miRNA allekirjoitus liittyy tuloksiin mahalaukun syöpäpotilailla chemotherapy

miRNA allekirjoitus liittyy tuloksiin mahasyöpäpotilaista kemoterapian jälkeen
tiivistelmä
tausta
tunnistaminen potilaiden todennäköisesti vai eivät hyödy solunsalpaajahoidosta avulla biomarkkerit voidaan parantaa huomattavasti kliinisen hoidon määrittelemällä paremmin hoitovaihtoehtoja potilaille. MikroRNA voi olla hyötyä biomarkkerit, jotka auttavat ohjaamaan yksilöllistä hoitoa syöpään, koska microRNA ilmaisua väärin säädellystä syövässä. Jotta tiedettäisiin miRNA allekirjoituksia mahasyövän ja ennustamiseksi kliinisen vastustuskyvyn sisplatiini /fluorourasiili (CF) kemoterapia, kattavan miRNA microarray analyysi suoritettiin käyttäen Endoskooppinen biopsianäytteissä. Tool Menetelmät
Biopsia näytteet kerättiin ennen kemoterapiaa alkaen 90 mahasyövän hoidetuilla potilailla CF ja 34 tervettä vapaaehtoista. Tuolloin taudin etenemiseen, jälkikäsittely näytteet lisäksi kerättiin 8 kliinisen vasteen. miRNA ilmentyminen määritettiin käyttäen mittatilaustyönä Agilent mikrosirun. Jotta tunnistaa miRNA allekirjoituksen kemoterapiaan vastus, me korreloi miRNA ekspressiotasoja kanssa aika taudin etenemiseen (TTP) taudin jälkeen CF-hoidon.
Tulokset
miRNA allekirjoitus erottaa mahasyövän normaaleista mahalaukun epiteelin tunnistettiin. 30 miRNA merkittävästi korreloi käänteisesti TTP taas 28 miRNA merkittävästi korreloi positiivisesti TTP 82 syöpäpotilailla (P
< 0,05). Näkyvästi joukossa voimistunut miRNA liittyy kemosensitiivisyys olivat miRNA tiedetään säätelevän apoptoosia, mukaan lukien anna-7 g, miR-342, miR-16, miR-181, miR-1, ja miR-34. Kun tämä 58-miRNA ennustaja levitettiin erilliset esi- ja jälkikäsittelyn kasvain näytteet 8 kliinisen vasteen, kaikki 8 esikäsittelyn näytteet ennusti oikein vähäriskisinä, kun taas näytteitä jälkikäsittely kasvaimia että kehitetty chemoresistance ennustettiin olevan korkean riskin luokkaan kuuluvista 58 miRNA allekirjoitus, mikä viittaa siihen, että valinta ilmentämiseen näiden miRNA tapahtui chemoresistance syntyi.
Johtopäätökset
Olemme tunnistaneet 1) miRNA ilmaus allekirjoitus joka erottaa mahasyövän normaaleista vatsan epiteelissä terveillä vapaaehtoisilla, ja 2) chemoreresistance miRNA ilmaus allekirjoituksen, joka korreloi TTP jälkeen CF-hoidon. Chemoresistance miRNA ilmaus allekirjoitus sisältää useita miRNA aiemmin osoitettu säätelevän apoptoosia in vitro
, ja optio lisävalidointia.
Taustaa
miRNA ovat lyhyitä (~ 22 nukleotidin), ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geeniekspressiota pääasiassa translaation tukahduttaminen tai transkription hajoaminen [1]. miRNA on suuri potentiaali syövän biomarkkereita koska niiden kudoksen ilmentymistä ja niiden poikkeavaa ilmentymistä syöpäsoluissa [2]. Lisäksi miRNA ovat tärkeitä tehtäviä solukierron säätelyssä ja apoptoosin. Ilmentyminen miRNA voidaan väärin säädellystä in syöpää erilaisia ​​mekanismeja kuten transkription säätelyyn, vahvistus, poisto, mutaatio, ja epigeneettiset hiljentäminen [3]. Siten MikroRNA voi olla hyötyä biomarkkerit, jotka auttavat ohjaamaan yksilöllisen hoidon.
Tunnistaminen potilailla, jotka todennäköisesti vai eivät hyödy solunsalpaajahoidosta avulla biomarkkerit voidaan parantaa huomattavasti kliinisen hoidon määrittelemällä paremmin hoitovaihtoehtoja potilaille. Useimmat aiemmat tutkimukset pyrkimällä tunnistamaan miRNA ennustavia chemoresistance syövän pitänyt tutkia vain yksittäisiä miRNA [4]. Tähän mennessä vain yksi julkaistu suurikapasiteettisten mikrosiruanalyysi on arvioinut miRNA ilmaisu allekirjoitusta ennustajina kemoterapian resistenssin Metastasoitunutta kiinteä kasvain potilailla [5]. Tässä miRNA microarray tutkimuksen vaiheen III-IV munasarjasyöpiä, anna-7i ilmentyminen havaittiin vähentää huomattavasti 27 kemoterapiaa resistenttien potilaiden verrattuna 42 Täydellisen vasteen, vaikka ei ollut itsenäinen validointi kohortti [5].
tässä esittelemme tulokset prospektiivinen tutkimus, jossa käytettiin suurikapasiteettisten miRNA mikrosiruanalyysi jossa miRNA ilmaus allekirjoitus on tunnistettu, joka erottaa mahasyövän normaalista vatsaan epiteelissä. Edelleen olemme tunnistaneet toisen allekirjoituksen, joka korreloi aika taudin etenemiseen (TTP) mahasyövän potilaiden sisplatiinia ja fluorourasiilin (CF), viittaus kemoterapiakäytäntö mahasyövän. Nämä miRNA allekirjoitukset voivat olla käyttökelpoisia mahdollisina biomarkkereita auttaa diagnosoinnissa mahasyövän vaikeissa tapauksissa ja ennustaa vastetta mahasyöpäpotilaista CF hoitoa.
Tulokset
tunnistaminen mahasyövän miRNA allekirjoitus
Ninety esikäsittely mahasyövän kudosnäytteet saatavilla tämän analyysin ja niiden kliinis ominaisuudet on kuvattu taulukossa 1. Kaikki potilaat olivat etäpesäkkeitä aikaan ilmoittautuminen ja jälkeen endoskooppinen biopsiakudoksesta kerättiin, potilaita hoidettiin sisplatiinin ja fluorourasiilin (tai kapesitabiini ) yhdistelmä kemoterapiaa. Kaikki microarray data on talletettu GEO ja on saatavana julkaisu. Arvioija pääsy: http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070Table 1 kliinis-patologinen ominaisuudet potilaiden

Mahasyöpää potilas
Healthy vapaaehtoinen

Training
asettaa
Proof-of-periaatteen
testijärjestelyä
(vastaaja)

Number
82
8
34
Age - v
mediaani
56
56
48
kvartiiliväli
(44-63) B (44-58) B ( 43-57)
Sex - no. (%) B Mies
64 (78,0%) B 7 (87,5%)
23 (67,6%) B Nainen
18 (22,0%)
1 (12,5% )
11 (32,4%) B Suorituskyky (PS) - no. (%) B ECOG1 PS 0 tai 1
73 (89,0%) B 8 (100%) B ECOG 2 tai 3
9 (11,0%)
0
Histologinen tyyppi - no. (%) B Laurenin suoliston
34 (41,5%) B 3 (37,5%) B Laurenin hajanainen
48 (58,5%) B 5 (62,5%) B sijainti primäärivamma - no. (%) B Ylempi 1/3
11 (13,4%)
1 (12,5%) B Lähi 1/3
18 (22,0%) B 5 (62,5%)
Ala 1/3
43 (52,4%) B 1 (12,5%) B Koko vatsan
10 (12,2%) B 1 (12,5%) B kemoterapiahoidon - no . (%) B Sisplatiini /Fluorouracil
80 (97,6%) B 8 (100%) B Sisplatiini /Capecitabine
2 (2,4%) B 0
* Suhteellinen annosintensiteetti -%
mediaani
81,2
76,6
kvartiiliväli
(75,3-87,3) B (64,7-84,9) B lukumäärä kemoterapiaa jaksoa
mediaani
4
10
kvartiiliväli
(2-5) B (7-11) B Kemoterapia vasteen (WHO: n kriteerien) -ei (%) B PR2
16 (24,6% )
6 (100%) B SD3
25 (38,5%) B PD4
24 (36,9%) B mitattavissa
16
2
Unevaluable
1
toisen linjan kemoterapia
55 (67,1%)
6 (75,0%) B seuranta-ajan mediaani eloonjääneitä
35,5 kuukautta -
Kokonaiselossaoloaika - mo.
mediaani
8.2
16
kvartiiliväli
(6,8-10,5) B (11,3-26,7) B Aika taudin etenemiseen - mo.
mediaani
3,1
8.2
kvartiiliväli
(2,5-3,9) B (4,3-21,2) B 1Eastern Cooperative Oncology Group, 2partial vastaus, 3stable sairaus, 4progressive tauti
* suhteellinen annosintensiteetti
* tarkoittaa suhteellisen annoksen intensiteetin sisplatiinin ja fluorourasiilin. Annoksen intensiteetti määritellään annetun lääkkeen määrään aikayksikköä kohden, ilmaistuna milligrammoina per neliömetri per viikko. Suhteellinen annoksen intensiteetti määritellään todellinen annos intensiteetti suhteessa suunniteltuun annoksen vahvuus kunkin lääkkeen.
Ensin verrattuna miRNA profiilit 90 esikäsittelystä näytteestä saatujen mahalaukun syöpäpotilaiden miRNA ilmentymisen tiedot 34 normaalin mahan limakalvon koepalojen saatu terveiltä vapaaehtoisilta (kuvio 1). Arvioida ennusteita syöpää erityisiä miRNA profiilien luokan ennuste analyysit suorittaa myös satunnaisesti jakamalla koko näyte jaetaan kahteen (koulutus ja testi) osajoukot 1-to-1-suhteessa. Satunnaistaminen tehtiin käyttämällä nQuery asiantuntija ohjelmistoa (versio 7.0, Statistical Solutions, Saugus, MA). Silloin luokka etiketti kunkin näytteen Koepakettia ennustettiin kullekin 100 satunnaisesti koulutuksen testata väliseinien mukaan yhdiste kovariaattina ennustaja (CCP), diagonaalinen lineaarinen erotteluanalyysi (LDA), 1- ja 3-naapurit (NN), lähin Centroid (NC), ja tukivektorikone (SVM). Tällä ominaisuuksien hallintaan P
< 0,05, mediaani ennuste tarkkuus testi sarjaa oli > 90% kaikissa luokittelijoiden (91,9%, 90,3%, 90,3%, 93,5%, 93,5%, ja 91,9%, CCP, LDA, 1-NN, 3-NN, NC, ja SVM, vastaavasti), 100 random koulutus-to-testi osioita. Kuva 1 Tutkimus järjestelmä tunnistaa ja testata miRNA ennustavan vastustuskyvyn CF
Taulukossa 2 miRNA että ilmentyvät eri välillä 90 mahasyövän kasvaimia ja 34 normaali näytteet ominaisuus valikoima P
< 0,005. Monet miRNA, jotka yliekspressoituvat mahasyövän ryhmän kuuluvat miR-17-92 ja 106b-25 klustereita, kuten aiemmin on raportoitu [6, 7]. Kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR (Q-RT-PCR) analyysit vahvistivat ero kuvaamaan joitakin näistä miRNA mahasyövän näytteistä (kuvio 2). Vaikka miR-25 oli merkitsevästi ajan säädellään erilaisia ​​analyysi kasvaimissa, tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä Q-PCR, ehkäpä johtuen rajallinen määrä näytteitä, jotka olivat käytettävissä määritystä. Vaikka edellinen tutkimus kertoo, että miR-486 on vaimentua mahasyövän, löysimme ilmentyminen miR-486 olevan koholla myös joukko mahasyöpäpotilaista sekä microarray ja Q-PCR (Additional tiedosto 1: Kuva S1) .table 2 miRNA differentiaalisesti ilmaistut mahasyövän ja normaalin vatsan epiteelin.
yli-ilmennetään mahasyövässä
s
FDR
suhde
HSA-miR-25
< 1e-07
< 1e-07
1.64
HSA-miR-106b
< 1e-07
< 1e-07
1.85
HSA-miR-93
< 1e-07
< 1e-07
1.49
HSA-miR-503
< 1e-07
< 1e-07
2.17
HSA-miR-18a
< 1e-07
< 1e-07
2.27
hsa-miR-224
1.00E-07
2.59E-06
3.85
hsa-miR-451
1.00E-07
2.59E-06
3.23
hsa-miR-18b
2.00E-07
4.60E-06
2.17
hsa-miR-17-5p
2.00E-06
3.60E-05
1.61
hsa-miR-486-5p
3.00E-06
5.18E-05
2.22
hsa-miR-144
9.60E-06
0.000159
5.56
hsa-miR-552
1.03E-05
0.000164
2.38
hsa-miR-425-5p
1.32E-05
0.000195
1.35
hsa-miR-92
1.88E-05
0.000268
1.39
hsa-miR-106a
2.61E-05
0.000347
1.52
hsa-miR-223
2.68E-05
0.000347
2.13
hsa-miR-205
2.98E-05
0.000363
4.76
hsa-miR-196b
4.42E-05
0.000508
1.67
hsa-miR-19a
0.0001836
0.00181
1.69
hsa-miR-191
0.0003112
0.0028
1.27
hsa-let-7i
0.0004468
0.00385
1.20
hsa-miR-185
0.0004764
0.00394
1.32
hsa-miR-769-5p
0.0006683
0.00532
1.37
hsa-miR-196a
0.0008274
0.00646
1.45
hsa-miR-301
0.0009715
0.00745
1.82
hsa-miR-21
0.0012598
0.00948
1.49
hsa-miR-130b
0.0015411
0.0112
1.30
hsa-miR-19b
0.0015959
0.0114
1.39
hsa-miR-424
0.0019249
0.0135
1.52
hsa-miR-484
0.0020451
0.0139
1.33
hsa-miR-767-5p
0.0048511
0.03
1.64
hsa-miR-183
0.0050428
0.0305
1.52
hsa-miR-210
0.0053848
0.0318
1.35
hsa-miR-302c*
0.006328
0.0364
1.41
hsa-miR-520g
0.0070896
0.0402
2.13
hsa-miR-324-5p
0.0095742
0.0497
1.23
hsa-miR-103
0.0095861
0.0497
1.16
hsa-miR-376b
0.0096083
0.0497
1.85
hsa-miR-151
0.0100422
0.0513
1.20
hsa-miR-596
0.011231
0.0556
1.61
hsa-miR-545
0.011422
0.0556
1.69
hsa-miR-221
0.0129139
0.0608
1.27
hsa-miR-20a
0.0133176
0.0619
1.35
hsa-miR-181b
0.0148487
0.0655
1.28
hsa-miR-181d
0.0154891
0.0668
1.16
hsa-miR-623
0.0189476
0.0809
1.43
hsa-miR-519d
0.0220958
0.0915
1.59
hsa-miR-563
0.0229302
0.094
1.37
hsa-miR-505
0.0241657
0.097
1.25
hsa-miR-107
0.0242694
0.097
1.11
hsa-miR-320
0.0282982
0.111
1.20
hsa-miR-96
0.0285699
0.111
1.39
hsa-miR-339
0.0312524
0.12
1.32
hsa-miR-181a
0.0318141
0.121
1.20
hsa-miR-345
0.0322275
0.121
1.19
hsa-miR-20b
0.0325811
0.122
1.28
hsa-miR-33b
0.0339343
0.125
1.64
hsa-miR-135b
0.0352682
0.129
1.59
hsa-miR-431
0.0374687
0.134
1.41
hsa-miR-193a
0.0377098
0.134
1.35
hsa-miR-550
0.0380645
0.134
1.30
hsa-miR-565
0.0446875
0.15
1.20
Ali-ilmentynyt mahasyövän
s
FDR
Ratio
HSA-miR-146a
< 1e-07
< 1e-07
0,39
HSA-miR-133a
< 1e-07
< 1e-07
0,34
HSA-miR-625
< 1e-07
< 1e-07
0.56
HSA-miR-375
< 1e-07
< 1e-07
0,27
HSA-miR-133b
< 1e-07
< 1e-07
0,32
HSA-miR-195
< 1e-07
< 1e-07
0.47
HSA-miR-148a
< 1e-07
< 1e-07
0.47
HSA-miR-1
< 1e-07
< 1e-07
0,27
HSA-miR-26a
< 1e-07
< 1e-07
0.67
hsa-miR-204
2.00E-07
4.60E-06
0.26
hsa-let-7c
7.00E-07
1.53E-05
0.74
hsa-let-7a
9.00E-07
1.86E-05
0.72
hsa-let-7g
1.10E-06
2.17E-05
0.71
hsa-miR-497
1.70E-06
3.20E-05
0.56
hsa-miR-26b
1.28E-05
0.000195
0.58
hsa-miR-145
2.04E-05
0.000282
0.65
hsa-miR-34a
2.89E-05
0.000363
0.75
hsa-miR-143
4.28E-05
0.000506
0.63
hsa-miR-650
9.15E-05
0.00101
0.57
hsa-miR-150
9.25E-05
0.00101
0.49
hsa-miR-768-5p
0.0001037
0.0011
0.65
hsa-let-7d
0.0001302
0.00132
0.76
hsa-miR-203
0.0001311
0.00132
0.52
hsa-miR-29c
0.0002112
0.00203
0.52
hsa-let-7f
0.0002446
0.0023
0.69
hsa-miR-30d
0.0002592
0.00238
0.78
hsa-miR-642
0.0004345
0.00383
0.62
hsa-miR-30c
0.0004556
0.00385
0.75
hsa-miR-155
0.0004998
0.00406
0.66
hsa-miR-34b
0.0013651
0.0101
0.64
hsa-miR-551b
0.0019808
0.0137
0.53
hsa-miR-28
0.0027537
0.0184
0.85
hsa-let-7e
0.0034793
0.0227
0.84
hsa-let-7b
0.0035019
0.0227
0.85
hsa-miR-212
0.0039061
0.0249
0.76
hsa-miR-564
0.0047906
0.03
0.72
hsa-miR-770-5p
0.0050814
0.0305
0.71
hsa-miR-30b
0.0060842
0.0355
0.76
hsa-miR-30a-5p
0.0077597
0.0434
0.80
hsa-miR-199b
0.0083572
0.0461
0.67
hsa-miR-125a
0.0085563
0.0466
0.77
hsa-miR-621
0.0093423
0.0497
0.69
hsa-miR-31
0.0106862
0.054
0.66
hsa-miR-365
0.0113404
0.0556
0.78
hsa-miR-381
0.0123061
0.0592
0.70
hsa-miR-626
0.0128738
0.0608
0.78
hsa-miR-127
0.0138033
0.0635
0.69
hsa-miR-660
0.0142991
0.0651
0.75
hsa-miR-342
0.0146193
0.0655
0.75
hsa-miR-146b
0.0148729
0.0655
0.77
hsa-miR-361
0.0152056
0.0663
0.86
hsa-miR-489
0.0191692
0.081
0.71
hsa-miR-29a
0.0204334
0.0854
0.79
hsa-miR-95
0.0243644
0.097
0.54
hsa-miR-567
0.0265025
0.104
0.54
hsa-miR-152
0.0376121
0.134
0.78
hsa-miR-429
0.0378151
0.134
0.65
hsa-miR-200b
0.0396617
0.138
0.75
hsa-miR-504
0.0412648
0.142
0.63
hsa-miR-668
0.041717
0.143
0.77
hsa-miR-186
0.0437991
0.149
0.83
hsa-miR-135a
0.0468793
0.157
0.58
hsa-miR-485-5p
0.047683
0.158
0.82
Kuvio 2 validointi miR ilmentymisen kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR (Q-RT-PCR). Q-RT-PCR-analyysit miR-18a, miR-25, miR-1, ja anna-7 g 4 normaalissa (esitetty valkoisena
) ja 4 syöpänäytteissä (näytetään mustana
), mikä vahvistaa yli- ilmentyminen miR-18a ja miR-25 ja alle-ilmentymisen miR-1 ja anna-7g kuten havaitaan microarray data syöpä näytteitä. Student t-testi P
arvo välillä 4 normaali ja 4 syöpänäytteissä esitetään kunkin miRNA. Kertainen muutos (FC) -1 osoittaa 50% lasku RNU6-normalisoitu ilmentymistä tietyn miRNA.
Tunnistaminen miRNA allekirjoituksen resistenssiä CF hoidon
Aika taudin etenemiseen (TTP), ei Radiologinen vaste, käytettiin kliininen merkki kemoterapiaa vastausta, ensisijaisesti siksi halusimme sisällyttää potilaat, joilla ei ole mitattavissa taudin tavallisilla kuvantamismodaliteeteilla. Voit määrittää alkaen 82 otoksia kuin koulutus asetettu kehittää ennustaja (kuvio 1). Nämä 82 esikäsittely kerättiin potilailta, joille ei suoritettu toisen koepaloja. Viisikymmentäkahdeksan miRNA merkittävästi korreloi TTP näistä 82 potilasta (ominaisuuksien hallintaan P
arvo < 0,05) (taulukko 3). Yli-ilmentyminen 30 miRNA oli liittyy hidastunutta TTP taas yli-ilmentyminen 28 miRNA liittyi nopeampaa TTP. Kuusi * miRNA jotka liittyivät chemoresistance, kuten miR-518f *, miR-520a, miR-520d *, miR-519e *, miR-363 *, ja miR-517 *, kun taas mitään * miRNA liittyi chemosensitivity.Table 3 miRNA, jonka ilmentyminen liittyy kemo- tai chemoresistance.
miRNAa, jonka ilmentyminen liittyy chemoresistance
s
FDR

Hazard Ratio

hsa-miR-526a
0.0000
0.0103
1.482
hsa-miR-122a
0.0002
0.0379
1.545
hsa-miR-518f*
0.0004
0.0537
1.298
hsa-miR-591
0.0007
0.0598
1.492
hsa-miR-524-3p
0.0010
0.0682
1.268
hsa-miR-320
0.0013
0.0701
1.865
hsa-miR-520a*
0.0014
0.0701
1.252
hsa-miR-183
0.0031
0.119
1.39
hsa-miR-516-5p
0.0034
0.119
1.306
hsa-miR-629
0.0036
0.119
1.42
hsa-miR-595
0.0043
0.119
1.858
hsa-miR-640
0.0054
0.132
1.3
hsa-miR-520d*
0.0063
0.143
1.326
hsa-miR-519e*
0.0091
0.164
1.24
hsa-miR-363*
0.0096
0.166
1.407
hsa-miR-513
0.0137
0.193
1.347
hsa-miR-328
0.0163
0.211
1.736
hsa-miR-519a
0.0170
0.211
1.118
hsa-miR-185
0.0189
0.217
1.697
hsa-miR-658
0.0200
0.223
1.532
hsa-miR-517*
0.0218
0.226
1.305
hsa-miR-515-5p
0.0349
0.301
1.145
hsa-miR-519c-5p
0.0368
0.304
1.157
hsa-miR-661
0.0392
0.315
1.437
hsa-miR-182
0.0416
0.315
1.408
hsa-miR-206
0.0417
0.315
1.606
hsa-miR-193b
0.0419
0.315
1.433
hsa-miR-601
0.0436
0.317
1.599
miRNA, jonka ilmentyminen liittyy kemosensitiivisyys
p
FDR
riskisuhde
hsa-miR-195
0.0007
0.0598
0.593
hsa-miR-146b
0.0016
0.0733
0.565
hsa-miR-26b
0.0037
0.119
0.686
hsa-miR-374
0.0042
0.119
0.84
hsa-miR-199b
0.0051
0.132
0.729
hsa-miR-132
0.0068
0.143
0.62
hsa-miR-140
0.0069
0.143
0.759
hsa-miR-487b
0.0088
0.164
0.679
hsa-let-7g
0.0091
0.164
0.539
hsa-miR-340
0.0103
0.171
0.82
hsa-miR-155
0.0109
0.174
0.704
hsa-miR-95
0.0115
0.176
0.856
hsa-miR-186
0.0137
0.193
0.662
hsa-miR-130a
0.0140
0.193
0.72
hsa-miR-342
0.0151
0.202
0.685
hsa-miR-577
0.0173
0.211
0.804
hsa-miR-128b
0.0184
0.217
0.701
hsa-miR-146a
0.0209
0.226
0.776
hsa-miR-16
0.0214
0.226
0.698
hsa-miR-503
0.0241
0.243
0.721
hsa-miR-224
0.0259
0.25
0.853
hsa-miR-223
0.0259
0.25
0.794
hsa-miR-128a
0.0294
0.276
0.704
hsa-miR-181b
0.0300
0.276
0.668
hsa-let-7f
0.0312
0.281
0.725
hsa-miR-1
0.0339
0.298
0.839
hsa-miR-421
0.0367
0.304
0.738
hsa-miR-127
0.0404
0.315
0.783
hsa-miR-34c
0.0435
0.317
0.74
hsa-miR-497
0.0493
0.351
0.769
Kuvio 3 esittää Kaplan-Meierin käyrä riskiryhmille ositettu nämä 58 miRNA. Permutaatio merkitsevyystaso log-rank tilastotieto loman-one-out rajat validoitu Kaplan-Meier -käyrät oli 0,021, mikä viittaa siihen, että yhdistyksen välillä miRNA ilme datan TTP on tilastollisesti merkitsevä. Kuva 3 Kaplan-Meier -käyrät aika taudin etenemiseen (TTP) 2 riskiryhmien ryhmiteltynä ilmentymistä 58 miRNA korreloivat TTP on ominaisuus valikoima P < 0,05. Yhdistys miRNA ilmaisun tietojen TTP oli tilastollisesti merkitsevä (permutaatio P
vastinetta log-rank tilastojen rajat validoitu Kaplan-Meier -käyrät = 0,021).
Ilmentäminen chemoresistance allekirjoituksen korreloi kehittymistä chemoresistance vuonna kasvaimia, jotka olivat aiemmin chemosensitive
58 miRNA allekirjoitus tunnistettu edellä on ennustava tunnistamiseksi potilailla, jotka ovat tai eivät ole todennäköisesti vastaamaan myönteisesti CF hoitoa. Me olettaisi, että potilailla, jotka aluksi osoittaneet myönteisen 58 miRNA ilmaus allekirjoitus vaihtaisivatko epäedulliseen ilmaus allekirjoitus tuolloin he kehittivät vastustuskykyä CF hoitoa. Jotta testata tätä mahdollisuutta kuin proof-of-periaate, 8 paria testipakkauksesta näytteistä (endoskooppisesti saatu esi- ja jälkikäsittely) kerättiin 8 potilailla, jotka aluksi osoittivat kliinistä vastetta CF hoitoa, mutta kuka lopulta osoitti etenevä sairaus jolloin toinen endoskooppinen biopsia otettiin. Kuten taulukosta 4 kaikissa 8 esikäsittelyn näytteet kliinisen vasteen oli oikein ennusti 58-miRNA ennustaja olevan matalan riskin ryhmään (tarkkuus, 100%). Erityisesti 6 ulos 8 paria tunnistettiin oikein varten kemosensitiivisyys (ts
., Jälkikäsittely näytteet jaettiin korkeampi ennakoivan indeksin kemoterapiaa vastausta kuin esikäsittely näytteitä, ja siksi ennustettu olevan resistenttejä) (tarkkuus, 75% ). Kun sama ennustus suoritettiin käyttäen ominaisuuksien hallintaan P
arvo 0,01, ennuste tulos säilyi samana (taulukko 4) .table 4 Prediction varten chemoresistance on proof-of-periaatteen testipakkauksesta
Sample ID
Ominaisuus valinta P < 0.05


Ominaisuus valinta P < 0,01


Predictive
Index
Percentile1

Prediction
For
Pretreatment
Sample2

Overall
Prediction3


Predictive
Index
Percentile

Prediction
for
Pretreatment
Sample

Overall
Prediction

1 pre
39%
alhainen
virheellinen
35%
alhainen
virheellinen
1 viesti
22%
24%
2 pre
48%
alhainen
korjata
49%
alhainen
oikea
2 post
79%
77%
3 pre
55%
alhainen
korjata
46%
alhainen
oikea
3 post
73%
77%
4 pre
13%
alhainen
oikea
24%
alhainen
oikea
4 post
72%
73%
5 pre
31%
alhainen
oikea
33%
alhainen
oikea
5 post
48%
46%
6 ennalta
13%
alhainen
korjata
27%
alhainen
oikea
6 post
16%
66%
7 pre
7%
alhainen
korjata
12%
alhainen
oikea
7 post
66%
57%
8 pre
52%
alhainen
virheellinen
50%
alhainen
virheellinen
8 post
17%
24%
1The ennustavaa indeksi laskettiin kunkin näytteen tässä valvotaan pääkomponentti menetelmä, jossa suuri arvo ennakoivan indeksin vastaa nopean etenemisen jälkeen kemoterapian (eli
., lyhyt TTP). Jos ennakoiva indeksi näytteen koepaketin vastasi mediaani ennustavan indeksi training set näyte annettiin 50% ennustava indeksi.
2Eläintestauksissa riski oli ennustettu alhainen, jos ennakoiva indeksi prosenttipiste esikäsittely- näyte oli alle 67%
3Ilmaisimen ennustus pidettiin oikein jos jälkikäsittelyä näytteet jaettiin korkeampi ennakoiva indeksi kuin esikäsittelyä näytteitä.
Keskustelua
tutkimus on käyttänyt mahdolliselle lähestymistapa tunnistaa miRNA allekirjoituksen mahalaukun syöpä vs. normaali vatsan epiteelin ja miRNA allekirjoitus, joka ennustaa vaste standardin CF hoitoa.
Koska rutiini histopatologia tekniikat eivät aina johda lopullisen diagnoosin mahalaukun syövän, lisäämällä miRNA allekirjoituksen tällaisesta potilaan näytteitä voidaan parantaa tarkkuus diagnoosi mahasyöpä. Aiemmissa miRNA microarray tutkimuksia mahasyöpä, kontrollisilkkipaperia saatiin alueiden mahalaukun mahasyövistä potilasta, jotka olivat päättäneet olla histologisesti normaalia eikä vatsaan kudoksesta terveiden terveillä vapaaehtoisilla [6, 7]. Koska molekyyli- poikkeavuuksia löytyy usein histologisesti normaalin esiintyvät kudoksen vieressä kasvainkudoksen, päätimme hankkia ohjaus kudoksia endoskooppinen biopsianäytteissä normaalista, syöpää vapaa vapaaehtoisia. Useimmat differentiaalisesti ilmaisi miRNA raportoitu olevan ominaisia ​​mahasyövän aiemmissa microarray tutkimuksissa [6, 7] havaittiin myös sisällä mahasyövän allekirjoituksen nykyisen analyyseissä. Kuitenkin näiden lisäksi aiemmin raportoitu miRNA mahasyövän, me lisäksi havainnut mahdollisia tuumorisuppressorigeeni miRNA (P
< 0,05 [6] ja P
< 0,01 [7], mukaan lukien miR-1 [8 , 9] ja anna-7 [10], että löysimme olla ali-ilmentynyt mahasyövän (P
< 0,001) (taulukko 2). Mielenkiintoista, Oh et ai havaittu ilmentyminen miR-486 voidaan pienentää monin syöpien, joissakin tapauksissa liittyy genomisen menetystä kyseisellä alueella [11]. Löysimme miR-486 yliekspressoituvan meidän mahasyövässä kohortin sekä mikrosirujen ja Taqman PCR-analyysi (Additional tiedosto 1: Kuva S1). on mahdollista, että tämä ero tulosten johtuu hyvin erilainen potilasaineistossa.
tässä tutkimuksessa raportoimme ensimmäistä kertaa tietojemme, joka on miRNA ennustaja vastausta CF hoitoa. 58 miRNA allekirjoitus, joka tarjoaa indeksi arvioitaessa mahdollisia vaste CF terapia voi olla hyötyä kerrostamiselintä potilailla ryhmään, joka tulisi saada tavanomaista hoitoa ja ryhmä, joka ei todennäköisesti hyötyvät tällaisesta hoidosta ja tulisi sijoittaa eri terapeuttiseen oikeudenkäyntiä. Useat 58 miRNA tunnistimme taulukossa 2, jotka liittyvät TTP ovat yhdenmukaisia ​​julkaistuissa raporteissa, jotka liittyvät niiden ilmentymisen chemoresistance ja kasvaimen biologiaan. Näkyvästi joukossa ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA liittyy pitkittynyt TTP (määritelty vaaroja suhde < 1) olivat miRNA, jotka on osoitettu aiheuttavan apoptoosia mahalaukun ja muiden syöpäsolujen, kuten miR-16, anna-7 g, miR-181, miR-342, miR-1, ja miR-34 [8, 12-18]. miR-16 täydentää apoptoosin induktion nutlin ja genisteiiniä [12], ja moduloi monilääkeresistenssin ihmisen mahalaukun syövän soluihin [13].
yliekspressio let-7c tai anna-7g on osoitettu vähentävän Bcl-xL: in Huh7 ja HepG2 solulinjat [14]. Anna-7g ja miR-181 b korreloivat positiivisesti kliinisen reagointikykyä paksusuolensyöpä S-1, suullinen fluorourasiilin [4]. miR-181a ja miR-181B on osoitettu toimivan tuumorisuppressoreilla jotka laukaisevat kasvun estäminen, apoptoosin ja estävät hyökkäyksen glioomasoluihin [15]. Ennastus HSA-miR-342 on peräsuolen syövän solulinjaa HT-29 indusoi apoptoosin [16]. miR-1 herkistää keuhkosyövän soluja doksorubisiini indusoiman apoptoosin [8]. Kohdunulkoinen miR-34 ilmentyminen aiheuttaa apoptoosia, solusyklin pidätyksen tai vanhenemista normaaleissa ja tuumorisoluissa [17]. Näin ollen, yli-ilmentyminen näiden pro-apoptoottisen miRNA in primaaristen kasvainten näyttää olevan erittäin tasainen osa potilaista, jotka hyötyvät CF.
Mielenkiintoista on, olemme määritelleet kuusi * miRNA jotka liittyvät chemoresistance, mukaan lukien miR-518f *, asennuspalveli- 520a, miR-520d *, miR-519e *, miR-363 *, ja miR-517 *, kun taas mitään miRNA liittyi kemosensitiivisyys. Vain yksi miR, miR-302 *, yksilöitiin mahasyövän miR allekirjoitus. miR * s katsotaan matkustajien säikeitä, joiden ajatellaan yleensä hajota pre-miR joka johtaa kypsän 22 nt lohkon, joka tulee RISC monimutkainen. Toiminnot * miRNA jäädä epäselväksi, vaikka on mahdollista, että ne johtuvat heikentynyt käsittelystä ennalta miRNA (Tchernitsa et al J of Pathology, 2010) tai se voi olla tärkeä rooli kohdistaminen mRNA käännös (Gu ja Lu, Plos One, 2010 ).
Havaitsimme myös, että vaikka 21 miRNA löydettiin yhteinen välillä GC ja chemoresistance miRNA allekirjoitukset, 37 miRNA oli ainutlaatuinen kemosensitiivisyys allekirjoitusta.
näytteen analysointi parien esi- ja jälkikäsittely 8 potilaiden joka aiemmin vastanneet CF hoitoon, mutta myöhemmin tuli resistenttejä toimi proof-of-periaatteen osoittamiseksi, että ennustava indeksi 58 miRNA allekirjoituksen siirtäisivät suotuisa indeksin (at esikäsittely- vaihe) epäsuotuisasta indeksi ( jälkikäsittely kun vastus kehitetty). Valitettavasti, ei ollut mahdollista saada lisää pareittain otettujen näytteiden samanlainen potilaiden välillä vankempi tilastollista analyysiä. Kuitenkin tulokset ovat yhdenmukaisia ​​malli kloonivalintamenetelmää Aiempien resistenttejä kasvaimia solujen oleskeleville primaarikasvaimen.
Tavanomaisen kloonivalintamenetelmää mallin kehittämiseen kehittynyt resistenssi kemoterapiaa vastus, vastus aluksi reagoivat kasvainten kehittyy johtuen selektiivisen seuraus solunsalpaajaresistentti klooneja, jotka ovat jo olemassa tuumorin sisällä [18]. Kun otetaan huomioon, että nopea TTP erityisesti osoittaa luontainen resistenssi kemoterapiaa [19], 58 miRNA, joiden ekspressiotasoja korreloivat lyhyt TTP voi edustaa chemoresistance liittyvät miRNA jo läsnä suurin osa kasvainsolujen primaarikasvaimen. Kuitenkin ensisijainen kasvaimia, jotka eivät vaikuta ilmaista tätä miRNA allekirjoitus vastarinnan aluksi vastata hoito, kunnes ennestään, resistenttien solujen selektiivisesti kasvaa huolimatta CF hoito. Tuolloin näyte saadaan, kun vastus havaitaan, suurin osa kasvain ilmentää epäsuotuisa, solunsalpaajaresistentti miRNA allekirjoitus. Koska vastus useimmilla näistä potilaista kehittyy suhteellisen lyhyessä ajassa (kuukausia, jopa vuosia), on epätodennäköistä, että vastustus johtuu kertyminen useiden yksittäisten geneettisiä muutoksia.
Tämän tutkimuksen tulokset saada merkittävää uutta tietoa ja miRNA allekirjoitukset, erityisesti ennustamisessa vaste CF hoidon ja syntymisen kannalta kasvain vastarintaa. Kuitenkin suurempia tutkimuksia tarvitse tehdä tulevaisuudessa entisestään vahvistaa näitä havaintoja ja onko niitä voidaan soveltaa kliinisessä ympäristössä.
Johtopäätökset
Vaikka rajoittavat pieni otoskoko validointi asetettu, tämä tutkimus tunnistaa miRNA joka voi käsittää kliinisesti merkittävää allekirjoituksen luontainen resistenssi mahasyövän CF ja ehdottaa, että nämä miRNA valittiin kehittämisen aikana hankittujen chemoresistance. Koska tämä miRNA ennustaja voi mahdollisesti tarjota hyödyllinen opas henkilökohtaista kemoterapiaa tulevaisuudessa, se takaa lisätutkimuksia ja validointi suurissa tulevaisuudentutkimusta. Tool Menetelmät
Potilaan ilmoittautuminen ja hoito
Tissue kerättiin n sairaalassa Korean National Cancer Center endoskopialla 2001-2006 alle protokolla hyväksymä Institutional Review Board (IRB) National Cancer Center Hospital Goyang, Koreassa. Kaikki potilaat ja vapaaehtoiset allekirjoittivat IRB-hyväksytty tietoista suostumusta muotoja. Kelpoisuus tutkimukseen osallistumiseen mukana seuraavat parametrit: 1) ikä ≥ 18 vuotta; 2) histologisesti varmennettu mahalaukun adenokarsinooman; 3) dokumentoitu kaukainen etäpesäke; 4) ei ole aikaisempaa tai samanaikaista pahanlaatuisia kasvaimia muu kuin mahasyöpä; 5) ei ole aiempaa kemoterapiaa, joko adjuvanttia tai palliatiivinen; ja 6) riittävä tehtävä kaikkien tärkeimpien elinten. 34 tervettä vapaaehtoista gastroskopoidun seulontakäytäntö mahasyövän ja oli normaali mahan limakalvoa histologia. Ei ollut gastriitti joukossa 34 terveillä vapaaehtoisilla.
MiRNA ole tehty, koska samalla selvittää tutkimuksen mRNA ilmaisun analyysin [20] suunniteltu tunnistamaan mRNA ennustavat chemoresistance. Yhdeksänkymmentä esikäsittelyn biopsianäytteissä kerätty 2001-2006 analysoitiin tässä miRNA tutkimuksessa. Alkuvaiheen jälkeen endoskooppinen koepala, kaikki 90 potilasta sai sisplatiinia (60 mg /m 2, D1) yhdessä joko fluorourasiilin (1 g /m 2 5 päivän ajan; n = 88) tai kapesitabiinin (Xeloda; Roche; 1250 mg /m 2 BID 2 viikkoa; n = 2) 3 viikon välein. Kliininen vaste pyydettiin käymään läpi toisen tähystys tuolloin etenevä sairaus (PD) havaittiin mukaan Maailman terveysjärjestön (WHO) kriteerit. Seuraavia kahta kriteeriä käytettiin määrittämään kliinisen vasteen: 1) potilaat, joiden kasvaimet osoitti yli 50%: n lasku summasta tuotteiden kahden suurimman kohtisuorassa halkaisijat mitattavissa vaurioita ainakin 4 viikon ajan; tai 2) potilaat, joilla ei ole mitattavissa oleva sairaus esitys ja oli dramaattinen lasku pleuraeffuusio /askites varten vähintään 4 viikkoa [21]. Jälkikäsittely miRNA microarray tiedot voitaisiin saada kerätyistä näytteistä kun chemoresistance kehitetty (PD) 8 kliinisen vasteen. Jälkikäsittely kerättiin vähintään 2 viikkoa viimeisen annoksen jälkeen ja fluorourasiilin, ja ennen toisen vaiheen kemoterapia aloitettiin, jotta vältetään akuutin huumeiden vaikutuksia vaikuttaa ilmentymisen profiili. Näistä 8 kliininen vaste, esi- ja jälkikäsittely näytteet (jotka kerättiin aikaan etenevä tauti) edustavat chemosensitive ja solunsalpaajaresistentti kasvaimia, vastaavasti. Esikäsittely näytteitä jäljellä 82 potilasta käytettiin tunnistamaan miRNA ennustaja kemoterapiaa vastausta. Tämä ennustaja sovellettiin 8 näytteen paria kerätään samalta potilaiden ennen ja jälkeen hoidon. Ennustaminen pidettiin oikein jos jälkikäsittelyä näytteet jaettiin korkeampi ennakoivan indeksin chemoresistance kuin esikäsittely- näytteitä. Biopsia näytteet samalla kerättiin 34 terveillä vapaaehtoisilla.
Kudosnäytteitä, jotka sisältävät vähintään 50% kasvainsoluja käsiteltiin RNA, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Uutettu RNA: t analysoitiin käyttäen Agilent Bioanalyzer 6000 kokonais-RNA-määritys ja Nanodrop spektrofotometrin seuraavat valmistajan protokollia. 500 ng kokonais-RNA: ta altistettiin mukautetun miRNA microarray. Seosta, jossa oli kokonais-RNA eristettiin kolme mahasyöpä solulinjoissa (SNU-601, SNU-638, ja AGS) käytettiin vertailukohtana RNA kilpailukykyisen hybridisaation.
Microarray kokeessa
miRNA microarray suunnittelu
Laboratory of Molecular Technology (LMT) _miRNA_v2 mikrosirujen suunniteltiin käyttäen Sanger miR9.0 tietokannasta (http: //microRNA. Sanger. ac. uk) ja valmistettu mukautetun synteesistä 8 × 15 K mikrosiruja (Agilent Technologies, San Jose, CA). On yhteensä 4361 miRNA merkintöjä miR9.0 tietokantaan. Osa miRNA on tarkka sekvenssejä eri lajeista. Me romahti tietokannasta 1667 ainutlaatuinen kypsä miRNA sekvenssit kaikissa lajeja, mukaan lukien ihmisen, hiiren, rotan, jne kypsä miRNA sekvenssit sisällytettiin 60-mer pitkä oligonukleotidikoettimia linkkerillä sekvenssin 3'-päässä erottaa miRNA sekvenssit poispäin lasilevyllä pintaan. Kytkijäsekvenssi oli alkuperäisessä järjestyksessä Agilent joka on minimaalinen homologia minkä tahansa sekvenssin GenBank. Jokainen kypsä miRNA edustaa + ja - (käänteinen komplementti) lohkon sekvenssit. Tämä mahdollistaa microarray voidaan käyttää eri merkintöjä protokollia. Protokollasta riippuen, yksi koettimet voivat myös toimia negatiivisena kontrollina. Kukin koetin on 4 rinnakkaista kussakin microarray, teknisen rinnakkaisnäytteiden mittaamiseen johdonmukaisuuden ja suorituskyvyn mikrosirun. Yhteenvetona, kukin yksittäinen kypsä miRNA edustaa 8 antureista (4 + lohkon ja 4 - lohkon). Kaikkiaan 3556 ainutlaatuinen LMT seuraavat tunnukset (miRNA, positiiviset ja negatiiviset kontrollit, +/- strand) olivat microarray, joissa jokaisessa on 4 rinnakkaista. http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070

• Sekapopulaatioon Helicobacter pylori, Helicobacter bizzozeronii ja "Helicobacter heilmannii" mahalaukun limakalvo kotikissa
• Kokeellinen malli lievä diabetes: pitkäaikainen arviointi glykeeminen profiilin ja mahalaukun kontraktiliteettia rotilla