA) a temperatura ambiente per 20 minuti, seguito da incubazione con streptavidina HRP-coniugato (Invitrogen, USA) a temperatura ambiente per 20 minuti. Poi, lo sviluppo del colore è stata eseguita con un substrato kit DAB (Dako, Carlsbad, Stati Uniti d'America). Infine, le sezioni sono state contrastate con ematossilina, disidratate, cancellati e montate.
Valutazione degli immunohistochemicalstainings
I immunohistochemicalstainings della GP73 sono stati segnati da due patologi indipendentemente, in base alla intensità e la percentuale di cellule colorate positivamente. intensità di colorazione è stata valutata con un sistema di valutazione a quattro livelli: 0 = negativo, 1 = debole, 2 = moderato e 3 = forte. La percentuale di cellule positive sono state ottenuto come segue: 0 per nessuna cellula colorata, 1 per 1% al 25% di cellule marcate, 2 per il 26 al 50% delle cellule colorate, 3 per il 51 al 75% di cellule colorate e 4 per ulteriori oltre il 75% delle cellule colorate. Spartiti per intensità e la percentuale di cellule positive sono state moltiplicate. I punteggi ≤3 è stato utilizzato per definire i tumori con l'espressione GP73 basso e segna ≥4 con l'espressione alta GP73.
Analisi statistica
analisi statistica è stata effettuata utilizzando il software SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). L'campioni appaiati t-test è stato utilizzato per analizzare le differenze di espressione dell'mRNA GP73 tra tumore e tessuti non tumorali. Test chi-quadrato è stato applicato per valutare la significatività statistica delle associazioni tra espressione GP73 e parametri clinico-patologici. P
< 0,05 è stato considerato statisticamente significativo
Risultati
GP73 livello di espressione nel tumore gastrico e la non-tumorale tessuto
espressione GP73 mRNA era significativamente diminuito nei tessuti tumorali gastrici rispetto alla adiacente non-tumorale. tessuti (33/41; 80,5%). I livelli di espressione GP73 rispetto al GAPDH erano molto più bassi nei tessuti tumorali gastriche (0,259 ± 0,308) rispetto a quella mucose non tumorali (0,584 ± 0.523; P
< 0,01; Figura 1). Coerentemente con RT-qPCR, livello di proteina GP73 in campioni tumorali gastriche era significativamente inferiore a quello dei campioni non tumorali, che è stato testato mediante Western blotting (Figura 2). Figura 1 espressione GP73 mRNA nei tessuti tumorali gastriche e mucose non tumorali adiacenti.
Figura livello di proteine ​​2 GP73 in campioni tumorali gastriche e campioni di mucosa non tumorali adiacenti. A) il livello della proteina GP73 nei campioni tumorali gastriche e campioni di mucosa non tumorali adiacenti. B) Livello GP73 mRNA negli stessi campioni tumorali gastriche e campioni mucosa non tumorali adiacenti. C) carcinoma gastrico; N:. Normale)
correlazione tra l'espressione della proteina GP73 e parametri clinico-patologici
IHC ha dimostrato che GP73 è altamente espresso nei tessuti della mucosa non tumorale adiacente, ma è diminuito o addirittura assente nei tessuti tumorali gastriche. In mucosa non-tumorale, forte colorazione citoplasmatica diffusa potrebbe essere visto in cellule situate sulla superficie del vano ghiandolare e foveolar (Figura 3A). Nei tessuti tumorali, espressione GP73 è espresso principalmente in una distinta semi-granulare pattern di colorazione puntiforme (Figura 3B, C). Solo un paio di tessuti tumorali gastriche sono stati trovati con una forte espressione della GP73 (Figura 3D). Figura espressione della proteina 3 GP73 nei tessuti tumorali gastriche e mucose non tumorali adiacenti. A) forte espressione della GP73 in tessuti non tumorali. B) debole espressione della GP73 nei tessuti tumorali gastriche. C) espressione moderato di GP73 nei tessuti tumorali gastriche. D) forte espressione della GP73 nei tessuti tumorali gastriche. a, b, c, d: ingrandimento originale 100 ×. A, B, C, D:. Ingrandimento originale × 200
La correlazione tra l'espressione di proteine ​​e variabili cliniche GP73 è riportata nella tabella 2. Il livello di espressione GP73 era significativamente correlata al sesso dei pazienti (P ​​=
0,027) e la differenziazione (P = 0.049
). L'espressione di GP73 in scarsamente tumori gastrici differenziati fosse molto inferiore a quella nei tumori gastrici moderatamente differenziati. Un totale di 21 su 30 casi di tumore gastrico scarsamente differenziati hanno mostrato espressione basso GP73, mentre nei casi di tumore gastrico moderatamente differenziati era solo 9/22. Inoltre, l'espressione della GP73 nei pazienti maschi è stato down-regolato con maggiore frequenza rispetto a quella in pazienti di sesso femminile. Non c'era alcuna correlazione significativa tra l'espressione GP73 e altri clinicopathologic parameters.Table 2 Rapporto di espressione GP73 con i parametri patologici di tumore
parametri clinici
GOLPH2
P-value


basso
alta
numero totale
30
22
genere
0.027
Maschio
28
15
Donna 2
7
Età (anni)
0,456
< 60
12 10
≥60
18
12
Le dimensioni del tumore (cm2)
1.000
< 20
14
6
≥20
16
16
differenziazione
0,049
moderatamente differenziato
9
13
scarsamente differenziato
21
9
fase
0,390
I + II
12
6
III + IV
18
16
profondità dell'invasione parete
1.000
T1 + T2 Pagina 8 Pagina 6
T3 + T4
22
16
linfatico metastasi
0,757
No 7
6
Sì
23
16
metastasi a distanza
0,725
No
25
17
Sì
5
5
Discussione
Recentemente, diversi studi hanno dimostrato che GP73 è sovra-espresso in alcuni tipi di cancro, tra cui carcinomi epatocellulari, carcinomi dei dotti biliari, il cancro del polmone, cancro alla prostata e seminoma [ ,,,0],9-15]. In carcinomi epatocellulari, alta espressione della GP73 è stata associata con le dimensioni del tumore, differenziazione, qualità e vena invasione [7-9]. In carcinomi del dotto biliare, espressione GP73 correlata con l'età del paziente e la sopravvivenza [11]. Nel cancro del polmone, espressione GP73 è stata associata con l'istologia del tumore e il sesso del paziente; la sua espressione in adenocarcinoma era significativamente più alta che in altri tipi di tumore del polmone [12]. Tuttavia, nessuna correlazione con i parametri clinico-patologici è stato trovato nel cancro della prostata e seminoma [13, 15]. GP73 anche è stato trovato down-regolato in RCC a cellule chiare, che è il sottotipo istologico più comune di cancro a cellule renali, mentre la sua espressione in papillare e cromofobo RCC era forte [18]. Nel presente studio, abbiamo riscontrato che sia GP73 mRNA e livelli di proteine ​​erano altamente espresse in mucose gastriche non tumorali, che sono stati opposta alla maggior parte degli studi precedenti in altri tipi di tumore.
La conoscenza della funzione di GP73 resta ancora limitata. Finora, sappiamo che GP73 è essenziale per il fegato e rene per mantenere la funzione normale e l'aspetto. È anche noto che GP73 può funzionare per aiutare nel trasporto di proteine ​​e la secrezione. Una di queste proteine, sCLU, è già stato individuato. sCLU potrebbe prevenire l'apoptosi ed è sovra-espresso in vari tipi di cancro. GP73 potrebbe interagire con sCLU attraverso dominio avvolto a spirale e assistere il trasporto e la secrezione di sCLU, che può spiegare l'associazione tra alto espresso GP73 e il comportamento aggressivo dei carcinomi epatocellulari [3]. Nel carcinoma epatocellulare (HCC), la sovra-espressione di GP73 non solo è stato rilevato nei tessuti tumorali, ma anche nel siero dei pazienti, che ha indicato l'aumento significativo dei livelli GP73 fornirebbe un marcatore per la diagnosi precoce. Alcuni rapporti anche dichiarato che GP73 è un indicatore migliore di AFP per la diagnosi di HCC [10, 11, 18, 21]. Tuttavia, ciò che è la funzione della GP73 nello stomaco e perché dovrebbe essere down-regolato in cancro gastrico? Questo non è ancora chiaro. GP73 è una proteina specifica delle cellule epiteliali e altamente espresso in numerosi tessuti umani normali, soprattutto nel colon e dello stomaco. Inoltre è prevalentemente espresso nel piccolo intestino, colon e dello stomaco di topi [22]. Coerentemente con questi studi, abbiamo anche scoperto che GP73 era altamente espresso da cellule situate sulla superficie del vano ghiandolare e foveolar della mucosa gastrica umana. Dal momento che l'espressione più alta della GP73 è nelle cellule epiteliali di organi digestivi, è ragionevole presumere che si può giocare alcuni importanti ruoli sconosciuti nel sistema digestivo.
Abbiamo anche trovato l'espressione della GP73 è stata associata con la differenziazione del tumore. L'espressione di GP73 in scarsamente tumori gastrici differenziati fosse molto inferiore a quella nei tumori gastrici moderatamente differenziati. È stato riferito che knock-down della GP73 nelle cellule HepG2.2.15 potrebbe causare una riduzione della superficie del complesso Golgi. Poiché la dimensione e lo sviluppo del complesso Golgi sono correlati positivamente con differenziazione del tumore, alcuni ricercatori hanno ipotizzato che l'espressione GP73 può essere associata a mantenere l'integrità strutturale del complesso Golgi durante oncogenesi [23, 24]. Recenti studi hanno dimostrato che la perdita di GP73 causato up-regolazione di WT1, che possono promuovere la formazione glomo e inibisce la differenziazione tubulo pronephric. E 'suggerito che GP73 svolge un ruolo importante nello sviluppo e nella differenziazione pronephros [25]. Nel carcinoma epatocellulare, la proteina GP73 era fortemente associata con le dimensioni del tumore, vena invasione e differenziazione del tumore, suggerendo espressione GP73 è correlata con il comportamento aggressivo di cancro [10]. Inoltre, l'espressione della GP73 è stata anche associata con il sesso del paziente. pazienti di sesso maschile hanno mostrato espressione GP73 basso più frequentemente rispetto ai pazienti di sesso femminile. Un fenomeno simile è stata riportata anche nel cancro del polmone. Le pazienti avevano una più alta espressione della GP73 rispetto ai pazienti di sesso maschile [12]. Si dice anche che i cambiamenti fenotipici osservati nei topi con tronco GP73 C-terminale sono sesso-dipendente [4]. Una spiegazione è che GP73 mRNA è regolata da estrogeni e calcitriolo [26]. Il nostro lavoro ancora una volta ha confermato l'ipotesi che l'espressione GP73 è sotto controllo ormonale.
Conclusione
In conclusione, abbiamo scoperto che sia la GP73 mRNA e il livello di proteine ​​era significativamente down-regolato nei tessuti tumorali gastrici rispetto alla mucosa non-tumorale , e l'espressione della GP73 è stata associata con la differenziazione del tumore e il sesso del paziente. Il nostro ulteriore lavoro si concentrerà sullo studio della funzione e del meccanismo di regolazione della GP73 nello stomaco
Abbreviazioni
AFP:.
Α-fetoproteina
ECL :
ElettroChemiLuminescenza
GC:
cancro gastrico
GP73:
proteina Golgi 73

HCC:
carcinoma epatocellulare
PSA:
antigene prostatico specifico
PVDF:
Polyvinylidenedifluoride
RCC:.
carcinoma renale
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da Zhejiang Programma Provinciale per la coltivazione di alto livello Talenti sanitari innovativi.
degli autori originali presentate file per le immagini
di seguito sono riportati i link ai degli autori fascicoli presentati originali per immagini. 'file originale per la figura 1 12957_2012_1362_MOESM2_ESM.tif Autori 12957_2012_1362_MOESM1_ESM.tif autori file originale per la figura 2 12957_2012_1362_MOESM3_ESM.tif Autori file originale per gli interessi figura 3 Competere
Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.
Autori' contributi
LGC e HJW sono stati coinvolti nella progettazione dello studio, eseguito il qRT-PCR, bullonatura occidentale e l'analisi immunoistochimica, e redatto il manoscritto. ZYY e HQT sono stati coinvolti nella progettazione dello studio e supervisionato lo studio. HBY, FW e TPG raccolto dati e ha contribuito a redigere il manoscritto. XJH e YYM fornito supporto generale e ha contribuito a redigere il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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