miRNA signatur forbundet med udfaldet af gastrisk cancer patienter efter kemoterapi

miRNA signatur i forbindelse med udfaldet af gastrisk kræftpatienter efter kemoterapi
Abstract
Baggrund
Identifikation af patienter, der sandsynligvis vil eller ikke vil drage fordel af cytotoksisk kemoterapi ved brug af biomarkører kan i høj grad forbedre den kliniske behandling ved bedre at definere en passende behandling muligheder for patienterne. microRNA kan være potentielt nyttige biomarkører, der hjælper guide individuel terapi for kræft, fordi microRNA udtryk dysreguleret i kræft. For at identificere miRNA signaturer for mavekræft og til at forudsige klinisk resistens over for cisplatin /fluorouracil (CF) kemoterapi, blev en omfattende miRNA microarray analyse udført ved hjælp af endoskopiske biopsiprøver.
Metoder
Biopsi prøver blev indsamlet før kemoterapi fra 90 mavekræft patienter behandlet med CF og fra 34 raske frivillige. På tidspunktet for sygdomsprogression blev prøver efter behandling derudover indsamlet fra 8 kliniske respondere. miRNA-ekspression blev bestemt ved hjælp af en specialdesignet Agilent microarray. For at identificere en miRNA signatur for kemoterapi modstand, vi korrelerede miRNA ekspressionsniveauerne med tid til progression (TTP) af sygdom efter CF terapi.
Resultater
En miRNA signatur skelne mavekræft fra normal mave epitel blev identificeret. 30 miRNA var signifikant omvendt korreleret med TTP mens 28 miRNA var signifikant positivt korreleret med TTP af 82 kræftpatienter (P
< 0,05). Fremtrædende blandt de opreguleres miRNA forbundet med kemosensitivitet var miRNA vides at regulere apoptose, herunder lad-7g, MIR-342, MIR-16, MIR-181, MIR-1, og MIR-34. Når denne 58-miRNA prædiktor blev anvendt på et separat sæt før og efter behandling tumorprøver fra de kliniske 8 respondenter, blev alle de 8 forbehandling prøver forudsagde korrekt som lav risiko, mens prøver fra efterbehandlingen tumorer, der udviklede kemoresistens blev forudsagt til at være i høj risiko kategori ved den 58 miRNA signatur, tyder på, at valget til ekspression af disse miRNA opstod som kemoresistens opstod.
konklusioner
Vi har identificeret en) en miRNA udtryk signatur der adskiller mavekræft fra normal mave epitel fra raske frivillige, og 2) en chemoreresistance miRNA ekspression signatur, er korreleret med TTP efter CF terapi. Den kemoresistens miRNA udtryk signatur omfatter flere miRNA tidligere vist at regulere apoptose in vitro
, og warrants yderligere validering.
Baggrund
miRNA er korte (~ 22 nukleotid), ikke-kodning RNA, der regulerer genekspression primært ved translationel undertrykkelse eller transkriptionel nedbrydning [1]. miRNA har stort potentiale som cancer biomarkører på grund af deres vævsspecifik udtryk og deres afvigende udtryk i cancerceller [2]. Derudover miRNA har vigtige funktioner i cellecyklus regulering og apoptose. Ekspressionen af ​​miRNA kan dysreguleret i cancer ved en række mekanismer, herunder transkriptionel regulering, amplifikation, deletion, mutation og epigenetisk inaktivering [3]. Således kan microRNA være potentielt nyttige biomarkører, der hjælper guide individualiseret terapi.
Identifikation patienter, der sandsynligvis vil eller ikke vil drage fordel af cytotoksisk kemoterapi ved brug af biomarkører kan i høj grad forbedre den kliniske behandling af bedre definerer passende behandlingsmuligheder for patienterne. De fleste tidligere undersøgelser, der forsøger at identificere miRNA prædiktorer for kemoresistens i kræft har undersøgt kun enkelte miRNA [4]. Hidtil har kun en publiceret high-throughput microarray analyse evalueret miRNA udtryk signaturer som prædiktorer for kemoterapi modstand i metastatiske tumor patienter solide [5]. I denne miRNA microarray undersøgelse af fase III-IV ovariecancer, lad-7i udtryk viste sig at blive reduceret betydeligt i 27 kemoterapi-resistente patienter sammenlignet med 42 komplette respondenter, selv om der var nogen uafhængig validering kohorte [5].
her præsenterer vi resultaterne af en prospektiv undersøgelse under anvendelse af en high-throughput miRNA microarray analyse, hvor en miRNA ekspression signatur er blevet identificeret, som adskiller mavekræft fra normal mave epitel. Vi har endvidere identificeret en anden signatur, der er korreleret med time to progression (TTP) for mavecancerpatienter behandlet med cisplatin og fluorouracil (CF), en reference kemoterapi ordning for mavekræft. Disse miRNA signaturer kan være nyttige som potentielle biomarkører til at hjælpe i diagnosticering af mavekræft i vanskelige sager og til at forudsige respons mavecancerpatienter til CF terapi.
Resultater
Identifikation af en mavekræft miRNA signatur
Ninety forbehandling gastriske cancer vævsprøver var tilgængelige for denne analyse og deres klinisk-patologiske egenskaber er beskrevet i tabel 1. Alle patienter havde metastatisk sygdom på tidspunktet for indskrivning og efter endoskopisk biopsi vævsprøver blev opsamlet, blev patienterne behandlet med cisplatin og fluorouracil (eller capecitabin ) kombinationskemoterapi. Alle microarray data er blevet deponeret hos GEO og er til rådighed efter offentliggørelse. Anmelder adgang: http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070Table 1 klinisk-patologiske karakteristika patienter

Gastric kræftpatient
Sund frivillig

Uddannelse
sætte
Proof-of-principle
test sæt
(responder)

nummer
82
8
34
Age - yr
Median
56
56
48
Interquartile spænder
(44-63) Hotel (44-58) Hotel ( 43-57)
Sex - nej. (%)
Male
64 (78,0%)
7 (87,5%)
23 (67,6%)
Female
18 (22,0%)
1 (12,5% )
11 (32,4%)
performance status (PS) - nej. (%)
ECOG1 PS 0 eller 1
73 (89,0%)
8 (100%)
ECOG PS 2 eller 3
9 (11,0%)
0
histologisk form - nej. (%)
Laurens tarm
34 (41,5%)
3 (37,5%)
Laurens diffuse
48 (58,5%)
5 (62,5%)
Placering af primære læsion - no. (%)
Øvre 1/3
11 (13,4%)
1 (12,5%)
Mellemøsten 1/3
18 (22,0%)
5 (62,5%)
Lavere 1/3
43 (52,4%)
1 (12,5%)
Hele mave
10 (12,2%)
1 (12,5%)
kemoterapi regime - ingen . (%)
Cisplatin /fluoruracil
80 (97,6%)
8 (100%)
Cisplatin /Capecitabine
2 (2,4%)
0
* Relativ dosisintensitet -%
Median
81,2
76,6
Interquartile spænder
(75,3-87,3) Hotel (64,7-84,9)
Antal kemoterapi cyklusser
Median
4
10
Interquartile spænder
(2-5) Hotel (7-11)
Kemoterapi respons (WHO kriterier) -ingen (%)
PR2
16 (24,6% )
6 (100%)
SD3
25 (38,5%)
PD4
24 (36,9%)
Umåleligt
16
2
Unevaluable
1
Second-line kemoterapi
55 (67,1%)
6 (75,0%)
Median opfølgning efter overlevende
35,5 måneder -
Samlet overlevelse - . mo
Median
8,2
16
Interquartile spænder
(6,8-10,5) Hotel (11,3-26,7)
Tid til progression - mo.
Median
3,1
8,2
Interquartile spænder
(2,5-3,9) Hotel (4,3-21,2)
1Eastern Cooperative Oncology Group, 2partial respons, 3stable sygdom, 4progressive sygdom
* Relativ dosisintensitet
* Gennemsnit af intensiteter af cisplatin og fluorouracil relative dosis. Dosis defineres som den mængde lægemiddel indgivet pr tidsenhed, udtrykt som milligram per kvadratmeter per uge. Relativ dosis defineres som faktisk dosis intensitet i forhold til den planlagte dosis intensitet hvert lægemiddel.
Vi først sammenlignet miRNA profiler fra de 90 forbehandlingsanlæg prøver opnået fra mavecancerpatienter med miRNA udtryk data fra 34 normale gastriske mucosale biopsiprøver opnået fra raske frivillige (figur 1). For at estimere den prædiktive magt kræft-specifikke miRNA profiler, analyser klasse forudsigelse blev også udført ved tilfældigt at dividere hele prøven i to (uddannelse og test) delmængder ved 1-til-1 forhold. Randomisering blev udført under anvendelse nQuery Advisor software (version 7.0, Statistiske Solutions, Saugus, MA). Så klasse etiketten på hver prøve i testen sæt blev forudsagt for hver af 100 tilfældige træning til at teste skillevægge efter sammensatte kovariant prædiktor (CCP), diagonal lineær diskriminant analyse (LDA), 1- og 3-nærmeste naboer (NN), nærmeste tyngdepunkt (NC), og støtte vektor maskine (SVM). På en funktion P Valg
< 0,05, median forudsigelse nøjagtighed i test sæt var > 90% i alle klassificører (91,9%, 90,3%, 90,3%, 93,5%, 93,5%, og 91,9%, for CCP, LDA, 1-NN, 3-NN, NC, og SVM, henholdsvis), i 100 tilfældige uddannelse-til-test-partitioner. Figur 1 Undersøgelse ordning til at identificere og teste miRNA forudsigende af resistens over for CF.
Tabel 2 lister miRNA, der udtrykkes differentielt mellem de 90 mavekræft tumorer og de 34 normale prøver på en funktion udvalg af P
< 0,005. Mange miRNA, der er overudtrykt i mavens kræft gruppen hører til miR-17-92 og 106b-25 klynger, som tidligere rapporteret [6, 7]. Kvantitativ real-time reverse transkription polymerasekædereaktion (Q-RT-PCR) analyser bekræftede den differentielle ekspression af nogle af disse miRNA i mavekræft prøver (figur 2). Selvom MIR-25 var signifikant opreguleret ved array analyse i tumorerne, dette ikke statistisk signifikans ved Q-PCR, måske på grund af det begrænsede antal af prøver, der var tilgængelige til analyse. Selv om en tidligere undersøgelse rapporterede, at miR-486 nedreguleres i gastrisk kræft, fandt vi udtryk for miR-486 at være forhøjet i vores sæt mavecancerpatienter både ved microarray og Q-PCR (Ekstra fil 1: Figur S1) .table 2 miRNA udtrykkes forskelligt i mavekræft og normal mave epitel.
overudtrykt i mavekræft
p
FDR
Ratio
HSA-miR-25
< 1e-07
< 1e-07
1,64
HSA-miR-106b
< 1e-07
< 1e-07
1.85
HSA-miR-93
< 1e-07
< 1e-07
1.49
HSA-miR-503
< 1e-07
< 1e-07
2,17
HSA-miR-18a
< 1e-07
< 1e-07
2.27
hsa-miR-224
1.00E-07
2.59E-06
3.85
hsa-miR-451
1.00E-07
2.59E-06
3.23
hsa-miR-18b
2.00E-07
4.60E-06
2.17
hsa-miR-17-5p
2.00E-06
3.60E-05
1.61
hsa-miR-486-5p
3.00E-06
5.18E-05
2.22
hsa-miR-144
9.60E-06
0.000159
5.56
hsa-miR-552
1.03E-05
0.000164
2.38
hsa-miR-425-5p
1.32E-05
0.000195
1.35
hsa-miR-92
1.88E-05
0.000268
1.39
hsa-miR-106a
2.61E-05
0.000347
1.52
hsa-miR-223
2.68E-05
0.000347
2.13
hsa-miR-205
2.98E-05
0.000363
4.76
hsa-miR-196b
4.42E-05
0.000508
1.67
hsa-miR-19a
0.0001836
0.00181
1.69
hsa-miR-191
0.0003112
0.0028
1.27
hsa-let-7i
0.0004468
0.00385
1.20
hsa-miR-185
0.0004764
0.00394
1.32
hsa-miR-769-5p
0.0006683
0.00532
1.37
hsa-miR-196a
0.0008274
0.00646
1.45
hsa-miR-301
0.0009715
0.00745
1.82
hsa-miR-21
0.0012598
0.00948
1.49
hsa-miR-130b
0.0015411
0.0112
1.30
hsa-miR-19b
0.0015959
0.0114
1.39
hsa-miR-424
0.0019249
0.0135
1.52
hsa-miR-484
0.0020451
0.0139
1.33
hsa-miR-767-5p
0.0048511
0.03
1.64
hsa-miR-183
0.0050428
0.0305
1.52
hsa-miR-210
0.0053848
0.0318
1.35
hsa-miR-302c*
0.006328
0.0364
1.41
hsa-miR-520g
0.0070896
0.0402
2.13
hsa-miR-324-5p
0.0095742
0.0497
1.23
hsa-miR-103
0.0095861
0.0497
1.16
hsa-miR-376b
0.0096083
0.0497
1.85
hsa-miR-151
0.0100422
0.0513
1.20
hsa-miR-596
0.011231
0.0556
1.61
hsa-miR-545
0.011422
0.0556
1.69
hsa-miR-221
0.0129139
0.0608
1.27
hsa-miR-20a
0.0133176
0.0619
1.35
hsa-miR-181b
0.0148487
0.0655
1.28
hsa-miR-181d
0.0154891
0.0668
1.16
hsa-miR-623
0.0189476
0.0809
1.43
hsa-miR-519d
0.0220958
0.0915
1.59
hsa-miR-563
0.0229302
0.094
1.37
hsa-miR-505
0.0241657
0.097
1.25
hsa-miR-107
0.0242694
0.097
1.11
hsa-miR-320
0.0282982
0.111
1.20
hsa-miR-96
0.0285699
0.111
1.39
hsa-miR-339
0.0312524
0.12
1.32
hsa-miR-181a
0.0318141
0.121
1.20
hsa-miR-345
0.0322275
0.121
1.19
hsa-miR-20b
0.0325811
0.122
1.28
hsa-miR-33b
0.0339343
0.125
1.64
hsa-miR-135b
0.0352682
0.129
1.59
hsa-miR-431
0.0374687
0.134
1.41
hsa-miR-193a
0.0377098
0.134
1.35
hsa-miR-550
0.0380645
0.134
1.30
hsa-miR-565
0.0446875
0.15
1.20
Underexpressed i mavekræft
p
FDR
Ratio
HSA-miR-146a
< 1e-07
< 1e-07
0,39
HSA-miR-133a
< 1e-07
< 1e-07
0,34
HSA-miR-625
< 1e-07
< 1e-07
0,56
HSA-miR-375
< 1e-07
< 1e-07
0,27
HSA-miR-133b
< 1e-07
< 1e-07
0.32
HSA-miR-195
< 1e-07
< 1e-07
0,47
HSA-miR-148a
< 1e-07
< 1e-07
0,47
HSA-miR-1
< 1e-07
< 1e-07
0,27
HSA-miR-26a
< 1e-07
< 1e-07
0.67
hsa-miR-204
2.00E-07
4.60E-06
0.26
hsa-let-7c
7.00E-07
1.53E-05
0.74
hsa-let-7a
9.00E-07
1.86E-05
0.72
hsa-let-7g
1.10E-06
2.17E-05
0.71
hsa-miR-497
1.70E-06
3.20E-05
0.56
hsa-miR-26b
1.28E-05
0.000195
0.58
hsa-miR-145
2.04E-05
0.000282
0.65
hsa-miR-34a
2.89E-05
0.000363
0.75
hsa-miR-143
4.28E-05
0.000506
0.63
hsa-miR-650
9.15E-05
0.00101
0.57
hsa-miR-150
9.25E-05
0.00101
0.49
hsa-miR-768-5p
0.0001037
0.0011
0.65
hsa-let-7d
0.0001302
0.00132
0.76
hsa-miR-203
0.0001311
0.00132
0.52
hsa-miR-29c
0.0002112
0.00203
0.52
hsa-let-7f
0.0002446
0.0023
0.69
hsa-miR-30d
0.0002592
0.00238
0.78
hsa-miR-642
0.0004345
0.00383
0.62
hsa-miR-30c
0.0004556
0.00385
0.75
hsa-miR-155
0.0004998
0.00406
0.66
hsa-miR-34b
0.0013651
0.0101
0.64
hsa-miR-551b
0.0019808
0.0137
0.53
hsa-miR-28
0.0027537
0.0184
0.85
hsa-let-7e
0.0034793
0.0227
0.84
hsa-let-7b
0.0035019
0.0227
0.85
hsa-miR-212
0.0039061
0.0249
0.76
hsa-miR-564
0.0047906
0.03
0.72
hsa-miR-770-5p
0.0050814
0.0305
0.71
hsa-miR-30b
0.0060842
0.0355
0.76
hsa-miR-30a-5p
0.0077597
0.0434
0.80
hsa-miR-199b
0.0083572
0.0461
0.67
hsa-miR-125a
0.0085563
0.0466
0.77
hsa-miR-621
0.0093423
0.0497
0.69
hsa-miR-31
0.0106862
0.054
0.66
hsa-miR-365
0.0113404
0.0556
0.78
hsa-miR-381
0.0123061
0.0592
0.70
hsa-miR-626
0.0128738
0.0608
0.78
hsa-miR-127
0.0138033
0.0635
0.69
hsa-miR-660
0.0142991
0.0651
0.75
hsa-miR-342
0.0146193
0.0655
0.75
hsa-miR-146b
0.0148729
0.0655
0.77
hsa-miR-361
0.0152056
0.0663
0.86
hsa-miR-489
0.0191692
0.081
0.71
hsa-miR-29a
0.0204334
0.0854
0.79
hsa-miR-95
0.0243644
0.097
0.54
hsa-miR-567
0.0265025
0.104
0.54
hsa-miR-152
0.0376121
0.134
0.78
hsa-miR-429
0.0378151
0.134
0.65
hsa-miR-200b
0.0396617
0.138
0.75
hsa-miR-504
0.0412648
0.142
0.63
hsa-miR-668
0.041717
0.143
0.77
hsa-miR-186
0.0437991
0.149
0.83
hsa-miR-135a
0.0468793
0.157
0.58
hsa-miR-485-5p
0.047683
0.158
0.82
Figur 2 Fastsættelse af miR ekspression ved kvantitativ realtids revers transkription polymerasekædereaktion (Q-RT-PCR). Q-RT-PCR-analyser af MIR-18a, MIR-25, MIR-1, og lad-7g i 4 normal (vist i hvidt
) og 4 cancer prøver (vist i sort og), hvilket bekræfter over- udtryk for miR-18a og miR-25 og under-ekspressionen af ​​miR-1 og lad-7 g som observeret i microarray data for kræft prøver. Student t-test P Drømmeholdet værdi mellem 4 normal og 4 cancer prøver er vist for hver miRNA. Fold ændring (FC) på -1 indikerer et fald i RNU6-normaliseret udtryk for en given miRNA.
Identifikation af en miRNA signatur 50% for resistens over for CF terapi
Tid til progression (TTP), ikke radiografisk svar, blev anvendt som den kliniske indikator for kemoterapi respons, primært fordi vi ønskede at omfatte patienter, som ikke havde kvantificerbare sygdom ved anvendelse af standard billeddannende modaliteter. For at definere en fra 82 prøver som uddannelse indstillet på at udvikle en indikator (Figur 1). Disse 82 prøver forbehandling blev indsamlet fra patienter, der ikke gennemgik anden biopsier. Fifty-otte miRNA var signifikant korreleret med TTP af disse 82 patienter (funktionen P Valg
værdi < 0,05) (tabel 3). Overekspressionen af ​​30 miRNA blev forbundet med forsinket TTP henviser overekspressionen af ​​28 miRNA var forbundet med en hurtigere TTP. Seks * miRNA, der var forbundet med kemoresistens, herunder miR-518f *, miR-520A, miR-520d *, miR-519e *, miR-363 *, og miR-517 *, mens nej * miRNA var forbundet med chemosensitivity.Table 3 miRNA hvis udtryk er forbundet med kemosensitivitet eller kemoresistens.
miRNAa hvis udtryk er forbundet med kemoresistens
p
FDR

Hazard Ratio

hsa-miR-526a
0.0000
0.0103
1.482
hsa-miR-122a
0.0002
0.0379
1.545
hsa-miR-518f*
0.0004
0.0537
1.298
hsa-miR-591
0.0007
0.0598
1.492
hsa-miR-524-3p
0.0010
0.0682
1.268
hsa-miR-320
0.0013
0.0701
1.865
hsa-miR-520a*
0.0014
0.0701
1.252
hsa-miR-183
0.0031
0.119
1.39
hsa-miR-516-5p
0.0034
0.119
1.306
hsa-miR-629
0.0036
0.119
1.42
hsa-miR-595
0.0043
0.119
1.858
hsa-miR-640
0.0054
0.132
1.3
hsa-miR-520d*
0.0063
0.143
1.326
hsa-miR-519e*
0.0091
0.164
1.24
hsa-miR-363*
0.0096
0.166
1.407
hsa-miR-513
0.0137
0.193
1.347
hsa-miR-328
0.0163
0.211
1.736
hsa-miR-519a
0.0170
0.211
1.118
hsa-miR-185
0.0189
0.217
1.697
hsa-miR-658
0.0200
0.223
1.532
hsa-miR-517*
0.0218
0.226
1.305
hsa-miR-515-5p
0.0349
0.301
1.145
hsa-miR-519c-5p
0.0368
0.304
1.157
hsa-miR-661
0.0392
0.315
1.437
hsa-miR-182
0.0416
0.315
1.408
hsa-miR-206
0.0417
0.315
1.606
hsa-miR-193b
0.0419
0.315
1.433
hsa-miR-601
0.0436
0.317
1.599
miRNA hvis udtryk er forbundet med kemosensitivitet
p
FDR
Hazard Ratio
hsa-miR-195
0.0007
0.0598
0.593
hsa-miR-146b
0.0016
0.0733
0.565
hsa-miR-26b
0.0037
0.119
0.686
hsa-miR-374
0.0042
0.119
0.84
hsa-miR-199b
0.0051
0.132
0.729
hsa-miR-132
0.0068
0.143
0.62
hsa-miR-140
0.0069
0.143
0.759
hsa-miR-487b
0.0088
0.164
0.679
hsa-let-7g
0.0091
0.164
0.539
hsa-miR-340
0.0103
0.171
0.82
hsa-miR-155
0.0109
0.174
0.704
hsa-miR-95
0.0115
0.176
0.856
hsa-miR-186
0.0137
0.193
0.662
hsa-miR-130a
0.0140
0.193
0.72
hsa-miR-342
0.0151
0.202
0.685
hsa-miR-577
0.0173
0.211
0.804
hsa-miR-128b
0.0184
0.217
0.701
hsa-miR-146a
0.0209
0.226
0.776
hsa-miR-16
0.0214
0.226
0.698
hsa-miR-503
0.0241
0.243
0.721
hsa-miR-224
0.0259
0.25
0.853
hsa-miR-223
0.0259
0.25
0.794
hsa-miR-128a
0.0294
0.276
0.704
hsa-miR-181b
0.0300
0.276
0.668
hsa-let-7f
0.0312
0.281
0.725
hsa-miR-1
0.0339
0.298
0.839
hsa-miR-421
0.0367
0.304
0.738
hsa-miR-127
0.0404
0.315
0.783
hsa-miR-34c
0.0435
0.317
0.74
hsa-miR-497
0.0493
0.351
0.769
Figur 3 viser en Kaplan-Meier kurve for risikogrupper stratificeret af disse 58 miRNA. En permutation signifikansniveau for log-rank statistik af leave-one-out cross-valideret Kaplan-Meier kurver var 0,021, hvilket tyder på, at sammenhængen mellem miRNA udtryk data til TTP er statistisk signifikant. Figur 3 Kaplan-Meier-kurver for tid til progression (TTP) af 2 risikogrupper stratificeret efter ekspression af 58 miRNA korreleret med TTP på en funktion udvalg P < 0,05. Foreningen af ​​miRNA udtryk data til TTP var statistisk signifikant (permutation P
værdi for log-rank statistik over cross-valideret Kaplan-Meier kurver = 0,021).
Ekspression af kemoresistens signatur korrelerer med udviklingen af ​​kemoresistens i tumorer, der tidligere var chemosensitive
58 miRNA signatur identificeret ovenfor, er prædiktiv for at identificere patienter, der er eller ikke er tilbøjelige til at reagere positivt på CF-terapi. Vi postuleret, at patienter, der oprindeligt demonstrerede en gunstig 58 miRNA udtryk signatur ville skifte til en ugunstig udtryk signatur på det tidspunkt, de udviklet resistens over for CF-terapi. For at teste denne mulighed som en proof-of-principle, blev 8 par test sæt prøver (endoskopisk opnået før og efter behandling) indsamlet fra 8 patienter, der oprindeligt demonstrerede en klinisk respons på CF behandling, men som vinder viste progressiv sygdom på hvilket tidspunkt en anden endoskopisk biopsi blev taget. Som vist i tabel 4 alle de 8 forbehandling prøver fra de kliniske respondere var korrekt forudsagt af 58-miRNA prædiktor at være i den lave risikogruppe (nøjagtighed, 100%). Især 6 af 8 par korrekt identificeret for kemosensitivitet (dvs.
., Blev efterbehandling prøver tildelt en højere prædiktiv indeks for kemoterapi respons end forbehandlingsanlæg prøver, og derfor forventes at være mere resistente over for behandling) (nøjagtighed, 75% ). Når den samme forudsigelse blev udført ved hjælp af funktionen P Valg
på 0,01, forudsigelsen resultat forblev den samme (tabel 4) .table 4 Forudsigelse for kemoresistens i proof-of-principle test sæt
Sample ID
Feature valg P < 0.05


Feature valg P < 0.01


Predictive
Index
Percentile1

Prediction
For
Pretreatment
Sample2

Overall
Prediction3


Predictive
Index
Percentile

Prediction
for
Pretreatment
Sample

Overall
Prediction

1 pre
39%
lav
forkert
35%
lav
forkert
1 indlæg
22%
24%
2 pre
48%
lav
korrigere
49%
lav
korrekt
2 indlæg
79%
77%
3 pre
55%
lav
korrigere
46%
lav
korrekt
3 indlæg
73%
77%
4 pre
13%
lav
korrekt
24%
lav
korrekt
4 indlæg
72%
73%
5 pre
31%
lav
korrekt
33%
lav
korrekt
5 indlæg
48%
46%
6 pre
13%
lav
korrigere
27%
lav
korrekt
6 indlæg
16%
66%
7 pre
7%
lav
korrigere
12%
lav
korrekt
7 efter
66%
57%
8 pre
52%
lav
forkert
50%
lav
forkert
8 efter
17%
24%
1Den prædiktiv indeks blev beregnet for hver prøve af denne overvågede hovedkomponent fremgangsmåde, hvor en høj værdi af den prædiktive indeks svarer til en hurtig progression efter kemoterapi (dvs.
., kort- TTP). Hvis den prædiktive indeks af en prøve i testsættet svarede til medianen forudsigende indeks træningssættet, blev prøven tildelt en 50% prædiktiv indeks.
2Den risiko blev forudsagt lavt, hvis det prædiktive indeks percentil af prøven forbehandling var mindre end 67%
3Den forudsigelse blev anset korrekt, hvis efter behandling prøver blev tildelt en højere prædiktiv indeks end prøver forbehandling.
diskussion
Denne undersøgelse har udnyttet en fremadrettet tilgang til at identificere en miRNA signatur for gastrisk kræft vs normal mave epitel og en miRNA signatur, der forudsiger respons på standard CF terapi.
Siden rutinemæssige histopatologiske teknikker til tider ikke fører til en endelig diagnose af mavekræft, kan tilføjelsen af ​​en miRNA signatur fra sådanne patientprøver forbedre nøjagtigheden af ​​en diagnose af mavekræft. I tidligere miRNA microarray studier af gastrisk cancer, blev kontrol væv opnået fra regioner i maven af ​​gastriske kræftformer patienter, der var bestemt til at være histologisk normal og ikke fra maven væv af raske normale frivillige [6, 7]. Da molekylære anormaliteter ofte findes i histologisk normalt udseende væv støder op til tumorvæv, valgte vi at opnå kontrol væv fra endoskopiske biopsiprøver fra normale, kræft-fri frivillige. De fleste af de differentielt udtrykte miRNA rapporteret at være karakteristisk for mavekræft i tidligere microarray undersøgelser [6, 7] blev også identificeret inden for mavekræft signatur i vores nuværende analyser. Men ud over disse tidligere rapporterede miRNA i mavekræft, vi derudover identificeret mulige tumor suppressor miRNA (ved P
< 0,05 [6] og P
< 0,01 [7], herunder miR-1 [8 , 9] og lad-7 [10], som vi fundet at være underexpressed i gastrisk cancer (ved P
< 0,001). (tabel 2) er interessant, Oh et al fandt udtryk for miR-486 skal reduceres i mange . gastriske cancere, i nogle tilfælde, er forbundet med et genomisk tab af dette område [11] Vi fandt mIR-486 til overudtrykkes i vores gastrisk cancer kohorte af både microarray og Taqman PCR-analyse (Yderligere fil 1: Figur S1). Det er muligt, at denne forskel i resultaterne skyldes meget forskellige patientpopulationer undersøgt.
i denne undersøgelse rapporterer vi for første gang til vores viden, en miRNA prædiktor for respons på CF terapi. den 58 miRNA signatur, der giver et indeks for vurdering af potentiel respons på CF terapi kan være nyttige i stratificere patienter i en gruppe, der skal modtage standard terapi og en gruppe, der vil sandsynligvis ikke drage fordel af en sådan terapi og skal placeres på en anden terapeutisk retssag. Flere af de 58 miRNA vi identificeret i tabel 2, der er forbundet med TTP er i overensstemmelse med offentliggjorte rapporter vedrørende deres ekspression med kemoresistens og tumor biologi. Fremtrædende blandt opreguleres miRNA forbundet med en forlænget TTP (defineret ved en hazard ratio < 1) var miRNA, der har vist sig at inducere apoptose i gastriske og andre cancerceller, såsom MIR-16, lad-7g, MIR-181, mIR-342, mIR-1, og mIR-34 [8, 12-18]. MIR-16 forøger apoptose induktion ved nutlin og genistein [12], og modulerer multilægemiddelresistens af humane gastriske cancerceller [13].
Overekspression af lad-7c eller lad-7g har vist sig at nedsætte ekspression af Bd-XL i Huh7 og HepG2-cellelinier [14]. Lad-7g og miR-181b er positivt korreleret med klinisk respons for tyktarmskræft til S-1, en mundtlig fluorouracil [4]. MIR-181a og MIR-181b har vist sig at fungere som tumorsuppressorer som udløser vækstinhibering, inducere apoptose og inhibere invasion i gliomceller [15]. Rekonstituering af HSA-MIR-342 i colorektal cancer cellelinie HT-29 inducerer apoptose [16]. MIR-1 sensibiliserer lungecancerceller til doxorubicin-induceret apoptose [8]. Ektopisk MIR-34-ekspression inducerer apoptose, celle-cellecyklusstandsnings eller senescens i normale celler og tumorceller [17]. Således overekspression af disse pro-apoptotiske miRNA i primære tumorer synes at være en meget gennemgående træk af patienter, der nyder godt af CF.
Interessant, vi identificeret seks * miRNA, der var forbundet med kemoresistens, herunder miR-518f *, miR- 520A, miR-520d *, miR-519e *, miR-363 *, og miR-517 *, hvorimod ingen miRNA var forbundet med kemosensitivitet. Kun én miR, miR-302 *, blev identificeret i mavekræft miR signatur. miR * s anses for at være passager strenge, der menes at normalt nedbrydes fra den før-miR hvilket resulterer i det modne 22 nt streng, der kommer ind i RISC-komplekset. Funktionerne af * miRNA fortsat uklare, selvom det er muligt, at de følger af forringet behandling af præ-miRNA (Tchernitsa et al J fra Pathology, 2010) eller kan spille en rolle i at målrette mRNA-translation (Gu og Lu, Plos One 2010 ).
Vi observerede også, at mens 21 miRNA blev fundet i fælles mellem GC og kemoresistens miRNA underskrifter, 37 miRNA var unikt for kemosensitivitet signatur.
Analyse af prøven par før og efter behandling fra 8 patienter der i første omgang reageret på CF behandling, men senere blev resistente over for behandling tjente som en proof-of-principle for at påvise, at den prædiktive indeks for 58 miRNA signatur ville skifte fra en gunstig indeks (ved forbehandling stadium) til en ugunstig indeks ( post-behandling, når resistens udvikles). Desværre var det ikke muligt at opnå yderligere matchede par af prøver fra lignende patienter til at give en mere robust statistisk analyse. Alligevel er resultaterne er i overensstemmelse med en model af klonselektion af allerede eksisterende tumorer celler bopæl i den primære tumor.
Ifølge den konventionelle klonselektion model for udviklingen af ​​erhvervet resistens over for kemoterapi, resistens af initialt responsive tumorer udvikler på grund af den selektive udvækst af kemoresistent kloner, der allerede findes i tumoren [18]. Da en hurtig TTP specifikt angiver en iboende resistens mod kemoterapi [19], de 58 miRNA hvis ekspressionsniveauer er korreleret med en kort TTP kan repræsentere kemoresistens-relaterede miRNA allerede er til stede i størstedelen af ​​tumorcellerne i den primære tumor. Men primære tumorer, der vises ikke at udtrykke denne miRNA signatur af resistens, i første omgang reagerer på behandlingen, indtil allerede eksisterende, resistente celler selektivt vokser trods CF terapi. På det tidspunkt en prøve opnås, når der observeres modstand, hovedparten af ​​tumoren udtrykker ugunstige, kemoresistent miRNA signatur. Eftersom modstand i de fleste af disse patienter udvikler sig over en relativt kort tidsperiode (måneder, ikke år), synes det usandsynligt, at modstand skyldes akkumuleringen af ​​flere individuelle genetiske ændringer.
Resultaterne af denne undersøgelse giver vigtige nye data og miRNA signaturer, især forudsige respons på CF-terapi og om fremkomsten af ​​tumor modstand. Men har brug for, større undersøgelser, der skal udføres i fremtiden for yderligere at validere disse resultater og afgøre, om de kan anvendes i et klinisk miljø.
Konklusioner
Selvom begrænset af den lille stikprøve af valideringen sæt, denne undersøgelse identificerer miRNA, der kan omfatte en klinisk relevant signatur for iboende modstand mavekræft til CF og foreslår, at disse miRNA blev udvalgt til under udviklingen af ​​erhvervet kemoresistens. Da denne miRNA prædiktor muligvis kan give en nyttig vejledning til personlig kemoterapi i fremtiden, det berettiger yderligere undersøgelse og validering i store prospektive studier.
Metoder
Patient indskrivning og behandling
Vævsprøver blev indsamlet på hospitalet af Korean National Cancer center ved endoskopi 2001-2006 under en protokol godkendt af Institutional Review Board (IRB) af National Cancer center Hospital i Goyang, Sydkorea. Alle patienter og frivillige underskrev IRB-godkendt informeret samtykke formularer. Berettigelse til optagelse i studiet omfattede følgende parametre: 1) alder ≥ 18 år; 2) histologisk bekræftet gastrisk adenocarcinom; 3) dokumenterede fjernmetastase; 4) ingen andre end mavekræft tidligere eller samtidige maligniteter; 5) ingen forudgående kemoterapi, enten adjuvans eller palliativ; og 6) passende funktion af alle større organer. 34 raske frivillige undergik gastroskopi for rutinemæssig screening for mavekræft og havde normal maveslimhinden ved histologi. Der var ingen gastritis blandt de 34 raske frivillige.
Denne miRNA undersøgelse er blevet udført som en parallel undersøgelse en undersøgelse af mRNA-ekspression analyse [20] designet til at identificere mRNA prædiktorer for kemoresistens. Halvfems forbehandling biopsi prøver indsamlet 2001-2006 blev analyseret i denne miRNA undersøgelse. Efter en indledende endoskopisk biopsi, blev alle de 90 patienter behandlet med cisplatin (60 mg /m 2, D1) i kombination med enten fluorouracil (1 g /m 2 i 5 dage, n = 88) eller capecitabin (Xeloda, Roche, 1250 mg /m 2 gange dagligt i 2 uger, n = 2) hver 3. uge. Kliniske responders blev bedt om at gennemgå den anden endoskopi på tidspunktet progressiv sygdom (PD) blev observeret ifølge World Health Organization (WHO) kriterier. De følgende to kriterier blev anvendt til at definere kliniske respondere: 1) patienter, hvis tumorer viste mere end et fald i summen af ​​produkterne af de to største vinkelrette diametre af målbare læsioner i mindst 4 uger 50%; eller 2) patienter, der ikke har målbar sygdom ved præsentation og havde et dramatisk fald i pleural effusion /ascites i mindst 4 uger [21]. Post-behandling miRNA microarray data kunne fås fra prøver indsamlet når kemoresistens udviklet (PD) i 8 kliniske respondere. Efter behandling blev indsamlet mindst 2 uger efter den sidste dosis af fluoruracil og før second-line kemoterapi blev startet, for at undgå eventuelle akutte lægemiddelvirkninger på at påvirke ekspressionen profil. For kliniske disse 8 respondenter, før og efter behandling prøver (som blev indsamlet på tidspunktet for progressiv sygdom) repræsenterer chemosensitive og kemoterapi tumorer hhv. Forbehandling prøver fra de resterende 82 patienter blev anvendt til at identificere en miRNA prædiktor for kemoterapi respons. Denne forudsigelse blev påført 8 prøvepar indsamlet fra de samme patienter før og efter behandling. Forudsigelsen blev anset korrekt, hvis efter behandling prøver blev tildelt en højere prædiktiv indeks for kemoresistens end før behandling prøver. Biopsiprøver blev tilsvarende indsamlet fra 34 raske frivillige. Salg Vævsprøver indeholder mindst 50% af tumorcellerne blev forarbejdet for RNA som tidligere beskrevet [22]. De ekstraherede RNA'er blev analyseret under anvendelse af Agilent Bioanalyzer 6000 Total RNA assay og NanoDrop spektrofotometer ifølge producentens protokoller. 500 ng af total RNA blev udsat for en brugerdefineret miRNA microarray. En blanding af total RNA isoleret fra tre mavekræft cellelinier (SNU-601, SNU-638, og AGS) blev anvendt som reference-RNA for konkurrencemæssig hybridisering.
Microarray eksperiment
miRNA microarray design
Laboratoriet Molekylær Technology (LMT) _miRNA_v2 microarray designet ved hjælp af Sanger miR9.0 database (http:... //microRNA Sanger ac dk) og fremstillet som en custom-syntetiseret 8 × 15 K mikroarrays (Agilent Technologies, San Jose, CA). Der er i alt 4.361 miRNA poster i miR9.0 databasen. Nogle af miRNA har eksakte sekvenser fra forskellige arter. Vi kollapsede databasen til 1.667 unikke modne miRNA sekvenser på tværs af alle arter, herunder menneske, mus, rotte, etc. De modne miRNA sekvenser blev inkorporeret i 60-mer lange oligonukleotidprober med en linkersekvens på 3'-enden for at adskille miRNA sekvenser væk fra objektglasset overflade. Linkersekvensen var en proprietær sekvens fra Agilent der har minimal homologi med nogen sekvens i GenBank. Hver modne miRNA er repræsenteret ved + og - (omvendt komplement) streng sekvenser. Dette muliggør mikroarrayet der skal bruges med forskellige mærkning protokoller. Afhængig af protokol, kan en af ​​proberne også tjene som en negativ kontrol. Hver sonde har 4 replikater inden for hver microarray, giver tekniske gentagelser til måling konsistens og ydeevne af microarray. Sammenfattende er hver unik modne miRNA repræsenteret ved 8 prober (4 + streng og 4 - streng). I alt 3.556 unikke LMT seq id'er (miRNA, positive og negative kontroller, +/- streng) var på microarray, hver med 4 gentagelser. http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070

• En blandet population af Helicobacter pylori, Helicobacter bizzozeronii og "Helicobacter heilmannii" i maveslimhinden af ​​en indenlandsk cat
• Eksperimentel model af mild diabetes: langsigtet evaluering af glykæmisk profil og gastrisk kontraktilitet i rats