firma miRNA associata ad outcome dei pazienti con cancro gastrico seguenti chemotherapy

firma miRNA associati con gli esiti dei pazienti affetti da cancro gastrico dopo chemioterapia
Abstract
sfondo
identificazione di pazienti che probabilmente sarà o non beneficiare di chemioterapia citotossica attraverso l'uso di biomarcatori potrebbero notevolmente migliorare la gestione clinica definendo meglio adeguate opzioni di trattamento per i pazienti. microRNA possono essere biomarcatori potenzialmente utili che aiutano a guidare la terapia individualizzata per il cancro, perché l'espressione del microRNA è deregolazione nel cancro. Al fine di identificare le firme miRNA per cancro gastrico e per prevedere la resistenza clinica di cisplatino /fluorouracile (CF) chemioterapia, una vasta analisi di microarray miRNA è stata effettuata utilizzando campioni di biopsia endoscopica
. Metodi
campioni bioptici sono stati raccolti prima della chemioterapia da 90 pazienti affetti da cancro gastrico trattati con CF e da 34 volontari sani. Al momento della progressione della malattia, campioni post-trattamento sono stati inoltre raccolti da 8 responder clinici. miRNA è stato determinato utilizzando un Agilent microarray custom-designed. Al fine di individuare una firma miRNA per resistenza alla chemioterapia, abbiamo correlato i livelli di espressione dei miRNA con il tempo alla progressione (TTP) della malattia dopo la terapia CF.
Risultati
Una firma miRNA distinguere cancro gastrico dal normale epitelio dello stomaco è stato identificato. 30 miRNA sono stati significativamente inversamente correlati con TTP mentre 28 miRNA sono stati correlati significativamente positivamente con TTP di 82 pazienti affetti da cancro (P
< 0,05). Primo piano tra i miRNA upregulated associati chemiosensibilità erano miRNA noti per regolare l'apoptosi, tra cui let-7g, miR-342, miR-16, miR-181, miR-1 e miR-34. Quando questo predittore di 58 miRNA è stato applicato a un insieme separato di campioni pre- e post-trattamento del tumore dai soccorritori clinici 8, tutti gli 8 campioni di pre-trattamento sono stati correttamente previsto come a basso rischio, mentre i campioni del post-trattamento i tumori che si sono sviluppati chemioresistenza sono stati previsti per essere nella categoria ad alto rischio dalla firma 58 miRNA, suggerendo che la selezione per l'espressione di questi miRNA verificato come chemioresistenza sorto
. Conclusioni
abbiamo identificato 1) una firma miRNA che distingue cancro gastrico dal normale epitelio dello stomaco da volontari sani, e 2) un chemoreresistance miRNA firma espressione che è correlata con TTP dopo la terapia CF. La firma chemioresistenza miRNA espressione comprende diversi miRNA in precedenza dimostrato che regolano l'apoptosi in vitro
, e warrant ulteriore convalida.
Sfondo
miRNA sono brevi (~ 22 nucleotidi), RNA non codificanti che regolano l'espressione genica principalmente da la repressione traslazionale o degrado trascrizionale [1]. miRNA hanno un grande potenziale come biomarcatori tumorali a causa della loro espressione tessuto-specifica e la loro espressione aberrante nelle cellule tumorali [2]. Inoltre, miRNA hanno funzioni importanti nella regolazione del ciclo cellulare e l'apoptosi. L'espressione dei miRNA può essere deregolazione nel cancro da una varietà di meccanismi di regolazione trascrizionale tra cui, l'amplificazione, la cancellazione, la mutazione, e silenziamento epigenetico [3]. Così, microRNA può essere biomarcatori potenzialmente utili che aiutano guidare la terapia individualizzata.
Identificare i pazienti che probabilmente sarà o non potranno beneficiare di chemioterapia citotossica attraverso l'uso di biomarcatori potrebbe notevolmente migliorare la gestione clinica per definire meglio adeguate opzioni di trattamento per i pazienti. La maggior parte degli studi precedenti che tentano di identificare miRNA predittori di chemioresistenza nel cancro hanno esaminato solo i singoli miRNA [4]. Finora, un solo pubblicato analisi di microarray di alto-rendimento ha valutato miRNA le firme di espressione come predittori di resistenza alla chemioterapia in pazienti con tumori solidi metastatici [5]. In questo studio microarray miRNA di stadio III-IV tumori ovarici, let-7i espressione è risultata essere significativamente ridotta nei pazienti 27 chemioterapia resistenti rispetto ai 42 risposta completa, anche se non c'era coorte di validazione indipendente [5].
qui presentiamo i risultati di uno studio prospettico che utilizza un high-throughput analisi miRNA microarray in cui una firma miRNA è stato identificato che distingue il cancro gastrico dal normale epitelio dello stomaco. Inoltre, abbiamo identificato una seconda firma che viene correlata con il tempo alla progressione (TTP) per i pazienti affetti da cancro gastrico trattati con cisplatino e fluorouracile (CF), un regime di chemioterapia di riferimento per il cancro gastrico. Queste firme miRNA possono essere utili come potenziali biomarcatori per aiutare nella diagnosi di cancro gastrico nei casi difficili e di predire la risposta dei pazienti affetti da cancro gastrico a CF terapia.
Risultati
Identificazione di un cancro gastrico miRNA firma
Novanta pretrattamento campioni di tessuto di cancro gastrico erano disponibili per l'analisi e le loro caratteristiche clinico-patologici sono descritti nella Tabella 1. Tutti i pazienti avevano la malattia metastatica al momento della iscrizione e dopo i campioni di tessuto endoscopica biopsia sono stati raccolti, i pazienti sono stati trattati con cisplatino e fluorouracile (o capecitabina ) chemioterapia di combinazione. Tutti i dati di microarray è stato depositato presso GEO ed è disponibile al momento della pubblicazione. accesso recensore: http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070Table Caratteristiche 1 clinico-patologici di pazienti

gastrico malato di cancro
volontario sano

Formazione
impostato
prova di principio
Test set
(risponditore)

Numero
82
8
34
Età - yr
mediana
56
56
48
interquartile varia
(44-63)
(44-58)
( 43-57)
Sesso - no. (%)
Maschio
64 (78,0%)
7 (87,5%)
23 (67,6%)
femminile
18 (22,0%)
1 (12,5% )
11 (32,4%) stato
performance (PS) - n. (%)
ECOG1 PS 0 o 1
73 (89,0%) Pagina 8 (100%)
ECOG PS 2 o 3
9 (11,0%)
0
tipo istologico - no. (%)
Intestinale di Lauren 34 (41,5%) Sims 3 (37,5%)
diffusa di Lauren
48 (58,5%)
5 (62,5%)
Location di lesione primaria - no. (%)
Alto 1/3
11 (13,4%)
1 (12,5%)
Medio 1/3
18 (22,0%)
5 (62,5%)
Bassa 1/3
43 (52,4%)
1 (12,5%)
Tutto
stomaco 10 (12,2%)
1 (12,5%)
regime chemioterapico - no . (%)
Cisplatino /fluorouracile
80 (97,6%) Pagina 8 (100%)
Cisplatino /Capecitabina
2 (2,4%)
0
* dell'intensità di dose relativa -%
mediano
81,2
76,6
interquartile varia
(75,3-87,3)
(64,7-84,9)
Numero di cicli di chemioterapia
mediana Pagina 4 10
interquartile varia
(2-5)
(7-11)
risposta chemioterapia (OMS criteri) -no (%)
PR2
16 (24,6% ) Pagina 6 (100%)
SD3
25 (38,5%)
PD4
24 (36,9%)
Non misurabile
16 2
non valutabili
1
seconda linea di chemioterapia
55 (67,1%)
6 (75,0%)
mediano di follow-up per i sopravvissuti
35,5 mesi -
sopravvivenza globale - . mo
mediana
8.2
16
interquartile varia
(6,8-10,5)
(11,3-26,7)
Il tempo alla progressione - mo.
mediana
3.1
8.2
interquartile
(2,5-3,9)
(4,3-21,2)
1Eastern Cooperative Oncology Group, la risposta 2partial, malattia 3stable, malattia 4progressive
* dell'intensità di dose relativa
* media di intensità relative dosi di cisplatino e fluorouracile. intensità Dose è definita come la quantità di farmaco somministrato per unità di tempo, espresso in milligrammi per metro quadrato per settimana. dell'intensità di dose relativa è definita come l'attuale dell'intensità di dose relativa alla intensità della dose programmata di ciascun farmaco.
In primo luogo abbiamo confrontato i profili di miRNA dai campioni di 90 pre-trattamento ottenuti da pazienti affetti da cancro gastrico con i dati di espressione dei miRNA da 34 normali campioni di biopsie della mucosa gastrica ottenuto da volontari sani (Figura 1). Per stimare il potere predittivo di profili di miRNA cancro-specifica, classe previsione analisi sono state effettuate anche dividendo a caso l'intero campione in sottoinsiemi due (formazione e di prova) in rapporto di 1 a 1. La randomizzazione è stata effettuata utilizzando il software nQuery Advisor (versione 7.0, soluzioni di statistica, Saugus, MA). Poi etichetta di classe di ogni campione nel set di test è stato previsto per ciascuna delle 100 di formazione casuale per testare le partizioni in base al composto predittore covariate (PCC), diagonale analisi discriminante (LDA), 1 e 3 vicini vicini (NN), più vicino macchina baricentro (NC), e Support Vector (SVM). Nel corso di una selezione caratteristica P
< 0,05, la precisione di previsione mediana in insiemi di test è stato > 90% in tutti i classificatori (91,9%, 90,3%, 90,3%, 93,5%, 93,5% e 91,9%, per il CCP, LDA, 1-NN, 3-NN, NC, e SVM, rispettivamente), in 100 partizioni casuali training-to-test. Figura schema 1 studio per individuare e testare miRNA predittivo di resistenza a CF.
Tabella 2 elenca miRNA che sono espressi in modo differenziale tra i 90 tumori gastrici e campioni normali 34 a una selezione caratteristica di P
< 0.005. Molti miRNA che sono overexpressed nel gruppo cancro gastrico appartengono ai cluster miR-17-92 e 106b-25, come riportato in precedenza [6, 7]. in tempo reale reazione a catena della polimerasi quantitativa di trascrizione inversa (Q-RT-PCR) analisi ha confermato l'espressione differenziale di alcuni di questi miRNA in campioni di cancro gastrico (Figura 2). Sebbene miR-25 era significativamente up-regolata da analisi serie nei tumori, questo non ha raggiunto una significatività statistica da Q-PCR, forse a causa del numero limitato di campioni che erano disponibili per l'analisi. Anche se un precedente studio ha riportato che miR-486 è downregulated nel carcinoma gastrico, abbiamo trovato l'espressione di miR-486 per essere elevato nella nostra serie di pazienti affetti da cancro gastrico sia per microarray e Q-PCR (sui file 1: Figura S1) .table 2 miRNA differenzialmente espressi in cancro gastrico e normale epitelio dello stomaco.
sovraespresso nel cancro gastrico
p
FDR
rapporto
HSA-miR-25
< 1e-07
< 1e-07
1.64
HSA-miR-106b
< 1e-07
< 1e-07
1.85
HSA-miR-93
< 1e-07
< 1e-07
1.49
HSA-miR-503
< 1e-07
< 1e-07
2.17
HSA-miR-18a
< 1e-07
< 1e-07
2.27
hsa-miR-224
1.00E-07
2.59E-06
3.85
hsa-miR-451
1.00E-07
2.59E-06
3.23
hsa-miR-18b
2.00E-07
4.60E-06
2.17
hsa-miR-17-5p
2.00E-06
3.60E-05
1.61
hsa-miR-486-5p
3.00E-06
5.18E-05
2.22
hsa-miR-144
9.60E-06
0.000159
5.56
hsa-miR-552
1.03E-05
0.000164
2.38
hsa-miR-425-5p
1.32E-05
0.000195
1.35
hsa-miR-92
1.88E-05
0.000268
1.39
hsa-miR-106a
2.61E-05
0.000347
1.52
hsa-miR-223
2.68E-05
0.000347
2.13
hsa-miR-205
2.98E-05
0.000363
4.76
hsa-miR-196b
4.42E-05
0.000508
1.67
hsa-miR-19a
0.0001836
0.00181
1.69
hsa-miR-191
0.0003112
0.0028
1.27
hsa-let-7i
0.0004468
0.00385
1.20
hsa-miR-185
0.0004764
0.00394
1.32
hsa-miR-769-5p
0.0006683
0.00532
1.37
hsa-miR-196a
0.0008274
0.00646
1.45
hsa-miR-301
0.0009715
0.00745
1.82
hsa-miR-21
0.0012598
0.00948
1.49
hsa-miR-130b
0.0015411
0.0112
1.30
hsa-miR-19b
0.0015959
0.0114
1.39
hsa-miR-424
0.0019249
0.0135
1.52
hsa-miR-484
0.0020451
0.0139
1.33
hsa-miR-767-5p
0.0048511
0.03
1.64
hsa-miR-183
0.0050428
0.0305
1.52
hsa-miR-210
0.0053848
0.0318
1.35
hsa-miR-302c*
0.006328
0.0364
1.41
hsa-miR-520g
0.0070896
0.0402
2.13
hsa-miR-324-5p
0.0095742
0.0497
1.23
hsa-miR-103
0.0095861
0.0497
1.16
hsa-miR-376b
0.0096083
0.0497
1.85
hsa-miR-151
0.0100422
0.0513
1.20
hsa-miR-596
0.011231
0.0556
1.61
hsa-miR-545
0.011422
0.0556
1.69
hsa-miR-221
0.0129139
0.0608
1.27
hsa-miR-20a
0.0133176
0.0619
1.35
hsa-miR-181b
0.0148487
0.0655
1.28
hsa-miR-181d
0.0154891
0.0668
1.16
hsa-miR-623
0.0189476
0.0809
1.43
hsa-miR-519d
0.0220958
0.0915
1.59
hsa-miR-563
0.0229302
0.094
1.37
hsa-miR-505
0.0241657
0.097
1.25
hsa-miR-107
0.0242694
0.097
1.11
hsa-miR-320
0.0282982
0.111
1.20
hsa-miR-96
0.0285699
0.111
1.39
hsa-miR-339
0.0312524
0.12
1.32
hsa-miR-181a
0.0318141
0.121
1.20
hsa-miR-345
0.0322275
0.121
1.19
hsa-miR-20b
0.0325811
0.122
1.28
hsa-miR-33b
0.0339343
0.125
1.64
hsa-miR-135b
0.0352682
0.129
1.59
hsa-miR-431
0.0374687
0.134
1.41
hsa-miR-193a
0.0377098
0.134
1.35
hsa-miR-550
0.0380645
0.134
1.30
hsa-miR-565
0.0446875
0.15
1.20
Underexpressed nel carcinoma gastrico
p
FDR
Rapporto
HSA-miR-146a
< 1e-07
< 1e-07
0.39
HSA-miR-133a
< 1e-07
< 1e-07
0,34
HSA-miR-625
< 1e-07
< 1e-07
0.56
HSA-miR-375
< 1e-07
< 1e-07
0,27
HSA-miR-133b
< 1e-07
< 1e-07
0,32
HSA-miR-195
< 1e-07
< 1e-07
0,47
HSA-miR-148a
< 1e-07
< 1e-07
0,47
HSA-miR-1
< 1e-07
< 1e-07
0,27
HSA-miR-26a
< 1e-07
< 1e-07
0.67
hsa-miR-204
2.00E-07
4.60E-06
0.26
hsa-let-7c
7.00E-07
1.53E-05
0.74
hsa-let-7a
9.00E-07
1.86E-05
0.72
hsa-let-7g
1.10E-06
2.17E-05
0.71
hsa-miR-497
1.70E-06
3.20E-05
0.56
hsa-miR-26b
1.28E-05
0.000195
0.58
hsa-miR-145
2.04E-05
0.000282
0.65
hsa-miR-34a
2.89E-05
0.000363
0.75
hsa-miR-143
4.28E-05
0.000506
0.63
hsa-miR-650
9.15E-05
0.00101
0.57
hsa-miR-150
9.25E-05
0.00101
0.49
hsa-miR-768-5p
0.0001037
0.0011
0.65
hsa-let-7d
0.0001302
0.00132
0.76
hsa-miR-203
0.0001311
0.00132
0.52
hsa-miR-29c
0.0002112
0.00203
0.52
hsa-let-7f
0.0002446
0.0023
0.69
hsa-miR-30d
0.0002592
0.00238
0.78
hsa-miR-642
0.0004345
0.00383
0.62
hsa-miR-30c
0.0004556
0.00385
0.75
hsa-miR-155
0.0004998
0.00406
0.66
hsa-miR-34b
0.0013651
0.0101
0.64
hsa-miR-551b
0.0019808
0.0137
0.53
hsa-miR-28
0.0027537
0.0184
0.85
hsa-let-7e
0.0034793
0.0227
0.84
hsa-let-7b
0.0035019
0.0227
0.85
hsa-miR-212
0.0039061
0.0249
0.76
hsa-miR-564
0.0047906
0.03
0.72
hsa-miR-770-5p
0.0050814
0.0305
0.71
hsa-miR-30b
0.0060842
0.0355
0.76
hsa-miR-30a-5p
0.0077597
0.0434
0.80
hsa-miR-199b
0.0083572
0.0461
0.67
hsa-miR-125a
0.0085563
0.0466
0.77
hsa-miR-621
0.0093423
0.0497
0.69
hsa-miR-31
0.0106862
0.054
0.66
hsa-miR-365
0.0113404
0.0556
0.78
hsa-miR-381
0.0123061
0.0592
0.70
hsa-miR-626
0.0128738
0.0608
0.78
hsa-miR-127
0.0138033
0.0635
0.69
hsa-miR-660
0.0142991
0.0651
0.75
hsa-miR-342
0.0146193
0.0655
0.75
hsa-miR-146b
0.0148729
0.0655
0.77
hsa-miR-361
0.0152056
0.0663
0.86
hsa-miR-489
0.0191692
0.081
0.71
hsa-miR-29a
0.0204334
0.0854
0.79
hsa-miR-95
0.0243644
0.097
0.54
hsa-miR-567
0.0265025
0.104
0.54
hsa-miR-152
0.0376121
0.134
0.78
hsa-miR-429
0.0378151
0.134
0.65
hsa-miR-200b
0.0396617
0.138
0.75
hsa-miR-504
0.0412648
0.142
0.63
hsa-miR-668
0.041717
0.143
0.77
hsa-miR-186
0.0437991
0.149
0.83
hsa-miR-135a
0.0468793
0.157
0.58
hsa-miR-485-5p
0.047683
0.158
0.82
Figura 2 Convalida di espressione di miR da quantitativa in tempo reale inversa reazione a catena della polimerasi di trascrizione (Q-RT-PCR). Q-RT-PCR analisi di miR-18a, miR-25, miR-1, e let-7g in 4 normale (mostrato in
bianco) e 4 campioni di cancro (mostrato in
nero), confermando sovra- espressione di miR-18a e miR-25 e sotto-espressione di miR-1 e let-7g come osservato nei dati di microarray dei campioni tumorali. La t-test di valore P
Student tra il 4 normale e 4 campioni di cancro viene mostrato per ogni miRNA. Piegare il cambiamento (FC) pari a -1 indica una diminuzione del 50% nel espressione RNU6-normalizzata di un dato Identificazione di una firma miRNA miRNA. Compra di resistenza alla terapia CF
Il tempo alla progressione (TTP), non è la risposta radiografica, è stato utilizzato come indicatore clinico per la risposta di chemioterapia, in primo luogo perché abbiamo voluto includere i pazienti che non hanno avuto la malattia quantificabile utilizzando modalità di imaging standard. Per definire una da 82 campioni come la formazione destinata a sviluppare un predittore (Figura 1). Questi 82 campioni di pretrattamento sono stati raccolti da pazienti che non sono stati sottoposti a biopsie secondo. Cinquantotto miRNA erano significativamente correlati con il TTP di questi 82 pazienti (funzione di selezione P valore
< 0,05) (Tabella 3). La sovraespressione di 30 miRNA è stata associata con ritardo TTP mentre la sovraespressione di 28 miRNA è stata associata con un TTP più rapido. Sei miRNA * che sono stati associati con chemioresistenza, tra miR-518f *, miR-520a, miR-520d *, miR-519e *, miR-363 *, e miR-517 *, mentre non miRNA * sono stati associati con chemosensitivity.Table 3 miRNA la cui espressione è associata con chemiosensibilità o chemioresistenza.
miRNAa la cui espressione è associata con chemioresistenza
p
FDR

Hazard Ratio

hsa-miR-526a
0.0000
0.0103
1.482
hsa-miR-122a
0.0002
0.0379
1.545
hsa-miR-518f*
0.0004
0.0537
1.298
hsa-miR-591
0.0007
0.0598
1.492
hsa-miR-524-3p
0.0010
0.0682
1.268
hsa-miR-320
0.0013
0.0701
1.865
hsa-miR-520a*
0.0014
0.0701
1.252
hsa-miR-183
0.0031
0.119
1.39
hsa-miR-516-5p
0.0034
0.119
1.306
hsa-miR-629
0.0036
0.119
1.42
hsa-miR-595
0.0043
0.119
1.858
hsa-miR-640
0.0054
0.132
1.3
hsa-miR-520d*
0.0063
0.143
1.326
hsa-miR-519e*
0.0091
0.164
1.24
hsa-miR-363*
0.0096
0.166
1.407
hsa-miR-513
0.0137
0.193
1.347
hsa-miR-328
0.0163
0.211
1.736
hsa-miR-519a
0.0170
0.211
1.118
hsa-miR-185
0.0189
0.217
1.697
hsa-miR-658
0.0200
0.223
1.532
hsa-miR-517*
0.0218
0.226
1.305
hsa-miR-515-5p
0.0349
0.301
1.145
hsa-miR-519c-5p
0.0368
0.304
1.157
hsa-miR-661
0.0392
0.315
1.437
hsa-miR-182
0.0416
0.315
1.408
hsa-miR-206
0.0417
0.315
1.606
hsa-miR-193b
0.0419
0.315
1.433
hsa-miR-601
0.0436
0.317
1.599
miRNA la cui espressione è associata con chemiosensibilità
p
FDR
Hazard Ratio
hsa-miR-195
0.0007
0.0598
0.593
hsa-miR-146b
0.0016
0.0733
0.565
hsa-miR-26b
0.0037
0.119
0.686
hsa-miR-374
0.0042
0.119
0.84
hsa-miR-199b
0.0051
0.132
0.729
hsa-miR-132
0.0068
0.143
0.62
hsa-miR-140
0.0069
0.143
0.759
hsa-miR-487b
0.0088
0.164
0.679
hsa-let-7g
0.0091
0.164
0.539
hsa-miR-340
0.0103
0.171
0.82
hsa-miR-155
0.0109
0.174
0.704
hsa-miR-95
0.0115
0.176
0.856
hsa-miR-186
0.0137
0.193
0.662
hsa-miR-130a
0.0140
0.193
0.72
hsa-miR-342
0.0151
0.202
0.685
hsa-miR-577
0.0173
0.211
0.804
hsa-miR-128b
0.0184
0.217
0.701
hsa-miR-146a
0.0209
0.226
0.776
hsa-miR-16
0.0214
0.226
0.698
hsa-miR-503
0.0241
0.243
0.721
hsa-miR-224
0.0259
0.25
0.853
hsa-miR-223
0.0259
0.25
0.794
hsa-miR-128a
0.0294
0.276
0.704
hsa-miR-181b
0.0300
0.276
0.668
hsa-let-7f
0.0312
0.281
0.725
hsa-miR-1
0.0339
0.298
0.839
hsa-miR-421
0.0367
0.304
0.738
hsa-miR-127
0.0404
0.315
0.783
hsa-miR-34c
0.0435
0.317
0.74
hsa-miR-497
0.0493
0.351
0.769
La figura 3 mostra una curva di Kaplan-Meier per gruppi a rischio stratificati per questi 58 miRNA. Un livello di significatività permutazione per la statistica log-rank di leave-one-out cross-validati curve di Kaplan-Meier è stato 0.021, suggerendo che l'associazione tra i dati di espressione dei miRNA di TTP è statisticamente significativa. Figura 3 curve di Kaplan-Meier per il tempo alla progressione (TTP) di 2 gruppi a rischio stratificati in base all'espressione di 58 miRNA correlati con TTP ad una selezione caratteristica P < 0.05. L'associazione dei miRNA dati di espressione per TTP era statisticamente significativa (P permutazione
valore per le statistiche log-rank di curve di Kaplan-Meier convalidato = 0,021)
. Espressione della firma chemioresistenza correla con l'evoluzione della chemioresistenza in tumori che in precedenza erano chemiosensibile
La firma 58 miRNA sopra identificato è predittiva per identificare i pazienti che sono o non sono in grado di rispondere favorevolmente alla terapia CF. Abbiamo ipotizzato che i pazienti che inizialmente hanno dimostrato un 58 miRNA firma espressione favorevole passerebbero ad una firma espressione sfavorevole al momento hanno sviluppato resistenza alla terapia CF. Al fine di testare questa possibilità come una prova di principio, 8 coppie di campioni set di prova (per via endoscopica ottenuto pre e post-trattamento) sono stati raccolti da 8 pazienti che inizialmente mostravano una risposta clinica al trattamento CF, ma che alla fine hanno mostrato malattia progressiva momento in cui è stata presa una seconda biopsia endoscopica. Come mostrato nella tabella 4 tutte le 8 campioni di pretrattamento dei soccorritori clinici sono stati correttamente previsto dal predittore 58-miRNA di essere nel gruppo a basso rischio (precisione, 100%). In particolare, 6 su 8 coppie sono stati identificati correttamente per chemiosensibilità (cioè
., Campioni post-trattamento sono stati assegnati un indice predittivo più elevato di risposta chemioterapia rispetto ai campioni di pretrattamento, e quindi, previsto per essere più resistenti alla terapia) (accuratezza, 75% ). Quando la stessa previsione è stata effettuata utilizzando il P valore
selezione caratteristica di 0,01, il risultato previsione è rimasta la stessa (tabella 4) .table 4 predizione per chemioresistenza nel set prova di principio di prova
ID campione
selezione Caratteristica P < 0.05


selezione Caratteristica P < 0,01


Predictive
Index
Percentile1

Prediction
For
Pretreatment
Sample2

Overall
Prediction3


Predictive
Index
Percentile

Prediction
for
Pretreatment
Sample

Overall
Prediction

1 pre
39%
basso
errato 35%
basso
errato 1 messaggio
22%
24% Pagina 2 di pre
48%
basso
correggere
49%
basso
corretto Pagina 2 posta
79%
77%
3 pre
55%
basso
correggere
46%
basso
corretta
3 dopo
73%
77%
4 pre
13%
basso
corretta
24%
basso
corretta
4 colonne
72%
73%
5 pre
31%
basso
corretto
33%
basso
corretta
5 posta
48%
46%
6 pre
13%
basso
correggere
27%
basso
corretta
6 Post
16%
66%
7 pre
7%
basso
correggere
12%
bassa
corretta
7 Post
66%
57%
8 pre
52%
basso
errato 50%
basso
errato
8 Post
17%
24%
1Il indice predittivo è stato calcolato per ogni campione da questo metodo di supervisione delle componenti principali, dove un alto valore dell'indice predittivo corrisponde ad una rapida progressione dopo la chemioterapia (ad esempio
., breve TTP). Se l'indice predittivo di un campione nel set di prova corrisponde l'indice predittivo mediano del training set, il campione è stato assegnato un indice predittivo 50%.
Rischio 2Il stato predetto basso, se predittivi percentile indice del pretrattamento del campione era meno del 67%
3La previsione è stata considerata corretta se i campioni post-trattamento sono stati assegnati un indice predittivo maggiore di campioni di pre-trattamento.
Discussione
Questo studio ha utilizzato un approccio prospettico per identificare una firma miRNA per gastrica cancro vs normale epitelio dello stomaco e una firma miRNA che predice la risposta alla terapia CF standard.
Poiché le tecniche di istopatologia di routine a volte non portano ad una diagnosi definitiva di cancro gastrico, l'aggiunta di una firma miRNA da tali campioni dei pazienti può migliorare la accuratezza della diagnosi di cancro gastrico. In studi precedenti miRNA microarray di cancro gastrico, tessuti di controllo sono stati ottenuti da regioni dello stomaco di tumori gastrici pazienti che sono stati determinati per essere istologicamente normale e non dal tessuto dello stomaco di volontari sani normali [6, 7]. Dal momento che le anomalie molecolari si trovano spesso in istologicamente aspetto normale tessuto adiacente al tessuto tumorale, abbiamo scelto di ottenere tessuti di controllo da campioni di biopsie endoscopiche da normali, volontari privi di tumore. La maggior parte dei miRNA differenzialmente espressi segnalato per essere caratteristica del cancro gastrico in studi di microarray precedenti [6, 7] sono stati identificati all'interno della firma cancro gastrico nelle nostre analisi attuali. Tuttavia, oltre a questi precedentemente riportato miRNA nel carcinoma gastrico, abbiamo inoltre identificato potenziali miRNA oncosoppressori (in P
< 0,05 [6] e P
< 0,01 [7], tra cui miR-1 [8 , 9] e let-7 [10] che abbiamo trovato ad essere underexpressed a cancro gastrico (in P
< 0,001). (Tabella 2) È interessante notare che, Oh et al trovarono espressione di miR-486 deve essere ridotto in molti . tumori gastrici, in alcuni casi, associata con una perdita genomica di quella regione [11] Abbiamo trovato miR-486 da sovraespressa nella nostra coorte cancro gastrico sia microarray e analisi Taqman PCR (file complementare 1: Figura S1). e ' possibile che questa differenza di risultati è dovuta a differenti popolazioni di pazienti studiati.
in questo studio, si segnala per la prima volta a nostra conoscenza, un fattore predittivo miRNA per la risposta a CF terapia. il miRNA firma 58 che fornisce un indice per valutazione della risposta alla terapia potenziale CF può essere utile in stratificazione dei pazienti in un gruppo che dovrebbe ricevere la terapia standard e un gruppo che non sarà probabilmente beneficiare di tale terapia e deve essere collocato su un processo terapeutico diverso. Molti dei 58 miRNA abbiamo identificato nella tabella 2 che sono associati con TTP sono coerenti con rapporti pubblicati riguardanti la loro espressione con chemoresistance e biologia tumorale. Primo piano tra i miRNA upregulated associati a un TTP prolungata (definita da un rapporto di rischio < 1) erano miRNA che hanno dimostrato di indurre apoptosi in cellule di cancro gastrico e gli altri, come miR-16, let-7g, miR-181, miR-342, miR-1 e miR-34 [8, 12-18]. miR-16 aumenta induzione di apoptosi da nutlin e genisteina [12], e modula la resistenza ai farmaci delle cellule di cancro gastrico umano [13]
. sovraespressione di let-7c o let-7g ha dimostrato di ridurre l'espressione di Bcl-xL in Huh7 e HepG2 linee cellulari [14]. Let-7g e miR-181b sono correlati positivamente con la risposta clinica del cancro del colon a S-1, un fluorouracile orale [4]. miR-181 e miR-181b hanno dimostrato di funzionare come soppressori tumorali che fanno scattare l'inibizione della crescita, indurre l'apoptosi ed inibire l'invasione nelle cellule di glioma [15]. Ricostituzione di HSA-miR-342 nella linea di cellule di cancro del colon-retto HT-29 induce apoptosi [16]. miR-1 sensibilizza le cellule tumorali del polmone all'apoptosi doxorubicina indotta [8]. Ectopica miR-34 espressione induce apoptosi, l'arresto del ciclo cellulare o senescenza in cellule normali e tumorali [17]. Così, la sovraespressione di questi miRNA pro-apoptotici in tumori primitivi sembra essere una caratteristica molto consistente di pazienti che beneficia di CF.
È interessante notare, abbiamo identificato sei miRNA * che sono stati associati con chemioresistenza, tra miR-518f *, retrovisori 520a, miR-520d *, miR-519e *, miR-363 *, e miR-517 *, mentre non miRNA sono stati associati con chemiosensibilità. Un solo miR, miR-302 *, è stato identificato nel cancro gastrico firma miR. miR * s sono considerate fili passeggeri che si pensa essere normalmente degradato dal pre-miR che si traduce nella matura 22 nt filo che entra nel complesso RISC. Le funzioni di * miRNA rimangono poco chiari, anche se è possibile che il risultato di un compromesso di pre-miRNA (Tchernitsa et al J di Patologia, 2010) o può giocare un ruolo in termini di orientamento traduzione dell'mRNA (Gu e Lu, Plos One 2010 ).
Abbiamo anche osservato che, mentre 21 miRNA sono stati trovati in comune tra i GC e chemioresistenza miRNA firme, 37 miRNA erano unici per la firma chemiosensibilità.
l'analisi del campione di coppie di pre-e post-trattamento da 8 pazienti che inizialmente risposto alla terapia CF, ma in seguito divenne resistente alla terapia servito come prova di principio per dimostrare che l'indice predittivo della firma 58 miRNA potrebbe passare da un indice favorevole (nella fase di pre-trattamento) ad un indice sfavorevole ( post-trattamento quando la resistenza sviluppata). Purtroppo, non è stato possibile avere ulteriori coppie corrispondenti di campioni di pazienti simili per fornire una più robusta analisi statistica. Tuttavia, i risultati sono coerenti con un modello di selezione clonale delle cellule tumori resistenti preesistenti residenti nel tumore primario.
Secondo il modello di selezione clonale convenzionale per lo sviluppo di resistenza acquisita alla resistenza chemioterapia, la resistenza dei tumori inizialmente responsivi sviluppa causa la conseguenza selettiva di cloni chemioresistenti già esistenti all'interno del tumore [18]. Dato che una rapida TTP indica specificamente una resistenza intrinseca alla chemioterapia [19], 58 miRNA i cui livelli di espressione sono correlati con una breve TTP può rappresentare miRNA CHEMIORESISTENZA legati già presenti nella maggior parte delle cellule tumorali nel tumore primario. Tuttavia, i tumori primari che sembrano non esprimere questa firma miRNA di resistenza, inizialmente rispondere alla terapia fino preesistente, cellule resistenti si sviluppano in modo selettivo, nonostante la terapia CF. Al momento un campione si ottiene quando si osserva la resistenza, la massa del tumore esprime la firma miRNA chemioresistente sfavorevole. Dato che la resistenza nella maggior parte di questi pazienti si sviluppa nel corso di un periodo relativamente breve di tempo (mesi, non anni), sembra improbabile che i risultati resistenza da parte l'accumulo di molteplici singoli cambiamenti genetici.
I risultati di questo studio forniscono importanti nuovi dati e le firme miRNA, soprattutto predire la risposta alla terapia CF e per quanto riguarda la comparsa di resistenza del tumore. Tuttavia, gli studi più grandi devono essere realizzati in futuro per validare ulteriormente questi risultati e determinare se essi possono essere applicati in ambito clinico.
Conclusioni
Anche se limitato dalla piccola dimensione del campione del set di validazione, Questo studio identifica miRNA che possono comprendere una firma clinicamente rilevante per la resistenza intrinseca del cancro gastrico per CF e suggerisce che questi miRNA sono stati selezionati per durante lo sviluppo di chemoresistance acquisita. Dal momento che questo predittore miRNA può forse fornire una guida utile alla chemioterapia personalizzata, in futuro, si garantisce ulteriori indagini e la validazione in ampi studi prospettici.
Metodi
iscrizione del paziente e il trattamento
I campioni di tessuto sono stati raccolti presso l'ospedale di Korean National Cancer center mediante endoscopia 2001-2006 nell'ambito di un protocollo approvato dal Institutional Review Board (IRB) del Cancer center National Hospital a Goyang, Corea. Tutti i pazienti e volontari hanno firmato IRB-approvati moduli di consenso informato. Idoneità per l'arruolamento nello studio ha incluso i seguenti parametri: 1) di età ≥ 18 anni; 2) istologicamente confermato adenocarcinoma gastrico; 3) documentata metastasi a distanza; 4) non neoplasie precedenti o concomitanti diversi da cancro gastrico; 5) nessun precedente chemioterapia, sia adiuvante o palliativa; e 6) un'adeguata funzione di tutti gli organi principali. 34 volontari sani sono stati sottoposti gastroscopia per lo screening di routine per il cancro gastrico e aveva normale mucosa gastrica per l'istologia. Non c'era gastrite tra i 34 volontari sani.
Questo studio miRNA è stato eseguito come uno studio parallelo ad uno studio di analisi di espressione dell'mRNA [20] progettato per identificare i predittori di mRNA chemioresistenza. Novanta campioni di biopsia pre-trattamento raccolti 2001-2006 sono stati analizzati in questo studio miRNA. Dopo una biopsia endoscopica iniziale, tutti i 90 pazienti sono stati trattati con cisplatino (60 mg /m 2, D1) in combinazione con fluorouracile (1 g /m 2 per 5 giorni; n = 88) oppure capecitabina (Xeloda; Roche, 1.250 mg /m 2 BID per 2 settimane; n = 2) ogni 3 settimane. responder clinici è stato chiesto di sottoporsi alla seconda endoscopia al tempo di progressione della malattia (PD) è stato osservato Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) criteri. I seguenti due criteri sono stati utilizzati per definire responder cliniche: 1) pazienti con tumori dimostrato più di una diminuzione del 50% nella somma dei prodotti dei due maggiori diametri perpendicolari di lesioni misurabili per almeno 4 settimane; o 2) i pazienti che non hanno avuto la malattia misurabile al momento della presentazione e aveva una diminuzione drastica del versamento pleurico /ascite per almeno 4 settimane [21]. Post-trattamento miRNA dati di microarray potrebbero essere ottenuti da campioni raccolti quando chemioresistenza sviluppato (PD) in 8 responder clinici. campioni post-trattamento sono stati raccolti almeno 2 settimane dopo l'ultima dose del fluorouracile, e prima è stato avviato chemioterapia di seconda linea, al fine di evitare eventuali effetti acuti della droga sulla influenzare il profilo di espressione. Per questi 8 responder clinici, i campioni pre-e post-trattamento (che sono stati raccolti al momento della malattia progressiva) rappresentano tumori chemiosensibili e chemioresistenti, rispettivamente. campioni pretrattamento dei restanti 82 pazienti sono stati usati per identificare un predittore miRNA di risposta chemioterapia. Questo fattore predittivo è stato applicato a 8 coppie di campioni raccolti dagli stessi pazienti pre- e post-trattamento. La previsione è stata considerata corretta se i campioni post-trattamento sono stati assegnati un indice predittivo più elevato per chemioresistenza rispetto ai campioni di pre-trattamento. campioni bioptici sono stati raccolti in modo simile da 34 volontari sani.
Campioni di tessuto contenenti cellule tumorali almeno il 50% sono stati trattati per l'RNA come descritto in precedenza [22]. Gli RNA estratti sono stati analizzati utilizzando il Agilent Bioanalyzer 6000 RNA totale saggio e lo spettrofotometro Nanodrop seguendo protocolli del produttore. 500 ng di RNA totale è stato sottoposto a una consuetudine miRNA microarray. Una miscela di RNA totale isolato da tre linee di cellule di cancro gastrico (SNU-601, SNU-638, e AGS) è stato utilizzato come l'RNA di riferimento per l'ibridazione competitiva.
Microarray esperimento
miRNA disegno microarray
Il Laboratorio di Molecular Technology (LMT) _miRNA_v2 microarray è stato progettato utilizzando il database Sanger miR9.0 (http:... //microRNA Sanger ac uk) e realizzato come una custom-sintetizzato 8 × 15 K microarray (Agilent Technologies, San Jose, CA). Ci sono un totale di 4.361 voci miRNA nel database miR9.0. Alcuni dei miRNA hanno sequenze esatte di specie diverse. Siamo crollati il ​​database di 1.667 uniche sequenze maturi miRNA in tutte le specie, tra cui umana, topo, ratto, ecc Le sequenze di miRNA maturi sono stati inseriti nella sonde 60-mer lunghi oligonucleotidiche con una sequenza linker sulla all'estremità 3 'per separare le sequenze di miRNA dalla superficie vetrino. La sequenza linker è una sequenza di proprietà da Agilent che ha omologia minimo per qualsiasi sequenza in GenBank. Ogni maturo miRNA è rappresentato da + e - (complemento inverso) sequenze Strand. Ciò consente al microarray per essere utilizzato con diversi protocolli di etichettatura. A seconda del protocollo, una delle sonde possono anche servire come controllo negativo. Ogni sonda ha 4 repliche all'interno di ogni microarray, fornendo repliche tecniche per misurare la consistenza e le prestazioni del microarray. In sintesi, ogni miRNA maturo unica è rappresentata da 8 sonde (4 + filo e 4 - Strand). Un totale di 3.556 ID univoci ss LMT (miRNA, controlli positivi e negativi, +/- Strand) erano sul microarray, ognuno con 4 repliche. http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070

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