miRNA podpis spojená s výsledkami u pacientov s karcinómom žalúdka nasledujúcich chemotherapy

miRNA podpisu spojeného s výsledkami u pacientov s karcinómom žalúdka po chemoterapii
abstraktné
pozadia
identifikáciu pacientov, ktorí pravdepodobne budú alebo nebudú mať prospech z cytotoxickej chemoterapie za použitia biomarkery by mohlo výrazne zlepšiť klinické riadenie, ktoré vykonávajú lepšie určiť vhodné možnosti liečby pre pacientov. mikroRNA môžu byť potenciálne užitočné markery, ktoré pomáhajú riadiť individualizovanú liečbu rakoviny, pretože microRNA výraz ich poškodeniu pri liečbe rakoviny. Aby bolo možné identifikovať miRNA podpisy pre karcinóm žalúdka a pre predpoveď klinické rezistenciu k chemoterapii cisplatina /fluorouracil (CF), komplexnú analýzu miRNA microarray bola vykonaná s použitím endoskopickej biopsie vzoriek.
Metódy
Biopsie boli odobraté pred chemoterapiou z 90 pacientov s rakovinou žalúdka liečených CF a od 34 zdravých dobrovoľníkov. V čase progresie ochorenia, vzorky po liečbe boli dodatočne zhromaždené z 8 klinických respondérov. miRNA expresie bola stanovená pomocou špeciálne navrhnutý Agilent mikročipu. bol identifikovaný za účelom identifikácie podpis miRNA rezistencie chemoterapii, sme korelovali hladiny miRNA expresie pokiaľ ide o čas do progresie (TTP) ochorenie po liečbe CF.
Výsledky
miRNA podpisu rozlišovať rakovinu žalúdka od normálneho žalúdka epitelu. 30 miRNA významne negatívne koreluje s TTP, zatiaľ čo 28 miRNA významne pozitívne koreluje s TTP 82 pacientov s rakovinou (P Hotel &0,05). Prominentný medzi up-regulovaná miRNA spojených s chemosenzitivity boli miRNA je známe, že regulujú apoptózu, a nechal-7g, MIR-342, MIR-16, MIR-181, MIR-1, a mier-34. Keď bol tento 58-miRNA prediktor aplikovaná do samostatného súboru pred a po liečbe nádorových vzoriek od 8 klinických respondentov, všetky vzorky pred začatím liečby 8 boli správne predpovedal s nízkym rizikom, zatiaľ čo vzorky z post-ošetrenie nádory, ktoré sa vyvíjali chemorezistenci sa predpokladá, že do kategórie vysoko rizikové u miRNA podpisom 58, čo naznačuje, že výber pre vyjadrenie týchto miRNA došlo v chemorezistence vznikol.
závery
sme identifikovali 1) miRNA výraz podpis ktorá odlišuje karcinómu žalúdka z normálnej žalúdočné epitel od zdravých dobrovoľníkov, a 2) chemoreresistance miRNA výraz podpis, ktorý je v korelácii s TTP po liečbe CF. Chemorezistence miRNA výraz podpis zahŕňa niekoľko miRNA skôr preukázané, že regulujú apoptózu in vitro stroje a warranty ďalším potvrdením.
Pozadie
miRNA sú krátke (~ 22 nukleotidov), nekódujúca RNA, ktoré regulujú génovú expresiu primárne translačný represie alebo transkripčný degradácie [1]. miRNA majú veľký potenciál ako rakovinových biomarkerov, pretože ich expresiu tkanivovo špecifickú a ich aberantne expresie v nádorových bunkách [2]. Navyše, miRNA majú dôležité funkcie v regulácii bunkového cyklu a apoptózy. Expresie miRNA môže byť ich poškodeniu pri rakovine pomocou rôznych mechanizmov, vrátane reguláciu transkripcie, amplifikácie, delécie, mutácie, a epigenetické umlčanie [3]. Tak mikroRNA môžu byť potenciálne užitočné markery, ktoré pomáhajú riadiť individualizovanú terapiu.
Identifikáciu pacientov, ktorí pravdepodobne budú alebo nebudú ťažiť z cytostatík cez použitie biomarkerov by mohlo výrazne zlepšiť klinické riadenie, ktoré vykonávajú lepšie určiť vhodné možnosti liečby pre pacientov. Väčšina predchádzajúcich štúdií, ktoré sa snažia identifikovať miRNA prediktory chemorezistence v rakoviny skúmali iba jednotlivé miRNA [4]. Doteraz jediný zverejnená analýza s vysokou priepustnosťou microarray bol vyhodnotený miRNA expresie podpisov ako prediktory rezistencie chemoterapia v metastatických solídnych nádorov pacientov [5]. V tomto miRNA microarray štúdie ovariálnych karcinómov štádium III-IV, nech-7i bolo zistené, výraz, ktorý má byť významne znížená u pacientov s chemoterapiou 27 odolných v porovnaní s 42 kompletných odpoveďou, aj keď neboli žiadne nezávislé overenie kohorta [5].
tu nájdete výsledky prospektívnej štúdie využívajúce vysoko výkonných nástrojov analýzy miRNA microarray, v ktorom má výraz podpis miRNA bolo zistené, že rozlišuje žalúdočné rakovinu žalúdka od normálneho epitelu. Ďalej sme identifikovali druhý podpis, ktorý je korelovaný s časom do progresie (TTP) u pacientov s rakovinou žalúdka liečených cisplatinou a fluorouracilu (CF), referenčné chemoterapiu režimu pre rakovinu žalúdka. môžu byť použité tieto podpisy miRNA potenciálnych biomarkerov na pomoc pri diagnóze rakoviny žalúdka v ťažkých prípadoch a predikovať odozvu u pacientov s karcinómom žalúdka na CF terapiu.
Výsledky
identifikácia karcinómu žalúdka miRNA podpisu
deväťdesiatich predbežnej úpravy žalúdočné rakovina rezy boli pre túto analýzu a ich klinicko-patologické charakteristiky sú uvedené v tabuľke 1. Všetci pacienti mali metastatické ochorenie v čase zaradenia do štúdie a po endoskopické vzorky z biopsie tkaniva boli zhromaždené, boli pacienti liečení cisplatinou a fluórouracil (alebo kapecitabínom ) kombinovaná chemoterapia. Všetky microarray dáta bola uložená v GEO a je k dispozícii po zverejnení. Recenzent prístup: http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070Table 1 klinicko-patologické charakteristiky pacientov

žalúdka pacienta s rakovinou
zdravými dobrovoľníkmi

Školenia
nastaviť
proof-of-princíp
Test set
(odpovedač)
EU Počet
82
8
34
Age - yr
medián
56
56
48
medzikvartilové pohybujú
(44-63)
(44-58)
( 43-57)
sex - no. (%)
Male
64 (78,0%)
7 (87,5%)
23 (67,6%)
Žena
18 (22,0%)
1 (12,5% )
11 (32,4%) stav
výkonu (PS) - no. (%)
ECOG1 PS 0 alebo 1
73 (89,0%)
8 (100%)
ECOG PS 2 alebo 3
9 (11,0%)
0
histologický typ - no. (%)
Lauren črevnej
34 (41,5%) Sims 3 (37,5%)
Lauren difúznych
48 (58,5%)
5 (62,5%)
Umiestnenie primárne lézie - no. (%)
Horná tretina
11 (13,4%)
1 (12,5%)
Stredná tretina
18 (22,0%)
5 (62,5%)
Dolné tretina
43 (52,4%)
1 (12,5%)
celý žalúdok
10 (12,2%)
1 (12,5%)
chemoterapie - no , (%)
Cisplatina /Fluorouracil
80 (97,6%)
8 (100%)
Cisplatina /kapecitabín
2 (2,4%)
0
* relatívna intenzita dávky -%
Median
81,2
76,6
medzikvartilové pohybujú
(75.3-87.3)
(64,7 - 84,9) EU Počet cyklov chemoterapie
Median
4.
10
medzikvartilové pohybujú
(2-5)
(7-11)
chemoterapia odpoveď (WHO kritériá) Nie (%)
PR2
16 (24,6% )
6 (100%)
SD3
25 (38,5%)
PD4
24 (36,9%)
nemerateľných
16
2
Unevaluable
1
druhej línie chemoterapie
55 (67,1%)
6 (75,0%)
Medián sledovania pre pozostalých
35,5 mesiaca -
Celkové prežitie - . mo
Median
8,2
16
medzikvartilové pohybujú
(8 /06-5 /10)
(11.3-26.7)
čas do progresie - mo.
Median
3,1
8,2
medzikvartilové pohybujú
(2.5-3.9)
(4.3-21.2)
1Eastern Cooperative Oncology Group, 2partial odozvy, 3stable ochorenia, ochorenia 4progressive
* Relatívna intenzita dávky
* Priemer relatívne intenzity dávky cisplatiny a fluorouracilu. Intenzita dávka je definovaná ako množstvo liečiva podávaného za jednotku času, vyjadrené v miligramoch na meter štvorcový za týždeň. Relatívna intenzita dávka je definovaná ako skutočné intenzity dávky vzhľadom na plánovanej intenzity dávky každého lieku.
Najprv sme v porovnaní miRNA profily z 90 vzoriek pred liečbou získaných od pacientov s karcinómom žalúdka expresnými dátami miRNA z 34 normálnych slizníc bioptických vzoriek žalúdočnej získané od zdravých dobrovoľníkov (obrázok 1). Aby bolo možné odhadnúť prediktívne schopnosť rakovinových špecifické miRNA profilov, predikcia trieda analýzy boli vykonané aj náhodne rozdelia celý vzorku do dvoch (trénovací a testovacie) podmnožín v pomere 1 ku 1. Randomizácia bola vykonaná pomocou softvéru nQuery Advisor (verzia 7.0, Štatistická Solutions, Saugus, MA). Potom trieda označenie každej vzorky v skúšobnej sade bola predpovedaná pre každý zo 100 náhodných prípravy na testovanie oddiely podľa zlúčenina kovariancie prediktor (CCP), diagonálne lineárne diskriminačné analýzy (LDA), 1- a 3-najbližších susedov (NN) najbližšie, ťažisko (NC), a podpora vektor stroj (SVM). Pri výbere funkcií P
menšie ako 0,05, stredná presnosti predikcie v testovacích súprav bola viac ako 90% vo všetkých klasifikátormi (91,9%, 90,3%, 90,3%, 93,5%, 93,5% a 91,9%, pre CCP, LDA, 1-NN, 3-NN, NC, a SVM ,, v tomto poradí), v 100 náhodných oddiely školenia-to-testu. Obrázok 1 Štúdia schéma pre identifikáciu a testovanie miRNA prediktívne odolnosti voči CF.
Tabuľka 2 uvádza miRNA, ktoré sú odlišne exprimovaných medzi 90 žalúdočných rakovinových nádorov a 34 normálnych vzoriek pri výbere funkcií P Hotel < 0,005. Mnoho miRNA, ktoré sú nadmerne exprimované v žalúdočnej skupiny rakoviny patrí k Mir-17-92 a 106b-25 klastrov, ako už bolo hlásených [6, 7]. Kvantitatívny real-time reverznej transkripcie PCR (Q-RT-PCR) analýzy potvrdili diferenciálnej expresie niektorých z týchto miRNA vo vzorkách s karcinómom žalúdka (obrázok 2). Aj keď MIR-25 významne bola up-regulovaná pomocou analýzy poľa v nádoroch, sa to nie je štatisticky významný od Q-PCR, pravdepodobne z dôvodu obmedzeného počtu vzoriek, ktoré boli k dispozícii pre test. Aj keď predchádzajúce štúdie uvádza, že mier-486 sa downregulated u karcinómu žalúdka, sme zistili, že expresia MIR-486, ktoré majú byť zvýšené v našom súbore pacientov s rakovinou žalúdka ako Microarray a Q-PCR (ďalšie súbor 1: Obrázok S1) .Table 2 miRNA rozdielne vyjadrené v rakovinou žalúdka a normálnym žalúdka epitelu.
nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka
p
FDR
pomer
HSA-MIR-25 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
1,64
HSA-MIR-106b Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
1,85
HSA-MIR-93 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
1,49
HSA-MIR-503 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
2,17
HSA-MIR-18a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
2.27
hsa-miR-224
1.00E-07
2.59E-06
3.85
hsa-miR-451
1.00E-07
2.59E-06
3.23
hsa-miR-18b
2.00E-07
4.60E-06
2.17
hsa-miR-17-5p
2.00E-06
3.60E-05
1.61
hsa-miR-486-5p
3.00E-06
5.18E-05
2.22
hsa-miR-144
9.60E-06
0.000159
5.56
hsa-miR-552
1.03E-05
0.000164
2.38
hsa-miR-425-5p
1.32E-05
0.000195
1.35
hsa-miR-92
1.88E-05
0.000268
1.39
hsa-miR-106a
2.61E-05
0.000347
1.52
hsa-miR-223
2.68E-05
0.000347
2.13
hsa-miR-205
2.98E-05
0.000363
4.76
hsa-miR-196b
4.42E-05
0.000508
1.67
hsa-miR-19a
0.0001836
0.00181
1.69
hsa-miR-191
0.0003112
0.0028
1.27
hsa-let-7i
0.0004468
0.00385
1.20
hsa-miR-185
0.0004764
0.00394
1.32
hsa-miR-769-5p
0.0006683
0.00532
1.37
hsa-miR-196a
0.0008274
0.00646
1.45
hsa-miR-301
0.0009715
0.00745
1.82
hsa-miR-21
0.0012598
0.00948
1.49
hsa-miR-130b
0.0015411
0.0112
1.30
hsa-miR-19b
0.0015959
0.0114
1.39
hsa-miR-424
0.0019249
0.0135
1.52
hsa-miR-484
0.0020451
0.0139
1.33
hsa-miR-767-5p
0.0048511
0.03
1.64
hsa-miR-183
0.0050428
0.0305
1.52
hsa-miR-210
0.0053848
0.0318
1.35
hsa-miR-302c*
0.006328
0.0364
1.41
hsa-miR-520g
0.0070896
0.0402
2.13
hsa-miR-324-5p
0.0095742
0.0497
1.23
hsa-miR-103
0.0095861
0.0497
1.16
hsa-miR-376b
0.0096083
0.0497
1.85
hsa-miR-151
0.0100422
0.0513
1.20
hsa-miR-596
0.011231
0.0556
1.61
hsa-miR-545
0.011422
0.0556
1.69
hsa-miR-221
0.0129139
0.0608
1.27
hsa-miR-20a
0.0133176
0.0619
1.35
hsa-miR-181b
0.0148487
0.0655
1.28
hsa-miR-181d
0.0154891
0.0668
1.16
hsa-miR-623
0.0189476
0.0809
1.43
hsa-miR-519d
0.0220958
0.0915
1.59
hsa-miR-563
0.0229302
0.094
1.37
hsa-miR-505
0.0241657
0.097
1.25
hsa-miR-107
0.0242694
0.097
1.11
hsa-miR-320
0.0282982
0.111
1.20
hsa-miR-96
0.0285699
0.111
1.39
hsa-miR-339
0.0312524
0.12
1.32
hsa-miR-181a
0.0318141
0.121
1.20
hsa-miR-345
0.0322275
0.121
1.19
hsa-miR-20b
0.0325811
0.122
1.28
hsa-miR-33b
0.0339343
0.125
1.64
hsa-miR-135b
0.0352682
0.129
1.59
hsa-miR-431
0.0374687
0.134
1.41
hsa-miR-193a
0.0377098
0.134
1.35
hsa-miR-550
0.0380645
0.134
1.30
hsa-miR-565
0.0446875
0.15
1.20
Underexpressed v rakovinou žalúdka
p
FDR
Ratio
HSA-MIR-146a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,39
HSA-MIR-133a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,34
HSA-MIR-625 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,56
HSA-MIR-375 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,27
HSA-MIR-133b Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,32
HSA-MIR-195 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,47
HSA-MIR-148a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,47
HSA-MIR-1 Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0,27
HSA-MIR-26a Hotel < 1e-07 Hotel < 1e-07
0.67
hsa-miR-204
2.00E-07
4.60E-06
0.26
hsa-let-7c
7.00E-07
1.53E-05
0.74
hsa-let-7a
9.00E-07
1.86E-05
0.72
hsa-let-7g
1.10E-06
2.17E-05
0.71
hsa-miR-497
1.70E-06
3.20E-05
0.56
hsa-miR-26b
1.28E-05
0.000195
0.58
hsa-miR-145
2.04E-05
0.000282
0.65
hsa-miR-34a
2.89E-05
0.000363
0.75
hsa-miR-143
4.28E-05
0.000506
0.63
hsa-miR-650
9.15E-05
0.00101
0.57
hsa-miR-150
9.25E-05
0.00101
0.49
hsa-miR-768-5p
0.0001037
0.0011
0.65
hsa-let-7d
0.0001302
0.00132
0.76
hsa-miR-203
0.0001311
0.00132
0.52
hsa-miR-29c
0.0002112
0.00203
0.52
hsa-let-7f
0.0002446
0.0023
0.69
hsa-miR-30d
0.0002592
0.00238
0.78
hsa-miR-642
0.0004345
0.00383
0.62
hsa-miR-30c
0.0004556
0.00385
0.75
hsa-miR-155
0.0004998
0.00406
0.66
hsa-miR-34b
0.0013651
0.0101
0.64
hsa-miR-551b
0.0019808
0.0137
0.53
hsa-miR-28
0.0027537
0.0184
0.85
hsa-let-7e
0.0034793
0.0227
0.84
hsa-let-7b
0.0035019
0.0227
0.85
hsa-miR-212
0.0039061
0.0249
0.76
hsa-miR-564
0.0047906
0.03
0.72
hsa-miR-770-5p
0.0050814
0.0305
0.71
hsa-miR-30b
0.0060842
0.0355
0.76
hsa-miR-30a-5p
0.0077597
0.0434
0.80
hsa-miR-199b
0.0083572
0.0461
0.67
hsa-miR-125a
0.0085563
0.0466
0.77
hsa-miR-621
0.0093423
0.0497
0.69
hsa-miR-31
0.0106862
0.054
0.66
hsa-miR-365
0.0113404
0.0556
0.78
hsa-miR-381
0.0123061
0.0592
0.70
hsa-miR-626
0.0128738
0.0608
0.78
hsa-miR-127
0.0138033
0.0635
0.69
hsa-miR-660
0.0142991
0.0651
0.75
hsa-miR-342
0.0146193
0.0655
0.75
hsa-miR-146b
0.0148729
0.0655
0.77
hsa-miR-361
0.0152056
0.0663
0.86
hsa-miR-489
0.0191692
0.081
0.71
hsa-miR-29a
0.0204334
0.0854
0.79
hsa-miR-95
0.0243644
0.097
0.54
hsa-miR-567
0.0265025
0.104
0.54
hsa-miR-152
0.0376121
0.134
0.78
hsa-miR-429
0.0378151
0.134
0.65
hsa-miR-200b
0.0396617
0.138
0.75
hsa-miR-504
0.0412648
0.142
0.63
hsa-miR-668
0.041717
0.143
0.77
hsa-miR-186
0.0437991
0.149
0.83
hsa-miR-135a
0.0468793
0.157
0.58
hsa-miR-485-5p
0.047683
0.158
0.82
Obrázok 2 Overenie expresie MIR kvantitatívnej real-time reverznej transkripcie PCR (Q-RT-PCR). Q-RT-PCR analýzy MIR-18a, Mir-25, Mir-1 a Let-7g v 4 normálne (znázornené na bielom
) a 4 vzoriek rakoviny (uvedené v čiernej farbe
), čo potvrdzuje nadmerne expresie Mir-18a a mier-25 a pod expresie Mir-1 a nechať-7g, ako bolo pozorované v dátach microarray vzoriek s rakovinou. Študent t-test P
hodnotu medzi 4 a normálne 4 vzoriek rakoviny je uvedené pre každý miRNA. Zložiť zmeny (FC) -1 označuje, 50% zníženie v RNU6 normalizovaná expresie danej miRNA.
Identifikácia podpisu miRNA na odolnosť voči terapii CF
Čas do progresie (TTP), nie RTG odpoveď, bol použitý ako klinický ukazovateľ pre reakciu na chemoterapiu, a to predovšetkým preto, že sme si priali, aby zahŕňala pacientov, ktorí nemali merateľné ochorenie s použitím štandardných zobrazovacích metód. Ak chcete definovať z 82 vzoriek, ako je školenie nastavená na rozvinúť prediktor (obrázok 1). Tieto vzorky 82 predčistenia boli zozbierané od pacientov, ktorým nebola vykonaná druhá biopsia. Päťdesiat osem miRNA významne koreluje s TTP z týchto 82 pacientov (funkcia P Voľba
hodnotou menšou než 0,05) (tabuľka 3). Zvýšená expresia 30 miRNA bola spojená s oneskoreným TTP na to, že nadmerná expresia miRNA 28 bol spojený s rýchlejší TTP. Šesť * miRNA, ktoré boli spojené s chemorezistence vrátane MIR-518f *, MIR-520A, MIR-520D *, MIR-519e *, MIR-363 *, a mier-517 *, zatiaľ čo nie * miRNA boli spojené s chemosensitivity.Table 3 miRNA, ktorých expresia je spojená s chemosenzitivity alebo chemorezistence.
miRNAa ktorých expresia je spojená s chemorezistence
p
FDR

Hazard Ratio

hsa-miR-526a
0.0000
0.0103
1.482
hsa-miR-122a
0.0002
0.0379
1.545
hsa-miR-518f*
0.0004
0.0537
1.298
hsa-miR-591
0.0007
0.0598
1.492
hsa-miR-524-3p
0.0010
0.0682
1.268
hsa-miR-320
0.0013
0.0701
1.865
hsa-miR-520a*
0.0014
0.0701
1.252
hsa-miR-183
0.0031
0.119
1.39
hsa-miR-516-5p
0.0034
0.119
1.306
hsa-miR-629
0.0036
0.119
1.42
hsa-miR-595
0.0043
0.119
1.858
hsa-miR-640
0.0054
0.132
1.3
hsa-miR-520d*
0.0063
0.143
1.326
hsa-miR-519e*
0.0091
0.164
1.24
hsa-miR-363*
0.0096
0.166
1.407
hsa-miR-513
0.0137
0.193
1.347
hsa-miR-328
0.0163
0.211
1.736
hsa-miR-519a
0.0170
0.211
1.118
hsa-miR-185
0.0189
0.217
1.697
hsa-miR-658
0.0200
0.223
1.532
hsa-miR-517*
0.0218
0.226
1.305
hsa-miR-515-5p
0.0349
0.301
1.145
hsa-miR-519c-5p
0.0368
0.304
1.157
hsa-miR-661
0.0392
0.315
1.437
hsa-miR-182
0.0416
0.315
1.408
hsa-miR-206
0.0417
0.315
1.606
hsa-miR-193b
0.0419
0.315
1.433
hsa-miR-601
0.0436
0.317
1.599
miRNA, ktorých expresia je spojená s chemosenzitivity
p
FDR
Hazard Ratio
hsa-miR-195
0.0007
0.0598
0.593
hsa-miR-146b
0.0016
0.0733
0.565
hsa-miR-26b
0.0037
0.119
0.686
hsa-miR-374
0.0042
0.119
0.84
hsa-miR-199b
0.0051
0.132
0.729
hsa-miR-132
0.0068
0.143
0.62
hsa-miR-140
0.0069
0.143
0.759
hsa-miR-487b
0.0088
0.164
0.679
hsa-let-7g
0.0091
0.164
0.539
hsa-miR-340
0.0103
0.171
0.82
hsa-miR-155
0.0109
0.174
0.704
hsa-miR-95
0.0115
0.176
0.856
hsa-miR-186
0.0137
0.193
0.662
hsa-miR-130a
0.0140
0.193
0.72
hsa-miR-342
0.0151
0.202
0.685
hsa-miR-577
0.0173
0.211
0.804
hsa-miR-128b
0.0184
0.217
0.701
hsa-miR-146a
0.0209
0.226
0.776
hsa-miR-16
0.0214
0.226
0.698
hsa-miR-503
0.0241
0.243
0.721
hsa-miR-224
0.0259
0.25
0.853
hsa-miR-223
0.0259
0.25
0.794
hsa-miR-128a
0.0294
0.276
0.704
hsa-miR-181b
0.0300
0.276
0.668
hsa-let-7f
0.0312
0.281
0.725
hsa-miR-1
0.0339
0.298
0.839
hsa-miR-421
0.0367
0.304
0.738
hsa-miR-127
0.0404
0.315
0.783
hsa-miR-34c
0.0435
0.317
0.74
hsa-miR-497
0.0493
0.351
0.769
Obrázok 3 znázorňuje krivku Kaplan-Meier u rizikových skupín, rozdelených podľa týchto 58 miRNA. Obmena hladina významnosti pre log-rank štatistikou voľno-one-out cross-potvrdených Kaplan-Meierove krivky bol 0,021, čo naznačuje, že spojenie medzi miRNA expresných dát TTP je štatisticky významný. Obrázok 3 Kaplan-Meierove krivky času do progresie (TTP) 2 rizikových skupín rozložená podľa vyjadrenia 58 miRNA korelovaných s TTP pri výbere funkcie P < 0.05. Združenie miRNA expresných dát do TTP zo bol štatisticky významný (permutácie P
hodnota log-rank štatistiky cross-overená Kaplan-Meierove krivky = 0,021).
Vyjadrenie podpisu chemorezistence koreluje s vývojom v chemorezistence nádory, ktoré boli predtým chemosenzitivních
podpis 58 miRNA sú uvedené vyššie je prediktívne pre identifikáciu pacientov, ktorí sú alebo nie je pravdepodobné, že priaznivo reagujú na liečbu CF. nastolila sme, že u pacientov, ktorí boli pôvodne dokázané priaznivé 58 miRNA výraz podpis by prejsť na nepriaznivé expresie podpis v čase, keď vyvinula rezistencia na terapiu CF. Za účelom testovania tejto možnosti vo forme proof-of-princípe, 8 párov testovacie sada vzoriek (endoskopicky získanej pred a po liečbe) boli odobraté z 8 pacientov, ktorí pôvodne dokázala klinickou odpoveď na liečbu CF ale kto nakoniec ukázala progresívne ochorenie kedy odfotil druhá endoskopické biopsie. Ako je uvedené v tabuľke 4, všetky z 8 vzoriek pred liečbou z klinických odpovedí boli správne predpovedal 58-miRNA prediktor byť v skupine s nízkym rizikom (presnosť, 100%). Najmä, 6 z 8 párov boli správne identifikované pre chemosenzitivity (tj
., Po liečbe, vzorky boli priradené vyššie prediktívne index pre chemoterapiu odpoveď, než pre predbežnú úpravu vzoriek, a preto sa predpokladá, že je odolnejšia proti terapiu) (presnosť, 75% ). Keď bola rovnaká predikcie vykonaná za použitia P
hodnotu výber funkcie 0,01, je výsledkom predikcia zostala rovnaká (tabuľka 4) .Table 4 predikcie chemorezistence v testovanom súbore proof-of-princíp
ID vzorky
spoločností výber funkcií P < 0,05


výbere funkcie P < 0,01


Predictive
Index
Percentile1

Prediction
For
Pretreatment
Sample2

Overall
Prediction3


Predictive
Index
Percentile

Prediction
for
Pretreatment
Sample

Overall
Prediction

1 pre
39%
nízka
nesprávne
35%
nízka
nesprávne
Príspevok: 1
22%
24%
2 pre
48%
nízka
opraviť
49%
nízka
správnej
2 po
79%
77% Sims 3 pre
55%
nízka
opraviť
46%
nízka
správnej Sims 3 po
73%
77%
4 pre
13%
nízka
správne
24%
nízka
správnej
4 po
72%
73%
5 pre
31%
nízka
správne
33%
nízka
správnej
5 po
48%
46%
6 pro
13%
nízka
opraviť
27%
nízka
správnej
6 po
16%
66%
7 pro
7%
nízku
opraviť
12%
nízka
správnej príspevok
7
66%
57%
8 pre
52%
nízka
nesprávne
50%
nízka
nesprávne
po 8
17%
24%
1Tento prediktívne index bol vypočítaný pre každú vzorku od tohto strážené hlavné metódy komponentov, kde je vysoká hodnota indexu prediktívne zodpovedá rýchlemu postupu po chemoterapii (tj
., krátka TTP). V prípade, že prediktívne index vzorky pri skúške podľa zodpovedal strednej prediktívne indexu trénovacej množiny, vzorka bol pridelený 50% prediktívne index.
2 Jednotlivé riziko bolo predpovedané nízka, ak prediktívne index percentil vzorky pred liečbou bol menej ako 67%
3The predikcie bolo považované za správne, ak vzorky po liečbe bolo pridelené vyššie prediktívne index ako vzorky pred začatím liečby.
Diskusia
Táto štúdia bola použitá perspektívna prístup k identifikácii podpis miRNA pre žalúdočných rakovina vs. normálne žalúdočnej epitelu a podpis miRNA, ktorá predpovedá odpoveď na štandardnú terapiu CF.
Vzhľadom k tomu, rutinné Histopatologické techniky niekedy nevedú k definitívnej diagnóze rakoviny žalúdka, pridanie podpisu miRNA z týchto vzoriek pacientov môže zlepšiť presnosť diagnózy rakoviny žalúdka. V predchádzajúcich miRNA microarray štúdium rakoviny žalúdka, kontrolné tkanivá boli získané z oblastí žalúdka pacientov, karcinómov žalúdka, ktoré boli určené ako histologicky normálna a nie je proti žalúdočnej tkaniva zdravých zdravých dobrovoľníkov [6, 7]. Vzhľadom k tomu, molekulárnej abnormality sa často nachádzajú v histologicky normálne vyzerajúci tkaniva priliehajúce k nádorovom tkanive, rozhodli sme sa získať kontrolu tkaniva pred endoskopických bioptických vzoriek od normálnych, rakovina bez dobrovoľníkov. Väčšina z odlišne exprimovaných miRNA hlásených za charakteristické pre rakovinu žalúdka v predchádzajúcich štúdiách microarray [6, 7], boli identifikované v žalúdku podpise rakoviny v našich súčasných analýzach. Avšak, okrem nich bolo oznámené predtým miRNA v karcinómu žalúdka, sme ďalej identifikovať potenciálne tumor supresorové miRNA (u P
menšie ako 0,05 [6] a P
< 0,01 [7], vrátane Mir-1 [8 , 9] a nechal-7 [10], že sa zistilo, že sa underexpressed v karcinómu žalúdka (u P Hotel &0,001) (tabuľka č. 2) je zaujímavé, Oh et al nájdených expresie MIR-486, ktoré majú byť znížené v mnohých , karcinómov žalúdka, v niektorých prípadoch spojená s genómovej stratou tejto oblasti [11] Zistili sme, MIR-486, ktoré majú byť nadmerne exprimovaný v našom žalúdku rakoviny kohorty ako microarray a analýzou TaqMan PCR (ďalší súbor 1: Obrázok S1). je možné, že tento rozdiel vo výsledkoch, je vzhľadom na veľmi rozdielne skupiny pacientov študovaný.
v tejto štúdii sme sa hlási prvýkrát je nám známe, je miRNA prediktor pre odpoveď na CF terapiu. 58. miRNA podpis, ktorý poskytuje index pre posúdenie možného odpovede na liečbu CF môžu byť užitočné pre rozvrstvenie pacientov do skupiny, ktoré by mali získať štandardnú liečbu a skupinu, ktorá pravdepodobne nebude mať prospech z takejto liečby, a by mal byť umiestnený na inom liečebné štúdii. Niekoľko z 58 miRNA sme uvedených v tabuľke 2, ktoré sú spojené s TTP sú v súlade s publikovanými správami sa týkajú ich expresie sa chemorezistence a biológie nádorov. Prominentný medzi up-regulovaná miRNA spojených s predĺženým TTP (definované nebezpečnosť pomere menej ako 1) sa miRNA, ktoré indukujú apoptózu v žalúdku a iných nádorových buniek, ako sú napríklad MIR-16, nech-7g, MIR-181, MIR-342, MIR-1, a mier-34 [8, 12-18]. MIR-16 zvyšuje indukcie apoptózy pomocou nutlin a genisteínu [12], a moduluje liečivám odolnosť ľudských buniek karcinómu žalúdka [13].
Nadmerná expresia rokov-7c, alebo nechať-7 g bolo preukázané, že zníženie expresie Bcl-XL na Huh7 a HepG2 bunkové línie [14]. Let-7 g a mier-181b sú pozitívne korelované s klinickou odozvu rakoviny hrubého čreva na S-1, ústna fluorouracil [4]. Mir-181 a mier-181b bolo preukázané, že fungujú ako nádorové supresormi, ktoré vyvolávajú inhibíciu rastu, indukovať apoptózu a inhibujú inváziu gliomových buniek [15]. Rekonštitúcia HSA-MIR-342 v kolorektálneho karcinómu bunkovej línie HT-29 indukuje apoptózu [16]. Mir-1 zvyšuje citlivosť buniek pľúcneho karcinómu na doxorubicín-indukovanej apoptóze [8]. Ektopická expresia MIR-34 indukuje apoptózu, zástavu bunkového cyklu alebo starnutia v normálnych a nádorových bunkách [17]. Preto sa zdá byť veľmi konzistentné rys pacientov, ktorí ťažia z FS
Zaujímavé je zvýšená expresia týchto pre-apoptotických miRNA v primárnych nádorov, sme identifikovali šesť * miRNA, ktoré boli spojené s chemorezistence vrátane MIR-518f *, spätných 520A, mier-520d *, MIR-519e *, MIR-363 *, a mier-517 *, zatiaľ čo žiadne miRNA boli spojené s chemosenzitivity. Iba jeden pokoj, pokoj-302 *, bol identifikovaný v žalúdočnej rakoviny Mir podpisu. Mier * s sú považované za osobné prvky, ktoré sú považované za normálnych okolností degradovaný z pre-MIR čo má za následok zrelé 22 nt vlákna, ktorá vstupuje do komplexu RISC. Funkcia * miRNA zostávajú nejasné, aj keď je možné, že sú výsledkom poškodenia spracovania pre-miRNA (Tchernitsa et al J Pathology, 2010), alebo môžu hrať úlohu pri zacielenie mRNA transláciu (Gu a Lu, Plos One 2010 ).
tiež pozorované, že pri 21 miRNA boli nájdené v spoločnej medzi GC a chemorezistence miRNA podpisy, 37 miRNA boli jedinečné na podpis chemosensitivity.
Analýza vzorky pary pred a po ošetrení od 8 pacientov ktorí reagovali na liečbu CF, ale neskôr sa stala rezistentné voči liečbe slúžil ako dôkaz-of-zásade preukázal, že prediktívne index miRNA podpisu 58 by prejsť z priaznivého indexu (vo fáze pred začatím liečby) nepriaznivé indexu ( po ošetrení, kedy odpor vyvinutý). Bohužiaľ, nebolo možné získať ďalšie spárovaných vzoriek od pacientov s podobnými poskytnúť robustnejšie štatistickú analýzu. Avšak výsledky sú v súlade s modelom klonálnej výber pre-existujúcich nádorov rezistentných buniek bývajú v rámci primárneho nádoru.
Podľa konvenčného klonálnej výberu modelu pre rozvoj získanej rezistencie odolnosti chemoterapia, rezistencia spočiatku reaktívnych nádorov sa vyvíja v dôsledku selektívnej následok chemorezistentního klonov, ktoré už existujú v nádore [18]. Vzhľadom na to, že rýchly TTP špecificky označuje vnútornú odolnosť voči chemoterapii [19], sa 58 miRNA, ktorých expresia úrovne sú v korelácii s krátkym TTP môžu predstavovať miRNA chemorezistence súvisiace s už prítomné vo väčšine nádorových buniek primárneho nádoru. Avšak, primárne nádory, ktoré sa objavujú, aby vyjadriť tento podpis miRNA odporu, najprv reagovať na liečbu, kým už existujúce, rezistentné bunky selektívne rastú cez CF terapie. V čase, keď je vzorka získaný, keď je pozorovaná rezistencia, veľkosť nádoru vyjadruje nepriaznivý, chemorezistentním miRNA podpis. Vzhľadom na to, že odpor vo väčšine z týchto pacientov sa vyvíja v pomerne krátkom časovom období (mesiace, roky) nie, sa javí ako nepravdepodobné, že výsledky odpor z hromadenia viacerých jednotlivých genetických zmien.
Výsledky tejto štúdie poskytujú dôležité nové údaje a miRNA podpisy, najmä predikcia reakcie na liečbu CF, a pokiaľ ide o vzniku rezistencie nádoru. Avšak väčšie štúdie potrebné vykonať v budúcnosti ďalej overiť tieto poznatky a zistenie, či môžu byť použité v klinickom prostredí.
Závery
síce obmedzená malou veľkosťou vzorky sete validačnej táto štúdia identifikuje miRNA, ktoré môžu obsahovať klinicky relevantné podpis na vnútornú odolnosť karcinómu žalúdka do CF a naznačuje, že tieto miRNA boli v priebehu vývoja získaného chemorezistence vybraný. Vzhľadom k tomu, miRNA prediktor môže prípadne poskytnúť užitočné usmernenie pre personalizované chemoterapii v budúcnosti, to vyžaduje ďalší výskum a validáciu vo veľkých prospektívnych štúdií.
Metódy
zápis pacienta a liečbu
boli vzorky odobraté tkanivá v nemocnici korean National Cancer Center endoskopicky v rokoch 2001 až 2006 podľa protokolu schváleného Institutional Review Board (IRB) Národného nemocnice Cancer Center v Goyang, Južná Kórea. Všetci pacienti a dobrovoľníci podpísali IRB schválené informovaného súhlasu formulárov. Spôsobilosť na zápis do štúdie zahrnuté nasledujúce parametre: 1) vo veku ≥ 18 rokov; 2) histologicky potvrdené žalúdočné adenokarcinóm; 3) dokumentovaný vzdialených metastáz; 4) žiadne predchádzajúce alebo súbežná malignity s výnimkou karcinómu žalúdka; 5) bez predchádzajúcej chemoterapie, a to buď adjuvantnej alebo paliatívnej; a 6) zodpovedajúce funkcie všetkých dôležitých orgánov. 34 zdravých dobrovoľníkov prešlo gastroskopia pre rutinné skríning rakoviny žalúdka a mali normálnu žalúdočnú sliznicu histologicky. Tam bol medzi 34 zdravých dobrovoľníkov žiadny zápal žalúdka.
Mierny štúdia bola vykonaná ako paralelné štúdie štúdiu expresie mRNA analýzy [20] určené na identifikáciu mRNA prediktory chemorezistence. Deväťdesiat vzorky pred začatím liečby biopsia odobraté od roku 2001 do roku 2006 boli analyzované v tejto štúdii miRNA. Po počiatočnom endoskopické biopsii, všetky z 90 pacientov bolo liečených s cisplatinou (60 mg /m 2, D1) v kombinácii buď fluorouracilu (1 g /m 2 počas 5 dní, n = 88), alebo kapecitabín (Xeloda, Roche, 1250 mg /m 2 BID po dobu 2 týždňov, n = 2) každé 3 týždne. Klinické respondenti boli požiadaní, aby podstúpiť druhú endoskopia na progresiu ochorenia času (PD) bolo pozorované podľa Svetovej zdravotníckej organizácie (WHO) kritérií. Nasledujúce dve kritériá boli použité pre definovanie klinických personál: 1) pacientov, ktorých nádory preukázané, viac ako 50% zníženie v súčte súčinov dvoch najväčších kolmých priemerov merateľných lézií po dobu najmenej 4 týždňov; alebo 2) u pacientov, ktorí nemali výrazné ochorenie na začiatku prezentácie a mal dramatický pokles pleurálneho výpotku /ascites po dobu aspoň 4 týždňov [21]. Po liečbe miRNA microarray dát by mohol byť získaný zo vzoriek odobratých pri chemorezistence vytvoril (PD) v 8 klinických respondérov. Vzorky po liečbe boli zbierané najmenej 2 týždne po poslednej dávke fluóruracilu sú, a pred začatím druhej chemoterapie, aby sa zabránilo akejkoľvek akútne účinky liečiv na ovplyvnenie profil expresie. Z týchto 8 klinických respondentov, pred a po ošetrení vzoriek (ktoré boli zhromaždené v čase progresie ochorenia) predstavujú chemosenzitivních a chemorezistentním nádory, resp. Predbežné spracovanie vzoriek zo zvyšných 82 pacientov bola použitá na identifikáciu miRNA prediktor pre odpoveď chemoterapie. Tento prediktor bol aplikovaný na 8 párov vzoriek odobratých z rovnakých pacientov pred a po liečbe. Predikcia bol považovaný za správny, ak vzorky po liečbe boli priradené vyššie prediktívne index pre chemorezistence než vzorky pred začatím liečby. Vzorky biopsie boli podobne zhromaždené z 34 zdravých dobrovoľníkov.
Vzorky tkaniva, ktoré obsahujú aspoň 50% nádorových buniek, bola spracovaná na RNA, ako bolo opísané skôr [22]. Extrahované RNA boli analyzované pomocou Agilent Bioanalyzer 6000 celkovej RNA testu a Nanodrop spektrofotometer nasledujúce protokolov výrobcu. 500 ng celkovej RNA sa podrobí vlastné miRNA mikročipu. Zmes celkovej RNA izolovanej z troch žalúdočných nádorových bunkových línií (SNU-601, SNU-638, a AGS) bol použitý ako referenčný RNA pre konkurenčné hybridizácia.
Microarray experiment
miRNA microarray konštrukcie
The Laboratory of Molecular Technology (LMT) _miRNA_v2 mikročipu bola navrhnutá s využitím databázy Sanger miR9.0 (http: ... //mikroRNA Sanger aC Spojené kráľovstvo) a vyrobený ako zákazku syntetizovaný 8 × 15 k mikročipov (Agilent Technologies, San Jose, CA). Existuje celkom 4,361 záznamy miRNA v databáze miR9.0. Niektoré z miRNA majú presné sekvencie z rôznych druhov. zrútil sme databázu do 1,667 jedinečných zrelých miRNA sekvencií v rámci všetkých druhov, vrátane človeka, myši, potkany, atď. Zrelé miRNA sekvencie boli začlenené do 60-mer dlhých oligonukleotidových sond s sekvencie linker na 3 'konci k oddeleniu sekvencie miRNA od sklíčko povrchu. Sekvencia linker bola vlastné sekvencie od Agilent, že má minimálny homológie k akejkoľvek sekvencii v GenBank. Každý zrelé miRNA je reprezentovaná + a - (reverznej komplement) strand sekvencií. To umožňuje, aby mikroskopické sústavy má byť použitý s rôznymi protokolmi označovania. V závislosti na protokole, jeden zo sond môže tiež slúžiť ako negatívna kontrola. Každá sonda má 4 nádob v rámci jednotlivých mikročipe, poskytovanie technických opakovaniach pre meranie konzistencie a výkon čipu. Stručne povedané, každá jedinečná zrelých miRNA je reprezentovaná 8 sondami (4 + vlákna a 4 - prameň). Celkom 3,556 jedinečných identifikátorov LMT nasl (miRNA, pozitívne a negatívne kontroly, +/- Strand) boli na mikročipe, z ktorých každý má 4 nádob. http://​www.​ncbi.​nlm.​nih.​gov/​geo/​query/​acc.​cgi?​token=​ftixhsoiemwgyfi&​acc=​GSE30070

• Zmiešaná populácia Helicobacter pylori, Helicobacter bizzozeronii a "Helicobacter heilmannii" v žalúdočnej sliznici mačky domáce
• Experimentálny model miernej cukrovky: dlhodobé zhodnotenie glykemického profilu a žalúdočné kontraktility u potkanov