miRNA signatur knyttet til utfallet av mage kreftpasienter følgende chemotherapy

miRNA signatur knyttet til utfallet av mage kreftpasienter etter kjemoterapi
Abstract
Bakgrunn
Identifikasjon av pasienter som sannsynligvis vil eller ikke vil ha nytte av cytostatika ved bruk av biomarkører kan forbedre kliniske behandlingen av bedre definere aktuelle behandlingstilbud for pasientene. microRNAs kan være potensielt nyttige biomarkører som hjelper veilede individualisert behandling for kreft fordi mikroRNA uttrykk dysregulerte i kreft. For å identifisere miRNA signaturer for magekreft og for å forutsi klinisk resistens mot cisplatin /fluorouracil (CF) kjemoterapi, ble en omfattende miRNA microarray analyse utført ved hjelp av endoskopisk biopsiprøver
. Metoder
biopsiprøver ble samlet inn før kjemoterapi fra 90 mage kreftpasienter som behandles med CF og fra 34 friske frivillige. På tidspunktet for sykdomsutvikling, ble etter behandling prøver i tillegg samlet inn fra 8 kliniske respondere. miRNA uttrykket ble bestemt ved hjelp av en spesialdesignet Agilent microarray. For å identifisere en miRNA signatur for kjemoterapi motstand, vi korrelerte miRNA uttrykket nivåer med tid til progresjon (TTP) av sykdom etter CF terapi.
Resultater
En miRNA signatur skille magekreft fra normal mage epitel ble identifisert. 30 mirnas var signifikant negativt korrelert med TTP mens 28 mirnas var signifikant positivt korrelert med TTP av 82 kreftpasienter (P
< 0,05). Prominent blant oppregulert mirnas forbundet med kjemosensitivitet var mirnas kjent for å regulere apoptose, inkludert la-7g, MIR-342, MIR-16, MIR-181, MIR-1 og MIR-34. Når denne 58-miRNA prediktor ble brukt på et eget sett med før og etter behandling tumorprøver fra de 8 kliniske respondere, ble alle de 8 før behandling prøvene korrekt spådd som lav risiko, mens prøver fra etterbehandling svulster som utvikles chemoresistance ble spådd å være i høy-risiko kategorien av 58 miRNA signatur, noe som tyder på at valget for uttrykket av disse miRNAs oppstått som chemoresistance oppsto.
Konklusjoner
Vi har identifisert en) en miRNA uttrykk signatur som skiller magekreft fra normal mage epitel fra friske frivillige, og 2) en chemoreresistance miRNA uttrykk signatur som er korrelert med TTP etter CF terapi. Den chemoresistance miRNA uttrykket signatur inneholder flere mirnas tidligere vist å regulere apoptose in vitro
, og garanterer ytterligere validering.
Bakgrunn
mirnas er korte (~ 22 nucleotide), ikke-kodende RNA som regulerer genuttrykk primært av translasjonell undertrykkelse eller transkripsjonen degradering [1]. mirnas har et stort potensiale som kreft biomarkører på grunn av deres vev-spesifikk ekspresjon og deres avvikende ekspresjon i kreftceller [2]. I tillegg mirnas har viktige funksjoner i cellesyklus regulering og apoptose. Ekspresjonen av mirnas kan dysregulerte i kreft ved en rekke forskjellige mekanismer, inkludert transkripsjonsregulering, forsterkning, delesjon, mutasjon, og epigenetisk lyddemping [3]. Dermed kan microRNAs være potensielt nyttige biomarkører som hjelper veilede individualisert behandling.
Identifisere pasienter som sannsynligvis vil eller ikke vil ha nytte av cytostatika gjennom bruk av biomarkører kan forbedre kliniske behandlingen av bedre definere aktuelle behandlingstilbud for pasientene. De fleste tidligere studier som forsøker å identifisere miRNA prediktorer for chemoresistance i kreft har undersøkt bare individuelle mirnas [4]. Så langt har bare én publisert høy gjennomstrømming microarray analyse evaluert miRNA uttrykket signaturer som predikator for kjemoterapi motstand i metastatiske pasienter med svulster [5]. I denne miRNA microarray studie av stadium III-IV eggstokkreft, la-7i uttrykk ble funnet å være betydelig redusert i 27 cellegift-resistente pasienter i forhold til 42 komplett respons, selv om det var ingen uavhengig validering kohort [5].
her presenterer vi resultatene av en prospektiv studie hvor en høy gjennomstrømming miRNA microarray analyse der en miRNA uttrykk signatur har blitt identifisert som skiller magekreft fra normal mage epitel. Videre har vi identifisert en annen signatur som er korrelert med tid til progresjon (TTP) for mage kreftpasienter behandlet med cisplatin og fluorouracil (CF), en referanse kjemoterapi regime for magekreft. Disse miRNA signaturer kan være nyttige som potensielle biomarkører for å hjelpe i diagnostisering av magekreft i vanskelige saker og til å forutsi respons av magekreftpasienter til CF terapi.
Resultater
Identifisering av et magekreft miRNA signatur
Ninety forbehandling gastrisk kreft vevsprøver var tilgjengelig for analyse, og deres clinicopathological egenskaper er beskrevet i tabell 1. Alle pasientene hadde metastatisk sykdom ved tidspunktet for registrering og etter endoskopisk biopsi vevsprøver ble samlet, de pasienter som ble behandlet med cisplatin og fluorouracil (eller kapecitabin ) kombinasjonskjemoterapi. All microarray data har blitt deponert på GEO og er tilgjengelig ved publisering. Anmelder tilgang: http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070Table En klinisk-patologiske kjennetegn ved pasientene

Gastric kreftpasient
Sunn frivillig

Trening
satt
Proof-of-prinsippet
test satt product: (responder)

Antall
82
8
34
Age - yr
Median
56
56
48
indre kvartilområdet product: (44-63) product: (44-58) plakater ( 43-57)
Sex - nei. (%)
Mann fra 64 (78,0%)
7 (87,5%)
23 (67,6%)
Kvinne
18 (22,0%)
1 (12,5% )
11 (32,4%)
performance status (PS) - nei. (%)
ECOG1 PS 0 eller 1
73 (89,0%)
8 (100%)
ECOG PS 2 eller 3
9 (11,0%)
0
histologisk type - nei. (%)
Lauren intestinal
34 (41,5%)
3 (37,5%)
Lauren diffuse
48 (58,5%)
5 (62,5%)
Plassering av primær lesjon - nei. (%)
Øvre 1/3
11 (13,4%)
1 (12,5%)
Middle 1/3
18 (22,0%)
5 (62,5%)
Nedre 1/3
43 (52,4%)
1 (12,5%)
Hele magen
10 (12,2%)
1 (12,5%)
kjemoterapi - ingen . (%)
Cisplatin /Fluorouracil
80 (97,6%)
8 (100%)
Cisplatin /Capecitabine
2 (2,4%)
0 product: * Relativ dose intensitet -%
Median
81,2
76,6
indre kvartilområdet product: (75,3 til 87,3) plakater (64,7 til 84,9)
Antall kjemoterapi sykluser
Median
4
10
indre kvartilområdet product: (2-5) product: (7-11)
Kjemoterapi respons (WHO-kriterier) -ingen (%)
PR2
16 (24,6% )
6 (100%)
SD3
25 (38,5%)
PD4
24 (36,9%)
unmeasurable
16
2
Unevaluable
1
Second kjemoterapi
55 (67,1%)
6 (75,0%)
Median oppfølging etter overlevende
35,5 måneder -
Total overlevelse - . mo
Median
8,2
16
indre kvartilområdet product: (06.08 til 10.05) plakater (11,3 til 26,7)
Tid til progresjon - mo.
Median
3,1
8,2
indre kvartilområdet product: (02.05 til 03.09) product: (4,3 til 21,2)
1Eastern Cooperative Oncology Group, 2partial respons, 3stable sykdom, 4progressive sykdom
* Relativ dose intensitet product: * Mean av relative dose intensiteter av cisplatin og fluorouracil. Doseintensitet er definert som den mengden av medikament som administreres pr tidsenhet, uttrykt som milligram per kvadratmeter per uke. Relativ doseintensitet er definert som den faktiske doseintensitet i forhold til den planlagte dose intensiteten av hvert medikament.
Vi først sammen miRNA profiler fra de 90 forbehandling prøvene oppnådd fra magekreftpasienter med miRNA ekspresjonsdata fra 34 normale gastriske slimhinne biopsiprøver oppnådd fra friske frivillige (figur 1). For å estimere prediktiv kraft av kreftspesifikke miRNA profiler, analyser klasse prediksjon ble også utført ved tilfeldig dele hele prøven i to (opplærings- og test) undergrupper på en-til-en-forhold. Randomisering ble utført ved hjelp nQuery Advisor-programvaren (versjon 7.0, Statistical Solutions, Saugus, MA). Da klassen etikett for hver prøve i testsettet ble spådd for hver av 100 tilfeldig trening for å teste partisjoner i henhold til sammensatte kovariat prediktor (CCP), diagonal lineær diskriminant analyse (LDA), 1- og 3-nærmeste naboer (NN), nærmeste Tyngdepunktet (NC), og støtte vektor maskin (SVM). På en funksjon utvalg P
< 0,05, median prediksjonsnøyaktigheten i testsett var > 90% i alle classifiers (91,9%, 90,3%, 90,3%, 93,5%, 93,5% og 91,9%, for CCP, LDA, 1-NN, 3-NN, NC, og SVM, henholdsvis), i 100 tilfeldige trening-til-test partisjoner. Figur 1 Study ordning for å identifisere og teste mirnas prediktiv av motstand mot CF.
Tabell 2 lister mirnas som er forskjellig uttrykt mellom 90 mage kreftsvulster og 34 normale prøver på en funksjon utvalg av P
< 0,005. Mange mirnas som er overuttrykt i magekreft gruppen tilhører Mir-17-92 og 106b-25 klynger, som tidligere rapportert [6, 7]. Kvantitativ sanntid revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (Q-RT-PCR) analyser som bekrefter den differensielle ekspresjonen av noen av disse mirnas i magekreft prøver (figur 2). Selv MIR-25 var signifikant oppregulert ved rekke analyse i svulstene, gjorde dette ikke statistisk signifikans av Q-PCR, kanskje på grunn av begrenset antall prøver som var tilgjengelige for analyse. Selv om en tidligere studie rapporterte at MIR-486 er nedregulert i magekreft, fant vi uttrykk for MIR-486 for å være forhøyet i vår sett mage kreftpasienter både av microarray og Q-PCR (tilleggsfiler 1: Figur S1) .table 2 mirnas forskjellig uttrykt i magekreft og normal mage epitel.
overexpressed i magekreft
p
FDR
ratio
HSA-MIR-25
< 1e-07
< 1e-07
1,64
HSA-MIR-106b
< 1e-07
< 1e-07
1.85
HSA-MIR-93
< 1e-07
< 1e-07
1.49
HSA-MIR-503
< 1e-07
< 1e-07
2.17
HSA-MIR-18a
< 1e-07
< 1e-07
2.27
hsa-miR-224
1.00E-07
2.59E-06
3.85
hsa-miR-451
1.00E-07
2.59E-06
3.23
hsa-miR-18b
2.00E-07
4.60E-06
2.17
hsa-miR-17-5p
2.00E-06
3.60E-05
1.61
hsa-miR-486-5p
3.00E-06
5.18E-05
2.22
hsa-miR-144
9.60E-06
0.000159
5.56
hsa-miR-552
1.03E-05
0.000164
2.38
hsa-miR-425-5p
1.32E-05
0.000195
1.35
hsa-miR-92
1.88E-05
0.000268
1.39
hsa-miR-106a
2.61E-05
0.000347
1.52
hsa-miR-223
2.68E-05
0.000347
2.13
hsa-miR-205
2.98E-05
0.000363
4.76
hsa-miR-196b
4.42E-05
0.000508
1.67
hsa-miR-19a
0.0001836
0.00181
1.69
hsa-miR-191
0.0003112
0.0028
1.27
hsa-let-7i
0.0004468
0.00385
1.20
hsa-miR-185
0.0004764
0.00394
1.32
hsa-miR-769-5p
0.0006683
0.00532
1.37
hsa-miR-196a
0.0008274
0.00646
1.45
hsa-miR-301
0.0009715
0.00745
1.82
hsa-miR-21
0.0012598
0.00948
1.49
hsa-miR-130b
0.0015411
0.0112
1.30
hsa-miR-19b
0.0015959
0.0114
1.39
hsa-miR-424
0.0019249
0.0135
1.52
hsa-miR-484
0.0020451
0.0139
1.33
hsa-miR-767-5p
0.0048511
0.03
1.64
hsa-miR-183
0.0050428
0.0305
1.52
hsa-miR-210
0.0053848
0.0318
1.35
hsa-miR-302c*
0.006328
0.0364
1.41
hsa-miR-520g
0.0070896
0.0402
2.13
hsa-miR-324-5p
0.0095742
0.0497
1.23
hsa-miR-103
0.0095861
0.0497
1.16
hsa-miR-376b
0.0096083
0.0497
1.85
hsa-miR-151
0.0100422
0.0513
1.20
hsa-miR-596
0.011231
0.0556
1.61
hsa-miR-545
0.011422
0.0556
1.69
hsa-miR-221
0.0129139
0.0608
1.27
hsa-miR-20a
0.0133176
0.0619
1.35
hsa-miR-181b
0.0148487
0.0655
1.28
hsa-miR-181d
0.0154891
0.0668
1.16
hsa-miR-623
0.0189476
0.0809
1.43
hsa-miR-519d
0.0220958
0.0915
1.59
hsa-miR-563
0.0229302
0.094
1.37
hsa-miR-505
0.0241657
0.097
1.25
hsa-miR-107
0.0242694
0.097
1.11
hsa-miR-320
0.0282982
0.111
1.20
hsa-miR-96
0.0285699
0.111
1.39
hsa-miR-339
0.0312524
0.12
1.32
hsa-miR-181a
0.0318141
0.121
1.20
hsa-miR-345
0.0322275
0.121
1.19
hsa-miR-20b
0.0325811
0.122
1.28
hsa-miR-33b
0.0339343
0.125
1.64
hsa-miR-135b
0.0352682
0.129
1.59
hsa-miR-431
0.0374687
0.134
1.41
hsa-miR-193a
0.0377098
0.134
1.35
hsa-miR-550
0.0380645
0.134
1.30
hsa-miR-565
0.0446875
0.15
1.20
Underexpressed i magekreft
p
FDR
Ratio
HSA-MIR-146a
< 1e-07
< 1e-07
0,39
HSA-MIR-133a
< 1e-07
< 1e-07
0,34
HSA-MIR-625
< 1e-07
< 1e-07
0,56
HSA-MIR-375
< 1e-07
< 1e-07
0,27
HSA-MIR-133b
< 1e-07
< 1e-07
0,32
HSA-MIR-195
< 1e-07
< 1e-07
0,47
HSA-MIR-148a
< 1e-07
< 1e-07
0,47
HSA-Mir-1
< 1e-07
< 1e-07
0,27
HSA-MIR-26a
< 1e-07
< 1e-07
0.67
hsa-miR-204
2.00E-07
4.60E-06
0.26
hsa-let-7c
7.00E-07
1.53E-05
0.74
hsa-let-7a
9.00E-07
1.86E-05
0.72
hsa-let-7g
1.10E-06
2.17E-05
0.71
hsa-miR-497
1.70E-06
3.20E-05
0.56
hsa-miR-26b
1.28E-05
0.000195
0.58
hsa-miR-145
2.04E-05
0.000282
0.65
hsa-miR-34a
2.89E-05
0.000363
0.75
hsa-miR-143
4.28E-05
0.000506
0.63
hsa-miR-650
9.15E-05
0.00101
0.57
hsa-miR-150
9.25E-05
0.00101
0.49
hsa-miR-768-5p
0.0001037
0.0011
0.65
hsa-let-7d
0.0001302
0.00132
0.76
hsa-miR-203
0.0001311
0.00132
0.52
hsa-miR-29c
0.0002112
0.00203
0.52
hsa-let-7f
0.0002446
0.0023
0.69
hsa-miR-30d
0.0002592
0.00238
0.78
hsa-miR-642
0.0004345
0.00383
0.62
hsa-miR-30c
0.0004556
0.00385
0.75
hsa-miR-155
0.0004998
0.00406
0.66
hsa-miR-34b
0.0013651
0.0101
0.64
hsa-miR-551b
0.0019808
0.0137
0.53
hsa-miR-28
0.0027537
0.0184
0.85
hsa-let-7e
0.0034793
0.0227
0.84
hsa-let-7b
0.0035019
0.0227
0.85
hsa-miR-212
0.0039061
0.0249
0.76
hsa-miR-564
0.0047906
0.03
0.72
hsa-miR-770-5p
0.0050814
0.0305
0.71
hsa-miR-30b
0.0060842
0.0355
0.76
hsa-miR-30a-5p
0.0077597
0.0434
0.80
hsa-miR-199b
0.0083572
0.0461
0.67
hsa-miR-125a
0.0085563
0.0466
0.77
hsa-miR-621
0.0093423
0.0497
0.69
hsa-miR-31
0.0106862
0.054
0.66
hsa-miR-365
0.0113404
0.0556
0.78
hsa-miR-381
0.0123061
0.0592
0.70
hsa-miR-626
0.0128738
0.0608
0.78
hsa-miR-127
0.0138033
0.0635
0.69
hsa-miR-660
0.0142991
0.0651
0.75
hsa-miR-342
0.0146193
0.0655
0.75
hsa-miR-146b
0.0148729
0.0655
0.77
hsa-miR-361
0.0152056
0.0663
0.86
hsa-miR-489
0.0191692
0.081
0.71
hsa-miR-29a
0.0204334
0.0854
0.79
hsa-miR-95
0.0243644
0.097
0.54
hsa-miR-567
0.0265025
0.104
0.54
hsa-miR-152
0.0376121
0.134
0.78
hsa-miR-429
0.0378151
0.134
0.65
hsa-miR-200b
0.0396617
0.138
0.75
hsa-miR-504
0.0412648
0.142
0.63
hsa-miR-668
0.041717
0.143
0.77
hsa-miR-186
0.0437991
0.149
0.83
hsa-miR-135a
0.0468793
0.157
0.58
hsa-miR-485-5p
0.047683
0.158
0.82
Figur 2 Validering av mir ekspresjon ved kvantitativ sanntids revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (Q-RT-PCR). Q-RT-PCR analyser av MIR-18a, MIR-25, MIR-en, og la 7g i 4 normal (vist i hvitt
) og 4 kreftprøver (vist i sort
), bekrefter over- uttrykk for MIR-18a og MIR-25 og under-uttrykk for MIR-en og la 7g som observert i microarray data fra kreftprøver. The Student t-test P
verdi mellom 4 normal og 4 kreftprøver er vist for hver miRNA. Brett endring (FC) på -1 indikerer en 50% reduksjon i RNU6-normalisert uttrykk for en gitt miRNA.
Identifisering av en miRNA signatur for motstand mot CF terapi
Tid til progresjon (TTP), ikke radiografisk respons, ble benyttet som klinisk indikator for kjemoterapi reaksjon, først og fremst fordi vi ønsket å inkludere pasienter som ikke har målbar sykdom ved anvendelse av standard bildediagnostikk. For å definere en fra 82 prøvene som trening satt til å utvikle en prediktor (figur 1). Disse 82 forbehandling prøvene ble samlet inn fra pasienter som ikke gjennomgår andre biopsier. Femti-åtte mirnas var signifikant korrelert med TTP av disse 82 pasientene (funksjonsvalg P
verdi < 0,05) (Tabell 3). Overekspresjon av 30 mirnas var assosiert med forsinket TTP mens overekspresjon av 28 mirnas var assosiert med en raskere TTP. Seks * mirnas som var knyttet til chemoresistance, inkludert MIR-518f *, MIR-520A, MIR-520d *, MIR-519e *, MIR-363 *, og MIR-517 *, mens ingen * mirnas var assosiert med chemosensitivity.Table 3 mirnas hvis uttrykk er assosiert med kjemosensitivitet eller chemoresistance.
miRNAa hvis uttrykket er assosiert med chemoresistance
p
FDR

Hazard Ratio

hsa-miR-526a
0.0000
0.0103
1.482
hsa-miR-122a
0.0002
0.0379
1.545
hsa-miR-518f*
0.0004
0.0537
1.298
hsa-miR-591
0.0007
0.0598
1.492
hsa-miR-524-3p
0.0010
0.0682
1.268
hsa-miR-320
0.0013
0.0701
1.865
hsa-miR-520a*
0.0014
0.0701
1.252
hsa-miR-183
0.0031
0.119
1.39
hsa-miR-516-5p
0.0034
0.119
1.306
hsa-miR-629
0.0036
0.119
1.42
hsa-miR-595
0.0043
0.119
1.858
hsa-miR-640
0.0054
0.132
1.3
hsa-miR-520d*
0.0063
0.143
1.326
hsa-miR-519e*
0.0091
0.164
1.24
hsa-miR-363*
0.0096
0.166
1.407
hsa-miR-513
0.0137
0.193
1.347
hsa-miR-328
0.0163
0.211
1.736
hsa-miR-519a
0.0170
0.211
1.118
hsa-miR-185
0.0189
0.217
1.697
hsa-miR-658
0.0200
0.223
1.532
hsa-miR-517*
0.0218
0.226
1.305
hsa-miR-515-5p
0.0349
0.301
1.145
hsa-miR-519c-5p
0.0368
0.304
1.157
hsa-miR-661
0.0392
0.315
1.437
hsa-miR-182
0.0416
0.315
1.408
hsa-miR-206
0.0417
0.315
1.606
hsa-miR-193b
0.0419
0.315
1.433
hsa-miR-601
0.0436
0.317
1.599
mirnas hvis uttrykket er assosiert med kjemosensitivitet
p
FDR
Hazard Ratio
hsa-miR-195
0.0007
0.0598
0.593
hsa-miR-146b
0.0016
0.0733
0.565
hsa-miR-26b
0.0037
0.119
0.686
hsa-miR-374
0.0042
0.119
0.84
hsa-miR-199b
0.0051
0.132
0.729
hsa-miR-132
0.0068
0.143
0.62
hsa-miR-140
0.0069
0.143
0.759
hsa-miR-487b
0.0088
0.164
0.679
hsa-let-7g
0.0091
0.164
0.539
hsa-miR-340
0.0103
0.171
0.82
hsa-miR-155
0.0109
0.174
0.704
hsa-miR-95
0.0115
0.176
0.856
hsa-miR-186
0.0137
0.193
0.662
hsa-miR-130a
0.0140
0.193
0.72
hsa-miR-342
0.0151
0.202
0.685
hsa-miR-577
0.0173
0.211
0.804
hsa-miR-128b
0.0184
0.217
0.701
hsa-miR-146a
0.0209
0.226
0.776
hsa-miR-16
0.0214
0.226
0.698
hsa-miR-503
0.0241
0.243
0.721
hsa-miR-224
0.0259
0.25
0.853
hsa-miR-223
0.0259
0.25
0.794
hsa-miR-128a
0.0294
0.276
0.704
hsa-miR-181b
0.0300
0.276
0.668
hsa-let-7f
0.0312
0.281
0.725
hsa-miR-1
0.0339
0.298
0.839
hsa-miR-421
0.0367
0.304
0.738
hsa-miR-127
0.0404
0.315
0.783
hsa-miR-34c
0.0435
0.317
0.74
hsa-miR-497
0.0493
0.351
0.769
Figur 3 viser en Kaplan-Meier kurve for risikogrupper stratifisert etter disse 58 miRNAs. En permutasjon signifikansnivå for log-rank statistikk fra leave-one-out cross-validerte Kaplan-Meier-kurver var 0,021, noe som tyder på at sammenhengen mellom miRNA uttrykket data til TTP er statistisk signifikant. Figur 3 Kaplan-Meier-kurver for tid til progresjon (TTP) av 2 risikogrupper stratifisert etter uttrykket av 58 mirnas korrelerte med TTP på en funksjon utvalg P < 0,05. Foreningen av miRNA uttrykk data til TTP var statistisk signifikant (permutasjon P
verdi for log-rang statistikk over tverr validert Kaplan-Meier-kurver = 0,021).
Expression av chemoresistance signatur korrelerer med utviklingen av chemoresistance i svulster som tidligere var kjemosensitiv
58 miRNA signatur identifisert ovenfor er prediktiv for å identifisere pasienter som er eller ikke er sannsynlig å svare positivt på CF terapi. Vi postulerte at pasienter som i utgangspunktet viste en gunstig 58 miRNA uttrykk signatur ville bytte til en ugunstig uttrykk signatur på det tidspunktet de utviklet resistens mot CF terapi. For å teste denne muligheten som en proof-of-prinsippet, ble 8 par test sett prøver (endoskopisk innhentet før og etter behandling) innhentet fra 8 pasienter som i utgangspunktet viste en klinisk respons på CF behandling, men som til slutt viste progressiv sykdom ved hvilket tidspunkt et andre endoskopisk biopsi ble tatt. Som vist i tabell 4 alle de 8 forbehandling prøvene fra de kliniske reagerer på riktig måte ble forutsagt av den 58-miRNA prediktor for å være i lav-risikogruppe (nøyaktighet, 100%). Spesielt, 6 av 8 par ble korrekt identifisert for kjemosensitivitet (dvs.
., Ble etter behandlingsperioden prøvene tildelt en høyere prediktiv indeks for kjemoterapi respons enn forbehandling prøver, og derfor spådd å være mer motstandsdyktig mot terapi) (nøyaktighet, 75% ). Når den samme spådommen ble utført ved hjelp av funksjonen utvalg P
verdi på 0,01, forble prediksjon resultatet det samme (tabell 4) .table 4 Prediksjon for chemoresistance i proof-of-prinsippet testsettet
Prøve ID
Feature utvalg P < 0,05


Feature utvalg P < 0.01


Predictive
Index
Percentile1

Prediction
For
Pretreatment
Sample2

Overall
Prediction3


Predictive
Index
Percentile

Prediction
for
Pretreatment
Sample

Overall
Prediction

1 pre
39%
lav
feil
35%
lav
feil
1 innlegg
22%
24%
to pre
48%
lav
korrigere
49%
lav
riktig
2 innlegg
79%
77%
tre pre
55%
lav
korrigere
46%
lav
riktig
3 innlegg
73%
77%
fire pre
13%
lav
riktig
24%
lav
riktig
4 innlegg
72%
73%
5 pre
31%
lav
riktig
33%
lav
riktig
5 innlegg
48%
46%
6 pre
13%
lav
korrigere
27%
lav
riktig
6 innlegg
16%
66%
7 pre
7%
lav
korrigere
12%
lav
riktig
7 innlegg
66%
57%
8 pre
52%
lav
feil
50%
lav
feil
8 post
17%
24%
1the prediktiv indeksen ble beregnet for hver prøve av denne overvåket hovedkomponent-metoden, der en høy verdi av prediktiv indeksen tilsvarer en rask progresjon etter kjemoterapi (dvs.
., kort TTP). Dersom den prediktive indeksen for en prøve i testsettet samsvarer med median prediktive indeksen for treningssettet, ble prøven tilordnet en 50% prediktiv indeks.
2Fra risikoen ble forutsagt lav, hvis prediktive indeks persentil av forbehandlingen ble prøven mindre enn 67%
3the prediksjon ble ansett riktig hvis etterbehandling prøvene ble tildelt en høyere prediktiv indeks enn før behandling prøvene.
diskusjon
Denne studien har benyttet en prospektiv tilnærming til å identifisere en miRNA signatur for mage kreft sammenlignet med normal mage epitel og en miRNA signatur som forutsier respons på standard CF-terapi.
Siden rutine histopatologiske teknikker ofte ikke fører til en definitiv diagnose av magekreft, kan tilsetningen av en miRNA signatur fra slike pasientprøver forbedre nøyaktigheten av en diagnose av magekreft. I tidligere miRNA microarray studier av magekreft, ble kontroll vev oppnådd fra regioner i magesekken av magekreftpasienter som var bestemt til å være histologisk normale og ikke fra mage vev av friske normale frivillige [6, 7]. Siden molekylære forandringer er ofte funnet i histologisk normal-vises vev ved siden av svulstvev, valgte vi å innhente kontroll vev fra endoskopiske biopsiprøver fra normale, kreftfrie frivillige. De fleste av de differensielt uttrykte mirnas rapportert å være karakteristisk for magekreft i tidligere studier microarray [6, 7] ble også identifisert innen magekreft signaturen i vår nåværende analyser. Men i tillegg til disse tidligere rapportert mirnas i magekreft, vi i tillegg identifisert potensielle tumor suppressor mirnas (ved P
< 0,05 [6] og P
< 0,01 [7], inkludert Mir-1 [8 , 9] og la-7 [10] at vi har funnet å være underexpressed i magekreft (ved P
< 0,001). (tabell 2) Interessant, Oh et al fant uttrykk for MIR-486 for å bli redusert i mange . gastriske cancere, i noen tilfeller forbundet med en genomisk tapet av en region [11] Vi har funnet MIR-486 som skal overuttrykt i vårt magekreft kohort av både microarray og Taqman PCR-analyse (Tilleggs fil 1: Figur S1). Det mulig at denne forskjellen i resultater skyldes svært ulike pasientpopulasjoner studert.
i denne studien rapporterer vi for første gang til vår kunnskap, en miRNA prediktor for responsen på CF terapi. den 58 miRNA signatur som gir en indeks for vurdere potensiell reaksjon på CF terapi kan være nyttig i stratifying pasientene inn i en gruppe som bør få standardbehandling og en gruppe som vil sannsynligvis ikke ha nytte av slik behandling og bør plasseres på en annen terapeutisk rettssak. Flere av de 58 mirnas vi identifisert i tabell 2 som er forbundet med TTP er i overensstemmelse med publiserte rapporter vedrørende deres ekspresjon med chemoresistance og tumorbiologi. Fremtredende blant de oppregulert mirnas forbundet med en forlenget TTP (definert av en farer forhold < 1) ble mirnas som har blitt vist å indusere apoptose i mage- og andre kreftceller, slik som MIR-16, la-7g, MIR-181, MIR-342, MIR-1 og MIR-34 [8, 12-18]. MIR-16 forsterker apoptose-induksjon ved nutlin og genistein [12], og modulerer multimedikamentresistens av humane magecancerceller [13].
Overekspresjon av la-7c eller la-7g har vist seg å redusere ekspresjon av Bcl-xL i Huh7 og HepG2-cellelinjer [14]. La-7g og MIR-181b er positivt korrelert med klinisk respons for tykktarmskreft til S-1, en muntlig fluorouracil [4]. MIR-181a og MIR-181b har vist seg å fungere som tumor demper som utløser veksthemming, indusere apoptose og hemme invasjon i glioma celler [15]. Tilberedning av HSA-MIR-342 i tykktarmskreft cellelinjen HT-29 induserer apoptose [16]. MIR-en sensitizes lungekreftceller til doksorubicin-indusert apoptose [8]. Ektopisk MIR-34 uttrykk induserer apoptose, cellesyklus arrest eller alderdom i normale og kreftceller [17]. Dermed ser overekspresjon av disse pro-apoptotiske mirnas i primærsvulster å være en svært gjennomgående trekk av pasienter som drar nytte av CF.
Interessant, identifiserte vi seks * mirnas som var knyttet til chemoresistance, inkludert MIR-518f *, speil 520A, MIR-520d *, MIR-519e *, MIR-363 *, og MIR-517 *, mens ingen mirnas var assosiert med kjemosensitivitet. Bare én Mir, Mir-302 *, ble identifisert i magekreft MIR signatur. MIR * s anses for å være passasjer tråder som er tenkt å bli degradert normalt fra pre-MIR som resulterer i den modne 22 nt tråd som går inn i RISC-komplekset. Funksjonene * mirnas fortsatt uklare, men det er mulig at de skyldes svekket behandling av pre-mirnas (Tchernitsa et al J for patologi, 2010) eller kan spille en rolle i målretting mRNA oversettelse (Gu og Lu, Plos One, 2010 ).
Vi observerte også at mens 21 mirnas ble funnet i felles mellom GC og chemoresistance miRNA signaturer, 37 mirnas var unik for kjemosensitivitet signatur.
Analyse av prøven par før og etter behandling fra 8 pasienter som i utgangspunktet svarte på CF terapi, men senere ble motstandsdyktig mot terapi fungert som en proof-of-prinsippet for å vise at den prediktive indeksen til 58 miRNA signatur ville bytte fra en gunstig indeks (på forbehandling scenen) til en ugunstig indeks ( post-behandling når motstanden utviklet). Dessverre var det ikke mulig å oppnå ytterligere tilpassede par av prøver fra pasienter lignende for å tilveiebringe en mer robust statistisk analyse. Ikke desto mindre, resultatene er i samsvar med en modell av klonal seleksjon av pre-eksisterende resistente svulster celler som befinner seg innenfor den primære tumoren.
I henhold til den konvensjonelle klonal seleksjon modell for utviklingen av ervervet resistens mot kjemoterapi motstand, motstand av innledningsvis responderende tumorer utvikler seg på grunn av den selektive utvekst av kjemoresistent kloner som allerede eksisterer inne i svulsten [18]. Gitt at en hurtig TTP angir spesifikt en iboende motstandsdyktighet overfor kjemoterapi [19], de 58 mirnas hvis uttrykk nivåer er korrelert med en kort TTP kan representere chemoresistance relaterte mirnas allerede er til stede i hoveddelen av tumorceller i den primære tumor. Men primære svulster som synes ikke å uttrykke denne miRNA underskrift av motstand, først svare på behandlingen inntil forhåndsdefinert, resistente celler selektivt vokse til tross for CF terapi. På det tidspunkt en prøve oppnås når motstanden blir observert, er mesteparten av tumoren uttrykker ugunstig, kjemoresistent miRNA signatur. Gitt at motstanden i de fleste av disse pasientene utvikler seg over en relativt kort periode (måneder, ikke år), virker det usannsynlig at motstands resultater fra opphopning av flere individuelle genetiske endringer.
Resultatene av denne studien gi nye og viktige data og miRNA signaturer, spesielt forutsi respons på CF terapi og angående fremveksten av tumorresistens. Men større studier må gjennomføres i fremtiden for å ytterligere bekrefte disse funnene og finne ut om de kan brukes i en klinisk setting.
Konklusjoner
Selv begrenset av den lille størrelsen på utvalget av valideringssettet, denne studien identifiserer mirnas som kan omfatte en klinisk relevant signatur for iboende motstand av magekreft til CF og foreslår at disse mirnas ble valgt for under utviklingen av ervervet chemoresistance. Siden dette miRNA prediktor kan muligens gi en nyttig guide til personlig kjemoterapi i fremtiden, garanterer det videre etterforskning og validering i store prospektive studier.
Metoder
Pasient innmelding og behandling
Vevsprøver var samlet på sykehuset i Korean National Cancer Center ved endoskopi 2001-2006 under en protokoll godkjent av Institutional Review Board (IRB) av National Cancer Center Hospital i Goyang, Korea. Alle pasienter og frivillige signert IRB-godkjent informert samtykke former. Valgbarhet for registrering i studien omfattet følgende parametre: 1) alder ≥ 18 år; 2) histologisk bekreftet adenokarsinom i ventrikkel; 3) dokumenterte fjernmetastaser; 4) andre enn magekreft ingen tidligere eller samtidig kreftformer; 5) ingen tidligere kjemoterapi, enten adjuvant eller palliativ; og 6) tilfredsstillende funksjon av alle viktige organer. 34 friske frivillige gjennomgikk gastroskopi for rutinemessig screening for magekreft og hadde normal mageslimhinnen ved histologi. Det var ingen gastritt blant de 34 friske frivillige.
Dette miRNA Studien er utført som en parallell studie til en studie av mRNA uttrykk analyse [20] for å identifisere mRNA prediktorer for chemoresistance. Nitti før behandling biopsiprøver innsamlet 2001-2006 ble analysert i denne miRNA studien. Etter en innledende endoskopisk biopsi, ble alle av de 90 pasienter som ble behandlet med cisplatin (60 mg /m 2, D1) i kombinasjon med enten fluorouracil (1 g /m 2 til 5 dager, n = 88) eller kapecitabin (Xeloda Roche, 1250 mg /m 2 ganger daglig i 2 uker, n = 2) hver 3. uke. Kliniske respondere ble bedt om å gjennomgå den andre endoskopi på tidspunktet progressiv sykdom (PD) ble observert i henhold til Verdens helseorganisasjon (WHO) kriterier. De følgende to kriterier ble brukt for å definere kliniske respondere: 1) pasienter med tumorer viste mer enn en reduksjon i summen av produktene av de to største perpendikulære diametre av målbare lesjoner i minst 4 uker 50%; eller 2) pasienter som ikke hadde målbar sykdom ved presentasjon og hatt en dramatisk nedgang i pleuravæske /ascites i minst 4 uker [21]. Etter behandling miRNA microarray data kan hentes fra prøver samlet når chemoresistance utviklet (PD) i 8 kliniske respondere. Post-behandlingsprøver ble samlet i minst 2 uker etter den siste dose av fluorouracil, og før andre kjemoterapi ble startet, for å unngå eventuelle akutte legemiddeleffekter for å påvirke ekspresjon profilen. For disse 8 kliniske respondere, pre- og postbehandlingsprøver (som ble samlet ved progressiv sykdom) representerer kjemosensitiv og kjemoresistent svulster, henholdsvis. Forbehandling prøver fra de resterende 82 pasientene ble brukt til å identifisere en miRNA prediktor for kjemoterapi respons. Dette prediktor ble brukt til 8 prøve parene samlet inn fra de samme pasientene før og etter behandling. Den spådommen ble ansett riktig hvis etterbehandling prøvene ble tildelt en høyere prediktiv indeks for chemoresistance enn før behandling prøver. Biopsiprøver ble likeledes samlet inn fra 34 friske frivillige.
Vevsprøver som inneholder minst 50% tumorceller ble bearbeidet for RNA som tidligere beskrevet [22]. De ekstraherte RNA ble analysert ved hjelp av Agilent Bioanalyzer 6000 Total RNA-analyse og Nanodrop spektrofotometer følgende produsentens protokoller. 500 ng av total RNA ble underkastet en tilpasset miRNA microarray. En blanding av total RNA isolert fra tre mage kreft cellelinjer (SNU-601, SNU-638, og AGS) ble brukt som referanse RNA for konkurranse hybridisering.
Microarray eksperiment
miRNA microarray utforming
Laboratory Molekylær Technology (LMT) _miRNA_v2 microarray er designet ved hjelp av Sanger miR9.0 database (http:... //mikroRNA sanger ac uk) og produsert som en skredder syntetisert 8 × 15 K mikromatriser (Agilent Technologies, San Jose, California). Det er totalt 4,361 miRNA oppføringer i miR9.0 database. Noen av mirnas har nøyaktige sekvenser fra forskjellige arter. Vi har kollapset databasen til 1,667 unike modne miRNA sekvenser på tvers av alle arter, inkludert menneske, mus, rotte, etc. De modne miRNA sekvenser ble inkorporert i 60-mer lange oligonukleotid-prober med en linkersekvens på 3'-enden for å separere miRNA sekvensene bort fra glassglideflate. Linkersekvensen var et proprietært sekvens fra Agilent som har minimal homologi til en hvilken som helst sekvens i GenBank. Hver modne miRNA er representert med + og - (revers komplement) tråd sekvenser. Dette gjør det mulig for microarray for å brukes med forskjellige merkingsprotokoller. Avhengig av protokollen, kan en av sondene også tjene som en negativ kontroll. Hver probe har 4 replikater innenfor hver microarray, og gir tekniske replikater for måling av konsistens og ytelse av microarray. I sammendraget, hver unike moden miRNA representert ved 8-prober (4 + tråd og 4 - tråd). Totalt 3,556 unike LMT seq IDer (miRNA, positive og negative kontroller, +/- Strand) var på microarray, hver med 4 gjentak. http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070

• En blandet befolkning av Helicobacter pylori, Helicobacter bizzozeronii og "Helicobacter heilmannii" i mageslimhinnen av en huskatt
• Eksperimentell modell av mild diabetes: langsiktig evaluering av glykemisk profil og mage kontraktilitet hos rotter