miRNA signatur i samband med resultatet av gastric cancerpatienter efter kemoterapi

miRNA signatur i samband med resultatet av gastric cancerpatienter efter kemoterapi Bild Sammanfattning
Bakgrund
Identifiering av patienter som sannolikt kommer eller inte kommer att gynnas av cytostatika genom användning av biomarkörer kan avsevärt förbättra klinisk behandling av bättre definiera lämplig behandling alternativ för patienter. mikroRNA kan vara potentiellt användbara biomarkörer som vägleder individualiserad behandling för cancer eftersom mikroRNA uttryck oreglerad i cancer. För att identifiera miRNA signaturer för magcancer och för att förutsäga klinisk resistens mot cisplatin /fluorouracil (CF) kemoterapi, var en omfattande miRNA microarray analys utförs med hjälp av endoskopiska biopsiprov.
Metoder
Biopsiprover samlades före kemoterapi från 90 patienter magsäckscancer behandlas med CF och från 34 friska frivilliga försökspersoner. Vid tiden för sjukdomsprogression, ades efter behandling prover dessutom uppsamlas från 8 kliniska responders. miRNA uttryck bestämdes med användning av ett skräddarsytt Agilent microarray. För att identifiera en miRNA signatur för kemoterapi motstånd, korrelerade vi miRNA expressionsnivåer med tiden till progression (TTP) av sjukdom efter CF terapi.
Resultat Review, en miRNA signatur skilja magcancer från normal mage epitel identifierades. 30 miRNAs signifikant omvänt korrelerade med TTP, medan 28 miRNAs signifikant positivt korrelerat med TTP av 82 cancerpatienter (P Hotel < 0,05). Framträdande bland uppreglerade miRNA i samband med chemosensitivity var miRNA kända för att reglera apoptos, inklusive låt-7g, MIR-342, MIR-16, MIR-181, MIR-1, och MIR-34. När denna 58-miRNA prediktor applicerades på en separat uppsättning av pre- och post-behandlingstumörprover från de 8 kliniska responders, alla av de 8 förbehandlings proverna var korrekt förutsagd som låg risk, medan prover från efterbehandlingen tumörer som utvecklade chemoresistance förutsades vara i högriskkategorin i 58 miRNA signatur, vilket tyder på att valet för att uttrycka dessa miRNA inträffade som chemoresistance uppstod.
slutsatser
Vi har identifierat en) en miRNA uttryck signatur som skiljer magcancer från normal mage epitel från friska frivilliga försökspersoner, och 2) en chemoreresistance miRNA uttryck signatur som är korrelerad med TTP efter CF terapi. Den chemoresistance miRNA uttryck signatur innehåller flera miRNA tidigare visat att reglera apoptos in vitro
, och teckningsoptioner ytterligare validering.
Bakgrund
miRNAs är korta (~ 22 nukleotid), icke-kodande RNA som reglerar genuttryck i första hand genom translationella repression eller transkriptions nedbrytning [1]. miRNA har stor potential som cancer biomarkörer på grund av deras vävnadsspecifika uttryck och deras avvikande uttryck i cancerceller [2]. Dessutom miRNAs har viktiga funktioner i cellcykelreglering och apoptos. Expressionen av miRNA kan dysreglerad i cancer genom en mängd olika mekanismer inkluderande transkriptionell reglering, amplifiering, deletion, mutation och epigenetisk ljuddämpnings [3]. Således kan mikroRNA vara potentiellt användbara biomarkörer som vägleder individualiserad behandling.
Att identifiera patienter som sannolikt kommer eller inte kommer att gynnas av cytostatika genom användning av biomarkörer kan avsevärt förbättra klinisk behandling av bättre definierar lämpliga behandlingsalternativ för patienter. De flesta tidigare studier försöker identifiera miRNA prediktorer för chemoresistance i cancer har undersökt endast enskilda miRNA [4]. Hittills har endast en publicerats hög genomströmning microarray analys utvärderades miRNA uttryck signaturer som prediktorer för kemoterapi motstånd i metastatiska solida tumörpatienter [5]. I detta miRNA microarray studie av stadium III-IV äggstockscancer, låt-7i uttryck visade sig vara betydligt mindre i 27 kemoterapi resistenta patienter jämfört med 42 kompletta responders, även om det fanns ingen oberoende validering kohort [5].
här presenterar vi resultatet av en prospektiv studie med användning av en hög genomströmning miRNA microarray analys, i vilken en miRNA uttryck signatur har identifierats som skiljer magcancer från normal mage epitel. Vidare har vi identifierat en andra signatur som är korrelerad med tiden till progression (TTP) för patienter magsäckscancer som behandlats med cisplatin och fluorouracil (CF), en referens kemoterapi ordning för magcancer. Dessa miRNA signaturer kan vara användbara som potentiella biomarkörer för att hjälpa vid diagnos av magcancer i svåra fall och förutsäga svaret av gastric cancerpatienter att CF terapi.
Resultat
Identifiering av en magcancer miRNA signatur
Ninety förbehandlingsmagsäckscancer vävnadsprover fanns tillgängliga för denna analys och deras kliniskt patologiska egenskaper beskrivs i Tabell 1. Alla patienter hade metastatisk sjukdom vid tiden för inskrivning och efter endoskopisk biopsivävnadsprover samlades, behandlades patienterna med cisplatin och fluorouracil (eller capecitabin ) kombinationskemoterapi. Alla microarray data har deponerats vid GEO och är tillgänglig vid offentliggörandet. Recensent tillträde: http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070Table En klinisk-patologiska egenskaper hos patienter
vid Gastric cancerpatient
friska frivilliga

Träning
set
Proof-of-principle
provuppställning
(svars)
vid Number
82
8
34
Ålder - yr
Median
56
56
48
kvartilavståndet
(44-63) Review (44-58) Review ( 43-57) Review Sex - nej. (%) Review Male
64 (78,0%) Review 7 (87,5%) Review 23 (67,6%) Review Kvinna
18 (22,0%) katalog 1 (12,5% ) Review 11 (32,4%) Prestationstatus (PS) - nej. (%) Review ECOG1 PS 0 eller 1
73 (89,0%) Review 8 (100%)
ECOG PS 2 eller 3
9 (11,0%)
0
histologisk typ - nej. (%) Review Laurens tarm
34 (41,5%) katalog 3 (37,5%) Review Laurens diffusa
48 (58,5%) Review 5 (62,5%) Review placering primära lesionen - nej. (%) Review Övre 1/3
11 (13,4%) katalog 1 (12,5%) Review USA 1/3
18 (22,0%) Review 5 (62,5%)
Lower 1/3
43 (52,4%) Review 1 (12,5%) katalog hela magen
10 (12,2%) Review 1 (12,5%) Review kemoterapi regimen - ingen . (%) Review Cisplatin /Fluorouracil
80 (97,6%) Review 8 (100%) Review Cisplatin /Capecitabine
2 (2,4%) katalog 0
* Relativ dosintensiteten -%
Median
81,2 76,6
kvartilavståndet
(75,3-87,3) Review (64,7-84,9) Review Antal kemoterapicykler
Median
4
10
kvartilavståndet
(2-5) Review (7-11) Review Chemotherapy svar (WHO kriterier) -ingen (%) Review PR2
16 (24,6% ) Review 6 (100%) Review SD3
25 (38,5%) Review PD4
24 (36,9%) katalog Omätbar
16 2
Unevaluable
1
andra linjens behandling
55 (67,1%) Review 6 (75,0%) Review Median uppföljning efter överlevande
35,5 månader -
överlevnad - . mo
Median
8,2 16
kvartilavståndet
(6,8-10,5) Review (11,3-26,7) Review Tid till progression - mo.
Median
3,1 8,2
kvartilavståndet
(2,5-3,9) Review (4,3-21,2) Review 1Eastern Cooperative Oncology Group, 2partial svar 3stable sjukdom, 4progressive sjukdom
* Relativ dosintensiteten
* Medelvärde av relativa dos intensiteten hos cisplatin och fluorouracil. Dosintensiteten definieras som den mängd läkemedel som administreras per tidsenhet, uttryckt som milligram per kvadratmeter per vecka. Relativ dosstyrka definieras som den verkliga dosen intensiteten i förhållande till den planerade dosintensiteten av varje läkemedel.
Vi först jämfördes miRNA profiler från de 90 förbehandlingsprover erhållna från patienter med ventrikelcancer med expressionsdata miRNA från 34 normala gastriska mukosala biopsiprover erhållet från friska frivilliga försökspersoner (figur 1). För att uppskatta den prediktiva kraften i cancerspecifik miRNA profiler, analyser klass förutsägelse utfördes också genom att slumpmässigt dela upp hela provet i två (utbildning och test) delmängder vid ett-till-ett-förhållande. Randomisering utfördes med användning nQuery rådgivare mjukvara (version 7,0, Statistiska Solutions, Saugus, MA). Då klass etiketten på varje prov i testuppsättningen förutspåddes för var och en av 100 slumpmässiga utbildning för att testa partitioner enligt föreningen kovariat prediktor (KKP), diagonal linjär diskriminantanalys (LDA), 1- och 3-närmaste grannar (NN), närmast centroid (NC), och stödvektormaskin (SVM). Vid en funktion urval P Hotel < 0,05, median förutsägelse noggrannhet i provuppsättningar var > 90% i alla klassificerare (91,9%, 90,3%, 90,3%, 93,5%, 93,5%, och 91,9% för CCP, LDA, en-NN, 3-NN, NC, och SVM, respektive), i 100 slump utbildning till test partitioner. Figur 1 Studie system för att identifiera och testa miRNA förutsäga resistens mot CF.
Tabell 2 listar miRNA som differentiellt uttrycks mellan 90 gastric cancertumörer och 34 normala prover på en funktion urval av P Hotel < 0,005. Många miRNA som är överuttryckta i magcancer gruppen tillhör Mir-17-92 och 106b-25 kluster, som tidigare rapporterats [6, 7]. Kvantitativ realtids-RT-PCR (Q-RT-PCR) analyser bekräftade det differentiella uttrycket av vissa av dessa miRNA i gastriska cancerprov (figur 2). Även MIR-25 var signifikant uppregleras av array analys i tumörerna, hade detta inte statistisk signifikans av Q-PCR, kanske på grund av det begränsade antalet prov som fanns tillgängliga för analys. Även om en tidigare studie rapporterade att MIR-486 nedregleras i magcancer, fann vi uttryck av MIR-486 att höjas i vår uppsättning av gastric cancerpatienter både av microarray och Q-PCR (Ytterligare fil 1: Figur S1) .table 2 miRNAs differentiellt uttryckta i magcancer och normal mage epitel.
uttryckt i magcancer
p
FDR
Ratio
HSA-mIR-25 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
1,64
HSA-MIR-106b Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
1,85
HSA-MIR-93 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
1,49
HSA-MIR-503 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
2,17
HSA-MIR-18a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
2.27
hsa-miR-224
1.00E-07
2.59E-06
3.85
hsa-miR-451
1.00E-07
2.59E-06
3.23
hsa-miR-18b
2.00E-07
4.60E-06
2.17
hsa-miR-17-5p
2.00E-06
3.60E-05
1.61
hsa-miR-486-5p
3.00E-06
5.18E-05
2.22
hsa-miR-144
9.60E-06
0.000159
5.56
hsa-miR-552
1.03E-05
0.000164
2.38
hsa-miR-425-5p
1.32E-05
0.000195
1.35
hsa-miR-92
1.88E-05
0.000268
1.39
hsa-miR-106a
2.61E-05
0.000347
1.52
hsa-miR-223
2.68E-05
0.000347
2.13
hsa-miR-205
2.98E-05
0.000363
4.76
hsa-miR-196b
4.42E-05
0.000508
1.67
hsa-miR-19a
0.0001836
0.00181
1.69
hsa-miR-191
0.0003112
0.0028
1.27
hsa-let-7i
0.0004468
0.00385
1.20
hsa-miR-185
0.0004764
0.00394
1.32
hsa-miR-769-5p
0.0006683
0.00532
1.37
hsa-miR-196a
0.0008274
0.00646
1.45
hsa-miR-301
0.0009715
0.00745
1.82
hsa-miR-21
0.0012598
0.00948
1.49
hsa-miR-130b
0.0015411
0.0112
1.30
hsa-miR-19b
0.0015959
0.0114
1.39
hsa-miR-424
0.0019249
0.0135
1.52
hsa-miR-484
0.0020451
0.0139
1.33
hsa-miR-767-5p
0.0048511
0.03
1.64
hsa-miR-183
0.0050428
0.0305
1.52
hsa-miR-210
0.0053848
0.0318
1.35
hsa-miR-302c*
0.006328
0.0364
1.41
hsa-miR-520g
0.0070896
0.0402
2.13
hsa-miR-324-5p
0.0095742
0.0497
1.23
hsa-miR-103
0.0095861
0.0497
1.16
hsa-miR-376b
0.0096083
0.0497
1.85
hsa-miR-151
0.0100422
0.0513
1.20
hsa-miR-596
0.011231
0.0556
1.61
hsa-miR-545
0.011422
0.0556
1.69
hsa-miR-221
0.0129139
0.0608
1.27
hsa-miR-20a
0.0133176
0.0619
1.35
hsa-miR-181b
0.0148487
0.0655
1.28
hsa-miR-181d
0.0154891
0.0668
1.16
hsa-miR-623
0.0189476
0.0809
1.43
hsa-miR-519d
0.0220958
0.0915
1.59
hsa-miR-563
0.0229302
0.094
1.37
hsa-miR-505
0.0241657
0.097
1.25
hsa-miR-107
0.0242694
0.097
1.11
hsa-miR-320
0.0282982
0.111
1.20
hsa-miR-96
0.0285699
0.111
1.39
hsa-miR-339
0.0312524
0.12
1.32
hsa-miR-181a
0.0318141
0.121
1.20
hsa-miR-345
0.0322275
0.121
1.19
hsa-miR-20b
0.0325811
0.122
1.28
hsa-miR-33b
0.0339343
0.125
1.64
hsa-miR-135b
0.0352682
0.129
1.59
hsa-miR-431
0.0374687
0.134
1.41
hsa-miR-193a
0.0377098
0.134
1.35
hsa-miR-550
0.0380645
0.134
1.30
hsa-miR-565
0.0446875
0.15
1.20
Underexpressed i magcancer
p
FDR
Ratio
HSA-MIR-146a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,39
HSA-MIR-133a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,34
HSA-MIR-625 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,56
HSA-MIR-375 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,27
HSA-MIR-133b Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,32
HSA-MIR-195 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,47
HSA-MIR-148a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,47
HSA-MIR-1 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,27
HSA-MIR-26a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0.67
hsa-miR-204
2.00E-07
4.60E-06
0.26
hsa-let-7c
7.00E-07
1.53E-05
0.74
hsa-let-7a
9.00E-07
1.86E-05
0.72
hsa-let-7g
1.10E-06
2.17E-05
0.71
hsa-miR-497
1.70E-06
3.20E-05
0.56
hsa-miR-26b
1.28E-05
0.000195
0.58
hsa-miR-145
2.04E-05
0.000282
0.65
hsa-miR-34a
2.89E-05
0.000363
0.75
hsa-miR-143
4.28E-05
0.000506
0.63
hsa-miR-650
9.15E-05
0.00101
0.57
hsa-miR-150
9.25E-05
0.00101
0.49
hsa-miR-768-5p
0.0001037
0.0011
0.65
hsa-let-7d
0.0001302
0.00132
0.76
hsa-miR-203
0.0001311
0.00132
0.52
hsa-miR-29c
0.0002112
0.00203
0.52
hsa-let-7f
0.0002446
0.0023
0.69
hsa-miR-30d
0.0002592
0.00238
0.78
hsa-miR-642
0.0004345
0.00383
0.62
hsa-miR-30c
0.0004556
0.00385
0.75
hsa-miR-155
0.0004998
0.00406
0.66
hsa-miR-34b
0.0013651
0.0101
0.64
hsa-miR-551b
0.0019808
0.0137
0.53
hsa-miR-28
0.0027537
0.0184
0.85
hsa-let-7e
0.0034793
0.0227
0.84
hsa-let-7b
0.0035019
0.0227
0.85
hsa-miR-212
0.0039061
0.0249
0.76
hsa-miR-564
0.0047906
0.03
0.72
hsa-miR-770-5p
0.0050814
0.0305
0.71
hsa-miR-30b
0.0060842
0.0355
0.76
hsa-miR-30a-5p
0.0077597
0.0434
0.80
hsa-miR-199b
0.0083572
0.0461
0.67
hsa-miR-125a
0.0085563
0.0466
0.77
hsa-miR-621
0.0093423
0.0497
0.69
hsa-miR-31
0.0106862
0.054
0.66
hsa-miR-365
0.0113404
0.0556
0.78
hsa-miR-381
0.0123061
0.0592
0.70
hsa-miR-626
0.0128738
0.0608
0.78
hsa-miR-127
0.0138033
0.0635
0.69
hsa-miR-660
0.0142991
0.0651
0.75
hsa-miR-342
0.0146193
0.0655
0.75
hsa-miR-146b
0.0148729
0.0655
0.77
hsa-miR-361
0.0152056
0.0663
0.86
hsa-miR-489
0.0191692
0.081
0.71
hsa-miR-29a
0.0204334
0.0854
0.79
hsa-miR-95
0.0243644
0.097
0.54
hsa-miR-567
0.0265025
0.104
0.54
hsa-miR-152
0.0376121
0.134
0.78
hsa-miR-429
0.0378151
0.134
0.65
hsa-miR-200b
0.0396617
0.138
0.75
hsa-miR-504
0.0412648
0.142
0.63
hsa-miR-668
0.041717
0.143
0.77
hsa-miR-186
0.0437991
0.149
0.83
hsa-miR-135a
0.0468793
0.157
0.58
hsa-miR-485-5p
0.047683
0.158
0.82
Figur 2 Validering av miR expression med kvantitativ realtids-RT-PCR (Q-RT-PCR). Q-RT-PCR-analyser av MIR-18a, MIR-25, MIR-1, och låt-7g i 4 normal (visas i vitt
) och 4 cancerprov (visas i svart
), bekräftar över uttryck av mIR-18a och mIR-25 och under uttryck mir-1 och låt-7g som observerats i microarray data för cancerprov. Student t-test P
värde mellan 4 normal och 4 cancerprover visas för varje miRNA. Faldig förändring (FC) på -1 indikerar en 50% minskning av RNU6-normaliserat uttryck för en viss miRNA.
Identifiering av en miRNA signatur för resistens mot CF terapi
Tid till progression (TTP), inte röntgensvar, användes som den kliniska indikatorn för kemoterapi svar framför allt eftersom vi ville inkludera patienter som inte hade mätbar sjukdom med hjälp av standardavbildningsmetoder. För att definiera en från 82 prover som utbildningen inställd på att utveckla en prediktor (Figur 1). Dessa 82 förbehandlings prover samlades in från patienter som inte genomgår andra biopsier. Femtioåtta miRNA signifikant korrelerade med TTP av dessa 82 patienter (funktionsval P
value < 0,05) (tabell 3). Överuttryck av 30 miRNA var associerat med fördröjd TTP medan överuttryck av 28 miRNA var associerad med en snabbare TTP. Sex * miRNA som var förknippade med chemoresistance, inklusive MIR-518f * Mir-520A, MIR-520d *, MIR-519e * Mir-363 *, och MIR-517 *, medan inga * miRNA associerades med chemosensitivity.Table 3 miRNA vars uttryck är associerat med chemosensitivity eller chemoresistance.
miRNAa vars uttryck är associerat med chemoresistance
p
FDR

Hazard Ratio

hsa-miR-526a
0.0000
0.0103
1.482
hsa-miR-122a
0.0002
0.0379
1.545
hsa-miR-518f*
0.0004
0.0537
1.298
hsa-miR-591
0.0007
0.0598
1.492
hsa-miR-524-3p
0.0010
0.0682
1.268
hsa-miR-320
0.0013
0.0701
1.865
hsa-miR-520a*
0.0014
0.0701
1.252
hsa-miR-183
0.0031
0.119
1.39
hsa-miR-516-5p
0.0034
0.119
1.306
hsa-miR-629
0.0036
0.119
1.42
hsa-miR-595
0.0043
0.119
1.858
hsa-miR-640
0.0054
0.132
1.3
hsa-miR-520d*
0.0063
0.143
1.326
hsa-miR-519e*
0.0091
0.164
1.24
hsa-miR-363*
0.0096
0.166
1.407
hsa-miR-513
0.0137
0.193
1.347
hsa-miR-328
0.0163
0.211
1.736
hsa-miR-519a
0.0170
0.211
1.118
hsa-miR-185
0.0189
0.217
1.697
hsa-miR-658
0.0200
0.223
1.532
hsa-miR-517*
0.0218
0.226
1.305
hsa-miR-515-5p
0.0349
0.301
1.145
hsa-miR-519c-5p
0.0368
0.304
1.157
hsa-miR-661
0.0392
0.315
1.437
hsa-miR-182
0.0416
0.315
1.408
hsa-miR-206
0.0417
0.315
1.606
hsa-miR-193b
0.0419
0.315
1.433
hsa-miR-601
0.0436
0.317
1.599
miRNA vars uttryck är associerat med chemosensitivity
p
FDR
Hazard Ratio
hsa-miR-195
0.0007
0.0598
0.593
hsa-miR-146b
0.0016
0.0733
0.565
hsa-miR-26b
0.0037
0.119
0.686
hsa-miR-374
0.0042
0.119
0.84
hsa-miR-199b
0.0051
0.132
0.729
hsa-miR-132
0.0068
0.143
0.62
hsa-miR-140
0.0069
0.143
0.759
hsa-miR-487b
0.0088
0.164
0.679
hsa-let-7g
0.0091
0.164
0.539
hsa-miR-340
0.0103
0.171
0.82
hsa-miR-155
0.0109
0.174
0.704
hsa-miR-95
0.0115
0.176
0.856
hsa-miR-186
0.0137
0.193
0.662
hsa-miR-130a
0.0140
0.193
0.72
hsa-miR-342
0.0151
0.202
0.685
hsa-miR-577
0.0173
0.211
0.804
hsa-miR-128b
0.0184
0.217
0.701
hsa-miR-146a
0.0209
0.226
0.776
hsa-miR-16
0.0214
0.226
0.698
hsa-miR-503
0.0241
0.243
0.721
hsa-miR-224
0.0259
0.25
0.853
hsa-miR-223
0.0259
0.25
0.794
hsa-miR-128a
0.0294
0.276
0.704
hsa-miR-181b
0.0300
0.276
0.668
hsa-let-7f
0.0312
0.281
0.725
hsa-miR-1
0.0339
0.298
0.839
hsa-miR-421
0.0367
0.304
0.738
hsa-miR-127
0.0404
0.315
0.783
hsa-miR-34c
0.0435
0.317
0.74
hsa-miR-497
0.0493
0.351
0.769
Figur 3 visar en Kaplan-Meier-kurva för riskgrupper stratifierade efter dessa 58 miRNA. En permutation signifikansnivå för log-rank statistik ledighet-en-out kors validerade Kaplan-Meier kurvor var 0,021, vilket tyder på att sambandet mellan miRNA expressionsdata till TTP är statistiskt signifikant. Figur 3 Kaplan-Meier kurvor för tiden till progression (TTP) 2 riskgrupper stratifierat enligt uttrycket av 58 miRNA korrelerade med TTP på ett urval funktionen P < 0,05. Föreningen av miRNA expressionsdata till TTP var statistiskt signifikant (permutation P
värde för log-rank statistik tvär validerade Kaplan-Meier kurvor = 0,021) Redovisning av chemoresistance signatur.
Korrelerar med utvecklingen av chemoresistance i tumörer som tidigare kemosensitivt
58 miRNA signatur identifieras ovan är prediktiva för att identifiera patienter som är eller inte är sannolikt att svara positivt på CF terapi. Vi postulerade att patienter som initialt visat en gynnsam 58 miRNA uttryck signatur skulle byta till en ogynnsam uttryck signatur när de utvecklat resistens mot CF terapi. För att testa denna möjlighet som ett proof-of-principle har 8 par provuppställning prover (endoskopiskt erhållits före och efter behandling) samlas in från 8 patienter som initialt visat en kliniskt svar på CF behandling, men som så småningom visade progressiv sjukdom vid vilken tidpunkt en andra endoskopisk biopsi togs. Som framgår av tabell 4 alla 8 förbehandlings prover från de kliniska responders var korrekt förutspådde av 58-miRNA prediktor att vara i lågriskgruppen (noggrannhet, 100%). Noterbart är 6 av 8 par var korrekt identifierats för chemosensitivity (dvs
. Ades efter behandling prover tilldelas en högre prediktiv index för kemoterapi svar än förbehandlings prover, och därför förväntas vara mer resistenta mot behandling) (noggrannhet, 75% ). När samma förutsägelse utfördes med hjälp av funktionen val P
värde av 0,01, förutsägelsen resultat förblivit densamma (tabell 4) .table 4 Prognos för chemoresistance i proof-of-principle testuppsättning
Prov ID
Feature val P < 0,05
vid vid Feature val P < 0,01
vid
Predictive
Index
Percentile1

Prediction
For
Pretreatment
Sample2

Overall
Prediction3


Predictive
Index
Percentile

Prediction
for
Pretreatment
Sample

Overall
Prediction

1 pre
39%
låg
felaktig
35%
låg
felaktig
ett inlägg
22%
24%
två pre
48%
låg
korrigera
49%
låg
korrekt
två inlägg
79%
77%
tre pre
55%
låg
korrigera
46%
låg
korrekt
3 inlägg
73%
77%
4 pre
13%
låg
rätt
24%
låg
korrekt
4 inlägg
72%
73%
5 pre
31%
låg
korrekt
33%
låg
korrekt
5 inlägg
48%
46%
6 pre
13%
låg
korrigera
27%
låg
korrekt
6 inlägg
16%
66%
7 pre
7%
låg
korrigera
12%
låg
rätt
7 efter
66%
57%
8 pre
52%
låg
felaktig
50%
låg
felaktig
8 inlägg
17%
24%
1The predictive index beräknades för varje prov genom denna övervakade principalkomponentmetod, där ett högt värde på det prediktiva index motsvarar en snabb progression efter kemoterapi (dvs.
., kort TTP). Om den prediktiva index för ett prov i provuppsättning motsvarade median prediktiva index för övningsuppsättningen, var provet tilldelas en 50% prediktiv index.
2The risk förutspåddes låg, om prediktiva index percentilen av förbehandlings provet var mindre än 67%
3Den förutsägelse ansågs korrekt om efterbehandlingsprover tilldelas en högre prediktiv index än förbehandlings prover.
Diskussion
Denna studie har utnyttjat en potentiell metod för att identifiera en miRNA signatur för gastric cancer kontra normal mage epitel och en miRNA signatur som förutsäger svar till standard CF terapi.
Eftersom rutin histopatologi tekniker ibland inte leder till en definitiv diagnos av magcancer, kan tillsatsen av en miRNA signatur från sådana patientprover förbättra noggrannhet på en diagnos av magcancer. I tidigare miRNA microarray studier av magcancer, var kontrollvävnader erhölls från regioner i magen av magcancer patienter som var fast beslutna att vara histologiskt normalt och inte från magen vävnad av friska normala frivilliga [6, 7]. Eftersom molekylära avvikelser finns ofta i histologiskt normal-framträdande vävnad intill tumörvävnad, valde vi att få kontroll vävnader från endoskopiska biopsiprov från normala, cancerfria frivilliga. De flesta av de differentiellt uttryckta miRNA rapporterats vara kännetecknande för magcancer i tidigare microarray studier [6, 7] identifierades också i magcancer signatur i vår nuvarande analyser. Men utöver dessa tidigare rapporterade miRNA i magcancer, vi dessutom identifierat potentiella tumörhämmande miRNAs (vid P Hotel < 0,05 [6] och P Hotel < 0,01 [7], inklusive MIR-1 [8 9] och låt-7 [10] som vi visat sig vara underexpressed i magcancer (vid P Hotel < 0,001). (tabell 2) Intressant, Oh et al fann uttryck av mIR-486 kan minskas i många . gastric cancer, i vissa fall, i samband med en genomisk förlust av regionen [11] Vi hittade mIR-486 vara överuttryckt i vår magcancer kohort av både microarray och Taqman PCR-analys (Ytterligare fil 1: Figur S1). Det är möjligt att denna skillnad i resultat beror på att mycket olika patientpopulationer som studerats.
i denna studie rapporterar vi för första gången till vår kunskap, en miRNA prediktor för svar på CF behandlingen. den 58 miRNA signatur som ger ett index för bedömning av potentiella svar på CF behandling kan vara användbar i stratifiera patienter i en grupp som ska få standardbehandling och en grupp som sannolikt inte kommer att gynnas av en sådan behandling och bör placeras på ett annat terapeutiskt prov. Flera av de 58 miRNAs vi identifierat i tabell 2 som är förknippade med TTP överensstämmer med publicerade rapporter om deras uttryck med chemoresistance och tumörbiologi. Framträdande bland uppreglerade miRNA i samband med en förlängd TTP (som definieras av en faror förhållande < 1) var miRNA som har visat sig inducera apoptos i mag- och andra cancerceller, såsom MIR-16, låt-7 g, MIR-181, mIR-342, mIR-1, och mIR-34 [8, 12-18]. MIR-16 förstärker apoptos induktion genom nutlin och genistein [12], och modulerar multiresistens av mänskliga gastric cancerceller [13] Uttryck av låt-7c eller låt-7g har visat sig minska uttrycket av Bcl-XL.
Huh7 och HepG2 cellinjer [14]. Låt-7g och MIR-181b är positivt korrelerade med klinisk respons av koloncancer till S-1, en oral fluorouracil [4]. MIR-181a och miR-181b har visat sig fungera som tumörsuppressorer som utlöser tillväxtinhibering, inducera apoptos och inhiberar invasion i gliomceller [15]. Rekonstitution av HSA-miR-342 i kolorektal cancer-cellinjen HT-29 inducerar apoptos [16]. MIR-1 sensibiliserar lungcancerceller mot doxorubicin-inducerad apoptos [8]. Ektopisk MIR-34 uttryck inducerar apoptos, cellcykelstopp eller åldrande i normala och tumörceller [17]. Således verkar överuttryck av dessa pro-apoptotiska miRNA i primära tumörer att vara en mycket konsekvent inslag i patienter som drar nytta CF.
Intressant nog har vi identifierat sex * miRNA som var förknippade med chemoresistance, inklusive MIR-518f *, MIR 520A, mIR-520d *, mIR-519e * mir-363 *, och mIR-517 *, medan inga miRNAs var förknippade med chemosensitivity. Endast en Mir, MIR-302 *, identifierades i magcancer miR signatur. miR * s anses vara passagerar trådar som tros normalt brytas ned från pre-miR vilket resulterar i den mogna 22 nt sträng som kommer in i RISC-komplexet. Funktionerna för * miRNAs fortfarande oklara, men det är möjligt att de härrör från nedsatt bearbetning av pre-miRNA (Tchernitsa et al J of Pathology, 2010) eller kan spela en roll i att rikta mRNA-translation (Gu och Lu, Plos One, 2010 ).
Vi observerade också att medan 21 miRNAs påträffades gemensamt mellan GC och chemoresistance miRNA signaturer, 37 miRNA var unika för den chemosensitivity signatur.
Analys av provet paren pre- och post-behandling från 8 patienter som initialt svarat på CF behandlingen men senare blev resistenta mot behandling fungerade som en proof-of-princip för att visa att den prediktiva index för 58 miRNA signaturen skulle byta från en gynnsam index (vid förbehandlingsstadiet) till en ogynnsam index ( efterbehandling när motstånd utvecklas). Tyvärr var det inte möjligt att erhålla ytterligare matchade par av prover från motsvarande patienter för att tillhandahålla en mer robust statistisk analys. Icke desto mindre, de resultat överensstämmer med en modell av klonal selektion av pre-existerande resistenta tumörceller bosatta inom den primära tumören.
Enligt den konventionella klonurvalet modell för utveckling av förvärvad resistens mot kemoterapi beständighet, beständighet av initialt responsiva tumörer utvecklas på grund av den selektiva utväxten av kemoterapiresistenta kloner som redan finns inuti tumören [18]. Givet att en snabb TTP specifikt indikerar en inneboende resistens mot kemoterapi [19], de 58 miRNA vars uttryck nivåer är korrelerade med en kort TTP kan representera chemoresistance relaterade miRNA som redan finns i de flesta av tumörcellerna i den primära tumören. Men primära tumörer som inte verkar uttrycka detta miRNA underskrift motstånd inledningsvis svara på behandlingen tills redan existerande, resistenta celler selektivt växa trots CF terapi. Vid den tidpunkt ett prov erhålls när resistens observeras, huvuddelen av tumören uttrycker det ogynnsamma, kemoterapiresistent miRNA signatur. Med tanke på att resistens i de flesta av dessa patienter utvecklar över en relativt kort tidsperiod (månader, inte år), verkar det osannolikt att beständighetsresultaten från ansamling av flera enskilda genetiska förändringar.
Resultaten av denna studie ger viktiga nya data och miRNA signaturer, särskilt förutsäga svar på CF terapi och om uppkomsten av tumörresistens. Men större studier måste genomföras i framtiden för att ytterligare validera dessa fynd och avgöra om de kan användas i en klinisk miljö.
Slutsatser
Även begränsas av små provmängder av valideringsuppsättning, denna studie identifierar miRNA som kan innefatta en kliniskt relevant signatur för inre motstånd av magcancer till CF och föreslår att dessa miRNA valdes ut för under utvecklingen av förvärvad chemoresistance. Eftersom detta miRNA prediktor kan möjligen ge en användbar guide till personlig kemoterapi i framtiden, motiverar det ytterligare utredning och validering i stora prospektiva studier.
Metoder
Patientrekryteringen och behandling
Vävnadsprover togs på sjukhuset av Korean National Cancer Center med endoskopi 2001-2006 enligt ett protokoll som godkänts av Institutional Review Board (IRB) av National Cancer Center Hospital i Goyang, Korea. Alla patienter och frivilliga undertecknade IRK-godkända informerat samtycke former. Behörighet för inskrivning i studien omfattade följande parametrar: 1) ålder ≥ 18 år; 2) bekräftades histologiskt magcancer; 3) dokumenterade fjärrmetastaser; 4) inga andra än magcancer tidigare eller samtidig maligniteter; 5) ingen tidigare kemoterapi, antingen adjuvans eller palliativ; och 6) lämplig funktion av alla större organ. 34 friska försökspersoner genomgick gastroskopi för rutinmässig screening för magcancer och hade normal magslemhinna av histologi. Det fanns ingen gastrit bland de 34 friska frivilliga försökspersoner.
Denna miRNA studie har utförts som en parallell studie med en studie av mRNA expressionsanalys [20] som syftar till att identifiera mRNA prediktorer för chemoresistance. Nittio förbehandlingsbiopsiprover som samlats in 2001-2006 analyserades i denna miRNA studie. Efter en initial endoskopisk biopsi, alla av de 90 patienter behandlades med cisplatin (60 mg /m 2, D1) i kombination med antingen fluorouracil (1 g /m 2 för 5 dagar, n = 88) eller capecitabin (Xeloda, Roche, 1250 mg /m 2 gånger dagligen under 2 veckor, n = 2) var 3 veckor. Kliniska responders ombads att genomgå andra endoskopi vid tidpunkten progressiv sjukdom (PD) observerades enligt Världshälsoorganisationen (WHO) kriterier. Följande två kriterier används för att definiera kliniska responders: 1) patienter vars tumörer visade mer än en 50% minskning av summan av produkterna av de två största vinkelräta diametrarna av mätbara lesioner under minst 4 veckor; eller 2) patienter som inte har mätbar sjukdom vid presentation och hade en dramatisk minskning av pleurautgjutning /ascites under minst 4 veckor [21]. Efterbehandling miRNA microarray data kan erhållas från prover som tagits när chemoresistance utvecklats (PD) i 8 kliniska responders. Efter behandling Prover uppsamlades i minst 2 veckor efter den sista dosen av fluorouracil, och före den andra linjens behandling påbörjades, i syfte att undvika eventuella akuta läkemedelseffekter om påverkan uttrycksprofilen. För dessa 8 kliniska responders, före och efter behandling prover (som samlades in i samband med progressiv sjukdom) representerar kemosensitivt och kemoterapiresistent tumörer, respektive. Förbehandlings prover från de återstående 82 patienter användes för att identifiera en miRNA prediktor för kemoterapi svar. Denna prediktor applicerades på 8 provpar som samlats in från samma patienter före och efter behandling. Förutsägelsen ansågs korrekt om efterbehandlingsprover tilldelas en högre prediktiv index för chemoresistance än de förbehandlings prover. Biopsiprov framställdes på liknande samlas in från 34 friska frivilliga.
Vävnadsprover som innehåller minst 50% av tumörcellerna bearbetades för RNA såsom beskrivits tidigare [22]. De extraherade RNA analyserades med användning av Agilent Bioanalyzer 6000 Total RNA-analys och Nanodrop spektrofotometer i enlighet med tillverkarens protokoll. 500 ng av totalt RNA utsattes för en anpassad miRNA microarray. En blandning av totalt RNA isolerat från tre gastriska cancercellinjer (SNU-601, SNU-638, och AGS) användes som referens RNA för konkurrenskraftig hybridisering.
Microarray experiment
miRNA microarray utformning
Laboratory (.: ac uk //mikroRNA sanger http..) och tillverkas som en anpassad syntetiserade 8 × 15 K microarrays (Agilent Technologies, för molekylär Technology (LMT) _miRNA_v2 microarray designades med hjälp av Sånger miR9.0 databasen San Jose, CA). Det finns totalt 4,361 miRNA poster i miR9.0 databasen. Några av miRNA har exakta sekvenser från olika arter. Vi kollapsade databasen till 1,667 unika mogna miRNA sekvenser i alla arter, inklusive människa, mus, råtta, etc. De mogna miRNA sekvenser inkorporerades i 60-mer långa oligonukleotidprober med en linkersekvens på 3'-änden för att separera de miRNA sekvenser bort från glasobjektglasets yta. Linkersekvensen var en egen sekvens från Agilent som har minimal homologi med någon sekvens i GenBank. Varje mogna miRNA representeras av + och - (omvända komplementet) strängsekvenserna. Detta gör det möjligt för mikromatris för att användas med olika märkningsprotokoll. Beroende på protokoll, en av proberna kan också tjäna som en negativ kontroll. Varje sond har 4 replikat inom varje microarray, vilket ger tekniska replikat för att mäta konsekvens och prestanda microarray. Sammanfattningsvis är varje unik mogna miRNA representeras av 8 sonder (4 + sträng och 4 - sträng). Totalt 3,556 unika LMT seq id (miRNA, positiva och negativa kontroller, +/- strand) var på microarray, var och en med 4 replikat. http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070

• En blandad population av Helicobacter pylori, Helicobacter bizzozeronii och "Helicobacter heilmannii" i magslemhinnan av en inhemsk cat
• Experimentell modell av mild diabetes: långsiktig utvärdering av den glykemiska profil och gastric kontraktilitet i rats