Plos ONE: Kvantifikacija Chitinase mRNA ravni pri človeku in Mouse tkiv s PCR v realnem času: vrste, poseben izraz kislih sesalskih Chitinase v želodec Tissues

Povzetek

Chitinase hidrolizira hitin, ki je N
acetil-D-glukozamin polimer, ki je prisoten v številnih organizmov, vključno z insekti, parazitov in gliv. Čeprav sesalci ne vsebuje endogenega hitin, ljudje in miši izraziti dve zdravilni chitinases, hitotriozidaze (Chit1) in kisla chitinase sesalci (AMCase). Ker je stopnja izražanja teh chitinases v številnih vnetnih stanj, vključno Gaucherjeva bolezen in mišjih modelov astme poveča, lahko obe chitinases igrajo pomembno vlogo v patofiziologij teh in drugih bolezni. Pred kratkim smo vzpostavili količinsko sistem PCR z uporabo enotnega standarda DNK in je pokazala, da je AMCase mRNA sintetizira na izjemno visoki ravni v miš želodcu tkivih. V tej raziskavi smo uporabili to metodo za kvantifikacijo chitinase mRNA v človeških tkiv in ugotovila, da sta bili obe chitinase mRNA močno izražen v normalnih človeških tkiv. Chit1 mRNA je zelo izražena v človeškem pljučih, medtem ko AMCase mRNA ni prekomerno v normalnih človeških želodcu tkiva. Ravni teh mRNA v človeških tkiv so znatno nižje od ravni oskrbniška genov. Ker so bile koncentracije AMCase izraz povsem drugačen od ljudi in miška želodca tkiva s, smo razvili kvantitativno PCR sistem za primerjavo ravni mRNA med človeškimi in miško tkiv z uporabo človeških miške hibridno standardni DNK. Naša analiza je pokazala, da je Chit1 mRNA izražena na podobnih ravneh v normalne ljudi in miške pljuč. V nasprotju s tem je bila stopnja AMCase izraz v človeškem želodcu bistveno nižja od tiste izražanja ravni opaziti v miške želodcu. Te mRNA razlike med človeškimi in miško na želodcu tkiv so posledica različnih chitinolytic dejavnosti in ravni izražanja proteinov. Tako je stopnja izraz AMCase v želodcu, je vrstno specifično

Navedba. Ohno M, Togashi Y, Tsuda K, Okawa K, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) Količinska Chitinase mRNA ravni pri človeku in Mouse tkivih s PCR v realnem času: vrste, poseben izraz kislih sesalskih Chitinase v želodcu tkiv. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10,1371 /journal.pone.0067399

Urednik: Emiko Mizoguchi, Splošna bolnišnica Massachusetts, Združene države Amerike

Prejeto: 5. januar 2013; Sprejeto: 15. maj 2013; Objavljeno: 27. junij 2013

Copyright: © 2013 Ohno et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprla raziskovalni projekt z nepovratnimi sredstvi iz raziskovalnega inštituta za znanost in tehnologijo, Kogakuin University. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Hitin, ki je polimer, N
acetil-D-glukozamin, je drugi najpogostejši polisaharid v naravi [1]. To je sestavni del v eksoskeletoni rakov in žuželk, z microfilarial plaščih parazitskih ogorčic in glivičnih celičnih sten [1], [2].

Chitinases so encimi, ki prebaviti polimera hitina. Čeprav sesalci ne proizvajajo hitin, ljudje in miši imajo dve gene, ki kodirajo aktivne chitinases, hitotriozidaze (Chit1) in kislo chitinase sesalcev (AMCase) [2], [3]. Chit1 bil prvi sesalca chitinase se očistimo in kloniramo [4], [5]. AMCase, ki je druga najbolj aktivni chitinase pri sesalcih, je bila opredeljena kot izravnalni encima za Chit1 in imenovan za optimalno aktivnost v kislih razmerah [6].

Tako encimi kažejo sekvenčno homologijo bakterijskim chitinases in pripadajo družina 18 glikozil hidrolaze, ki vključuje tudi chitinase podobne beljakovine, ki so strukturno sorodne chitinases vendar primanjkuje chitinolytic dejavnosti [2], [3]. Glodalski AMCase prikazuje sekvenčno homologijo do Chit1, z identiteto 52% in podobnosti 60% [6]. Locus gena humanega Chit1 se nahaja na kromosomu [7] 1q32, medtem ko je gen humanega AMCase nahaja na kromosomu 1p13 [6]. Obe geni so sestavljeni iz 12 eksonov in kodirajo različne spojene izooblik [6] - [9]. Zaporedje homologijo in ohranjanje meja med intron-EXON med geni Chit1 in AMCase kažejo, da so ti geni nastala zaradi podvajanja prednikov gena [3], [6].

so Nedavne študije so pokazale povezavo med izraz od chitinases sesalcev in vnetnih stanj. Na primer, so nivoji Chit1 povišano plazmi bolnikov z Gaucherjevo boleznijo, bronhoalveolarni izpiralni tekočini kadilcev in bolnikih s kronično obstruktivno pljučno boleznijo (KOPB) in cerebrospinalni tekočini bolnikov z Alzheimerjevo boleznijo [9] - [12] . AMCase izražanja in dejavnost sta molekul tudi pri alergijskih odzivov dihalnih poti v modelih miško astme [13]. Polimerni hitina povzroča AMCase izražanja in vključevanje imunskih celic, ki so povezane z alergijo in astmo [14]. Poleg tega so številne genetske variante AMCase povezano z bronhialno astmo pri ljudeh [15], [16]. Ti rezultati jasno kažejo, da so chitinolytic encimi igrajo pomembno vlogo pri odzivu na bolezen. Vendar pa njihova patofiziološki funkcije še vedno slabo razumljen.

Količinska Chit1 in ravni AMCase mRNA je pomemben korak k razumevanju vivo
ureditvi chitinases pri sesalcih. Pred kratkim smo vzpostavili količinsko sistem PCR z uporabo enotnega standarda DNA količinsko in primerjavo stopenj izraz chitinase in referenčnih genov v enakem obsegu [17]. V prejšnjem prispevku smo pokazali, da je AMCase velik prepis v želodcu miške in se izraža na ravneh, ki so primerljive s tistimi pepsinogen C [17].

Tu smo uporabili našo metodologijo za kvantifikacijo nivoji mRNA iz chitinases sesalcev v normalnih človeških tkiv, kar je pogoj za razumevanje njihove patološke vloge v obolelega tkiva. Poleg tega smo vzpostavili sistem, količinsko za primerjavo ravni mRNA večih genov med več človeških in mišjih tkivih z uporabo človeških miške hibridno standardni DNK. Naša raziskava kvantitativno kaže, da je Chit1 mRNA izražena na podobno visoki ravni v normalnih človeških in mišjih pljuč. V nasprotju s tem je AMCase pretežno izraženi pri miših, vendar ne človeški želodec.

Rezultati

Vzpostavitev in validacija Real-time PCR sistem za odkrivanje Chitinases na področju človeških tkiv

smo že vzpostavila realnem času sistem PCR, ki je sposobna za določanje ravni mRNA obeh chitinases sesalcev v mišjih tkiv in primerjavo teh vrednosti s tistimi referenčnih genov z uporabo enakega obsega [17]. V tej študiji smo želeli primerjati ravni genske ekspresije genov Chit1 in AMCase po normalnih človeških tkiv (Slika 1A). Kot je v mišjih tkivih [17], smo uporabili gospodinjstva geni gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) in beta-aktina referenčnih genov, ker so konstitutivno izražen na visoki ravni v večini celic [18]. Poleg tega smo se odločili pepsinogen C (znan tudi kot progastricsin) kot referenčno gena v želodcu, ker je bila stopnja AMCase mRNA v želodcu miške primerljiva s stopnjo mRNA iz pepsinogen C, ki predstavlja pomembno komponento želodčne sluznice [ ,,,0],19]. Z uporabo teh treh referenčnih genov, smo ocenili ravni genske ekspresije Chit1 in AMCase v normalnih človeških tkiv (slika 1A).

Zasnovali smo več sklopov primerji za kvantitativno PCR in oceniti njihovo ustreznost glede na to ali so razstavljene enojna tališče (Tm) in ena skupina na 10% poliakrilamidnem gelu [17]. Kot je prikazano na sliki S1A-E, disociacije krivulje petih cDNAs kažejo vsaka le en vrh. Gel elektroforeza jasno pokazala posamezne pasove pri pričakovanih velikosti za Chit1 (55 točk), AMCase (62 točk), GAPDH (57 točk), β-aktin (57 bp) in pepsinogen C (61 bp) (slika S1F). Tako smo potrdili, da so bili pravilni Produkti PCR pomnožili iz mešanice človeško cDNA tkivo.

Naslednja izdelana standardno predlogo DNK za PCR v realnem času z ligiranjem pet ciljnih delci v ena na ena razmerju (Slika 1B in sliki S2). 1396-nukleotidov dolg standardno predlogo DNA sestavljalo pet cDNA fragmentov, ki jih zajema cilj PCR regija in 60-143 baz spremljajoče regijah in vsebuje Bgl
II, Sal
I, Xho
I in Ne
restrikcijska sem območij (Slika 1B in Slika S2).

količinska obeh chitinases in referenčnih mRNA temelji na standardnih krivulj. Uporabili smo standardne krivulje za primerjavo in ocenjevanje v realnem času strategij PCR količinsko. Vsak standardna krivulja je bila ustvarjena s pomočjo 10-pregibom serijske razredčitve človeškega standardni DNA in pet različnih primarnih parov (slika S3A-E, rdeča zaprte kroge). Z uporabo standardne predloge DNK, ki vsebuje pet človeških cDNA fragmentov, lahko enake količine dodeli vseh pet genov v uporabi vsak redčenje za izgradnjo standardne krivulje (Slika S3A-E, rdeča zaprte kroge).

Če želite preizkusiti enakost krivulj, znan koncentracija človeške celotne kodira cDNA smo pomnožili in nato analizirali kot neznani vzorec. Ta test je bil izveden, da se preveri, da je povzročilo testirali redčenje v pričakovani količini. Kot je prikazano na sliki S3A-E, modra zaprte rhombuses, so opazili enake količine za vsako testirano razredčitve; ti so bili uporabljeni za izdelavo standardne krivulje.

Količinska nizko številčnost transkriptov in bogate transkriptov nam omogoča, da bi preverili občutljivost in zanesljivost PCR v realnem času, kar pomeni, da je naša PCR v realnem času metoda ponuja veliko dinamični razpon kvantifikacije, visoko natančnost in visoko občutljivost (Slika S3A-E). Tako je naša PCR v realnem času metoda zagotavlja zanesljive vrednosti za dva človeka chitinase genov in tri človeške referenčnih genov na isti lestvici.

Izražanje Chit1 in AMCase v normalnih človeških tkiv

študij vivo
ureditev za izražanje človeške Chit1 in AMCase genov, smo analizirali skupno RNA iz različnih normalnih človeških tkiv uporabo količinsko realnem času PCR s posebej oblikovano standardno DNA (slika 1). Dobljene vrednosti so izražene kot molekul na 10 ng celotne RNA v y osi (Sliki 2 in 3).

Tako Chit1 in AMCase mRNA so se pogosto izražen v normalnih človeških tkiv (Slika 2A in 2B). Najvišje stopnje Chit1 mRNA bili odkriti v pljuč človeka, ki mu sledi vranici, jetrih ploda in timus (Slika 2A). Najvišje stopnje AMCase mRNA bili odkriti v pljučih, nato pa plodu možganov, jeter, ščitnice in srca (Slika 2B). Čeprav je AMCase mRNA izražena na izjemno visoki ravni v želodcu miške [17], je bil njegov izraz raven v človeškem želodcu precej nižje od tistih v pljučih, možganih ploda, fetalnih jetrih, ščitnici in srca (Slika 2B). V drugih tkiv, so tako Chit1 in AMCase mRNA izražena na nizki, vendar zlahka zaznavne vrednosti nad ozadjem (slika 2A in slika 2B).

V primerjavi z letom AMCase mRNA, Chit1 mRNA je bila izražena na relativno višjih ravneh v vranici in jetrih ploda. V nasprotju s tem, ploda možganov, prostate in jetra, izražajo višjo količino AMCase mRNA kot Chit1 mRNA (slika 2).

Analiza izražanjem Chit1, AMCase, GAPDH, beta-aktin in Pepsinogen C mRNA v Normal Human pljuč in želodca tkiva

Ker so bile številne študije o patofiziologijo chitinases sesalcev izvaja z uporabo pljuča in želodec [6], [8] [9] [13] [14] [20 ] - [23], smo primerjali ravni ekspresije chitinases in referenčnih genov v teh dveh človeških tkivih. Kvantitativni podatki so prikazani na sliki 3. normalizira raven Chit1 do 1,0, relativne ravni izražanja AMCase, GADPH, in beta-aktin mRNA v človeški pljučnega tkiva so bili 0.8, 39 in 343, v tem zaporedju (slika 3A). V GAPDH in beta-aktin geni so dobro znani higienski gene in so konstitutivno izražen na visoki ravni v večini tkiv [18]. Naši rezultati kažejo, da so Chit1 in AMCase mRNA izražena na podobnih ravneh v normalne človeške pljučnega tkiva, čeprav je nivo izražanja Chit1 precej nižji od tistih dveh oskrbniška genov (primerjajte s non-dnevnika zemljišče z log parcelo na sliki 3).

normalizira raven Chit1 do 1,0, relativne ravni izraz AMCase, GAPDH, p-aktina in pepsinogen C v bili 1.5, 323, 1736 in 3962, v tem zaporedju (slika 3B) normalne človeške želodčne tkiva. Tu so bile ravni izražanja obeh Chit1 in AMCase precej nižji od tistih GAPDH in beta-aktina. Čeprav je pepsinogen C mRNA močno izražen v vzorcih človeških želodca, AMCase mRNA je bila primerljiva s Chit1. Ti rezultati kažejo, da so stopnje izraženosti Chit1 in AMCase relativno nizka v človeških tkiv obravnavane in da je stopnja AMCase izraz v želodcu bistveno razlikuje od človeka in miško.

Vzpostavitev in validacija količinsko sistema za prehrano in Mouse Chitinase mRNA Uporaba Human-miško Hybrid DNA

poleg skušala primerjati ravni izražanja obeh chitinases med ljudi in miši v enakem obsegu z uporabo realnem času sistem PCR (slika 4A). Zato smo zgradili človeško miške hibridni standardni DNK za PCR v realnem času z ligiranjem standardne predloge DNA, človeške in miško (slika 4b). Nastalo 2305-nukleotidov dolg predlogo DNA vseboval deset cDNA delci, ki zajema cilj PCR regija in 9-143 osnove spremljajoče regijah človeških in mišjih genov (glej podrobnosti v sliki S4).

validacij standardne krivulje in kvantitativni PCR v realnem času sistemu smo izvedli, kot je prikazano na sliki S5, S6 sliki in Slika S7. Serijske razredčitve humane mišjim hibridnega standardni DNA smo uporabili za izdelavo standardne krivulje. Vsak standardna krivulja je bila ustvarjena s pomočjo 10-pregibom serijske razredčitve standardni DNA in pet različnih primarnih parov (Slika S5A-E, rdeče krožci). Z uporabo standardne predloge DNK, ki vsebuje pet cDNA fragmentov, lahko enake količine dodeli vseh pet človeških genov z uporabo človeških posebne primarni pari v vsako razredčitev, ki je bila uporabljena za izdelavo standardne krivulje (Slika S5A-E, rdeča zaprte kroge ). Podobno lahko enake količine dodeli vseh pet mišjih genov (Slika S6A-E, vijolične zaprti trikotnikov).

Za testiranje enakosti krivulj, znana koncentracija celotnega kodira cDNA je bila dopolnjena in nato analizirati kot neznani vzorec. Enake količine človeških celotne kodirajo cDNA za vsako testirano redčenju so opazili; Te količine so bile nato uporabili za izdelavo standardne krivulje (Slika S5A-E, modra zaprt rhombuses). Podobno so opazili tudi enake količine miške celotno kodiranje cDNA (Slika S6A-E, zeleni križi). Količinska nizko številčnost transkriptov in bogate transkriptov nam omogoča, da bi preverili občutljivost in zanesljivost PCR v realnem času, kar pomeni, da je naša PCR v realnem času metoda ponuja širok dinamični razpon kvantifikacije, visoko natančnost in visoko občutljivost (Slika S5A- E in slika 6A-E).

Poleg tega so štiri vrstice (dve standardni krivulji in dva krivulje redčenju znanih koncentracij celotnega kodiranje cDNA človeških in miško, oziroma) prekrivajo (Slika S7A-E). Tako je naša PCR v realnem času metoda zagotavlja zanesljive relativne vrednosti za štiri chitinase genov in šestih referenčnih genov (Slika 4b).

Primerjava Chit1 in AMCase mRNA nivoji med normalne človeške in Mouse tkiv

uporabili smo človekove Total RNA Master Panel II in miške Total RNA Master Panel (Clontech Laboratories) kot virov celotne RNA za te študije. Obstajajo štiri tkiva (pljuča, jetra, vranica in ledvicami), ki se prekrivajo, med človeškimi in miško plošč in povezana z astmo in Gaucherjeve bolezni. Ker ni bilo vidnih razlik v izražanju chitinase v želodcu tkivih, smo pogledali tudi na ravni izražanja teh chitinases v drugih prebavnih organov, žleze slinavke, želodca, tankega in debelega črevesa med humano in miško. Mi količinsko in primerjali ravni izražanja v teh tkivih, ki uporabljajo človeški miške hibridni standardne DNA (slika 4B); kvantitativni podatki so prikazani na sliki 5.

Našli smo najvišjo stopnjo ekspresije Chit1 mRNA v miško (ne pa tudi človeški) želodca, ki ji sledi človeških pljučnih tkivih. Na splošno je bil Chit 1 mRNA izražena na višjih ravneh v človeških tkivih kot v tkivih z miško, razen za želodec (Slika 5A). Najvišja stopnja izraz AMCase mRNA bil miške želodcu, ki mu sledi miško žlez slinavk. V drugih človeških in mišjih tkivih, so bile ravni AMCase mRNA v človeških tkivih (slika 5b) nizka. Obe ravni Chit1 in AMCase mRNA tankega in debelega črevesa je bilo v človeških in mišjih tkivih zelo nizka (slika 5), ​​ki so bile v skladu s prejšnjimi podatkov, pridobljenih s severne blot [6], [21].

ugotovljeno, da je AMCase mRNA izražena na nizkih ravneh v normalnem človeškem želodcu, vendar je zelo izražena v miš želodcu tkiva (slika 5b). Tako smo primerjali ravni ekspresije chitinases in referenčnih genov z uporabo cDNA, ki so bile pripravljene iz pljučnih in želodčnih tkivih.

normalizacijo nivoja človeškega Chit1 v pljučnem tkivu 1,0, relativne nivoje izražanja od miške Chit1 so človeški AMCase in miške AMCase mRNA 0,3, 0,3 in 7, v tem zaporedju (slika 6a). Murine AMCase je zelo izražena v pljučih miške. Stopnja Chit1 mRNA v človeškem pljučih je približno 3-krat višja kot v miške pljučih. Ravni Chit1 in AMCase mRNA bile znatno nižje od ravni izražanja GAPDH in beta-aktin genov (slika 6A).

normalizira raven človeškega Chit1 v želodcu to1.0, relativne izražanjem miško Chit1, človeško AMCase in miške AMCase mRNA je bilo 10, 0,7 in 1978 v tem zaporedju (slika 6B). Pepsinogen C je pomemben prebavni encim v želodcu. Stopnja izraz AMCase pri miših je bila precej višja od tistih GAPDH in beta-aktina in je primerljiva s stopnjo pepsinogen C, medtem ko je človeški želodec so pokazali zelo nizko raven AMCase mRNA izražanja. Relativne stopnje izraženosti mRNA v človeškem in miške želodcu so bili 1,0 in 2826, v tem zaporedju.

Da bi preverili, ali so razlike v ravni mRNA med miško in človeka se odraža na ravni proteina, smo poleg analizirali encimsko aktivnost teh chitinases v želodcu tkivih. Najprej smo analizirali AMCase dejavnost v miši in človeške želodčne tkiv. AMCase miška kaže dvojni pH optimum z velikim optimalno okrog pH 2 in sekundarni optimalno okoli pH 5 [6], ker so človeška AMCase prikazuje širok optimalno pH na pH 2~pH 5 [16], [24]. Tako smo merili chitinolytic aktivnost pri pH 2,0 in pH 5,0 z uporabo sintetičnega substrat 4-metilumbeliferil ß-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Zaznali smo robustno chitinolytic dejavnost ekstrakta miške želodca pri pH 2,0 in močne aktivnosti pri pH 5,0. V nasprotju s tem ni bilo aktivnosti zaznal, da človeka pri pH 2,0 in zelo nizko aktivnost smo opazili pri pH 5,0 (slika 7A, levo).

Standardni Chit1 encimski test je bilo izvedeno z uporabo 4-metilumbeliferil β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) pri pH 5,2 [6], [10] [21] [25]. Za spremljanje učinkov AMCase na Chit1 dejavnosti, smo analizirali dejavnost chitinase uporabo 4MU-chitotriose pri pH 2,0. Relativno močan chitinase aktivnost proti 4MU-chitotriose je bila odkrita v ekstraktu želodcu miške na pH 2,0 (slika 7A desno), in smo tudi zaznali šibek chitinase aktivnost pri pH 5,2 (slika 7A desno). Ker ima AMCase drugo optimuma pri okoli pH 5, ti rezultati so pokazali, da se lahko večina chitinolytic aktivnosti pri pH 5,2 zaradi AMCase namesto Chit1 in te miške AMCase lahko hidrolizira 4MU-chitotriose kot substrat pri pH 2,0. Skupaj, večina chitinase dejavnosti v želodcu miške posledica AMCase dejavnosti. V izvlečku človeškem želodcu smo opazili tudi zelo šibke, vendar zaznavne količine chitinolytic aktivnosti pri pH 2,0 in pH 5,2 (slika 7A, desni, spodnji panel). Chitinase aktivnost pri pH 5,2 primerljiva s tisto pri pH 2,0, kar kaže Chit1 izraz v človeškem želodcu.

Na koncu smo analizirali raven izražanja proteinov z Western blot uporabo protiteles proti AMCase. Protitelesa anti-AMCase so bili ustvarjeni pred že poročali miške peptida [14] in prehrano kolegom. Anti-mouse AMCase protitelesa prepoznala robustno sam beljakovin pas v izpisek iz miške želodec, vendar ne od človeka (slika 7B, levo). Podobno AMCase protitelo proti humanemu priznana tudi sam trak v izvlečku miške (slika 7B, desno). V človeškem ekstrakta so bili bledi pasovi nekoliko višjo molekulsko maso, ki so bile priznane v človeških in mišjih protiteles (slika 7b). Ker ni bilo pomembnega chitinase dejavnost bodisi pH 2,0 in pH 5,0 z 4MU-chitobiose v izvlečku človeškem želodcu spremlja, ti pasovi ne more biti povezana s človeško AMCase. Zato so chitinolytic dejavnosti in relativne ravni beljakovin izraz med miško in človekove želodčne tkiv v skladu z našimi podatki, pridobljenimi na ravni mRNA.

Pogovor

Prejšnje študije o in vivo
ureditev Chit1 in AMCase v človeškem in miši so bile izvedene z uporabo severni odtisi, semi-kvantitativno PCR in PCR v realnem času [6], [8] [9] [13] [14] [22] [23]. Čeprav so te metode več prednosti kot preučevanjem izražanja genov vzorcev, ki jih ni uspelo primerjavo ravni različnih genskih transkriptov v enakem obsegu. V sedanji raziskavi smo uporabili našo metodologijo [17], da razišče ravni izražanja teh chitinases v človeških tkiv. Poleg tega, da oceni raven izražanja chitinases v človeških in mišjih tkivih, smo razvili sistem, količinsko z uporabo enega samega človeka in hibridni miške standardni DNK. Pokazali smo, tkiv in vrstno-specifične ekspresijo dveh sesalcev aktivnih chitinases, Chit1 in AMCase. Naši podatki na splošno podpira predhodne študije, ki jih Boot et al poročali [6], [21]. Vendar pa naša analiza je dovolj občutljiv, da zazna mRNA in zagotavlja celovito raziskavo o izražanja genov vzorcev na chitinases v človeških in mišjih tkivih na isti lestvici.

Ena opazno značilnost izražanju chitinases sesalcev je ohranjena izraz Chit1 med človeških in mišjih pljučnih tkivih. Ugotovili smo, da je bil Chit1 izražena na relativno visoki ravni v človeških in mišjih pljučnih tkivih, ki so bili skoraj primerljivi med seboj, kar pomeni, da je raven izraz Chit1 mRNA ohranjena. V pljučih, lahko Chit1 deluje kot del obrambnega sistema gostiteljice, ki ščiti pred patogenom, ki vsebujejo citin, kot so glive in pršice [25]. Ohranjanje Chit1 izražanja genov pri ljudeh in miših kažejo fiziološki pomen Chit1 v pljučih.

Izraz chitinases v želodcu, je posebnega pomena. AMCase mRNA se sintetizira na izjemno visoke ravni v želodcu miške, vendar ne v človeškem želodcu (slika 6B). Primerjava teh stopnjah izražanja je pokazala, da je bila raven AMCase mRNA v človeškem želodcu približno 1 /2.800 tiste v nasprotne miške. Potrdili smo, da so ekspresijski nivoji pepsinogen C mRNA in dva gospodinjskih genov pri ljudeh in miših želodca tkivi (slika 6B) zelo visoka. Tako se je zmanjšal nivo izražanja AMCase mRNA v človeškem želodcu ni posledica razgradnje RNA med pripravo cDNA. Poleg tega smo ugotovili, da miš želodčne izražene veliko AMCase, medtem ko človeška nasprotna niso (slika 7). Ti rezultati kažejo, da je raven izraz AMCase v želodcu tkivih bistveno razlikuje med ljudmi in miši.

Želodec je pomemben organ, ki ima temeljne vloge pri prebavi hrane in varstva pred škodljivimi organizmi. Klorovodikova kislina se izloča v želodcu, ki ustvarja kislih pogojih (pH = ~2) primerne za prebavo beljakovin, ki ga pepsina [19], [26]. Murine AMCase kaže stabilnost globoko kisline in je najbolj aktivna na približno pH 2 [6]. Želodec miške proizvede ogromno AMCase mRNA [17] in prevajalske izdelka (slika 7). Zato lahko AMCase deluje kot prebavni encim, ki razgrajuje živila vsebujejo hitina v želodcu miške.

V nasprotju s tem pa je bila stopnja izraz AMCase mRNA in produkta v človeškem želodcu relativno nizka (slika 5, slika 6 in slika 7). To ni nepričakovano, saj moderni ljudje ne jedo veliko količino živil, ki vsebujejo citin. Ti rezultati kažejo, da AMCase ni lahko igrajo vlogo pri obrambi pred organizmi, ki vsebujejo citin v človeškem želodcu. Mnoge bolezni v želodcu so povezane z okužbo z eksogenih organizmi. Resnost okužb gastritis, povezane, kot so Helicobacter pylori
lahko v korelaciji z dejavnostjo endogenih encimov [23]. Tako je še vedno stvar razprave, ali je nizka stopnja AMCase v človeškem želodcu sodeluje v odgovoru na želodčnih motenj.

Visoka raven chitinolytic aktivnosti so bili odkriti v izvlečkov želodcu miške in črevesja [6] . Ker pa so izraziti razlike v stopnji chitinase izražanja v želodcu med človeškimi in miško, smo preverjali raven izražanja teh chitinases v drugih prebavnih organov, vključno žleze slinavke in tankega in debelega črevesa. Naši rezultati kažejo, da sta bila oba Chit1 and AMCase mRNA ravni v tankega in debelega črevesa, v človeških in mišjih tkivih zelo nizka, čeprav miška žlez slinavk in želodec proizvaja visoko raven obeh chitinases mRNA (slika 5). Ti rezultati kažejo, da so chitinase proteinov sesalcev v črevesju mišje verjetno izvirajo iz zgornjih delov gastrointestinalnega trakta, kot žleze slinavke in želodca, kar je v skladu s predhodnim pojmom ga škorenj et al [6], [21].

ravni izražanje gena Chit1 v pljučnih tkivih se ohranja med ljudmi in miši. V nasprotju s tem pa je raven izraz AMCase v želodcu tkiv vrstno specifično. Rezultati kažejo, da je ureditev izražanje Chiti1 mRNA v pljučih ohranjena v razvoju, ker bi lahko zmanjšalo izraz AMCase v človeškem želodcu posledica genske utišanjem. Preučitev regulacije izražanja teh chitinases sesalcev lahko dal vpogled v patofizioloških vlog teh encimov. Podrobna opredelitev promotorja regij genov Chit1 in AMCase in opredelitev cis
- in bo treba trans
-acting dejavniki za razumevanje selektivno genske ekspresije teh chitinases pri ljudeh in miših.

izraz Chit1 in AMCase mRNA se inducira v različnih bolezenskih stanj. Uporaba kvantitativne opisani sistem, bomo lahko primerjali ravni chitinase mRNK vsej človeških in mišjih tkivih s PCR v realnem času. Ta analiza bo olajšalo razumevanje biološke funkcije teh chitinases, zlasti v patofiziološke študije bolezni pri ljudeh z uporabo mišje modele. Naša metodologija se uporablja za izmero mRNA iz več genov med človeških in mišjih osebke, ki uporabljajo isto lestvico. Praktična uporaba te primerjalne navzkrižno vrste genske ekspresije podatkov je primerjava človeških bolezni z miško in celičnih kulturah modelov.

Materiali in metode

RNA in cDNA Priprava

The Human Total RNA Master Panel II in miška Total RNA Master Panel (Clontech Laboratories) smo preučiti porazdelitev transkriptov v različnih tkivih. Tankem črevesu človeka Total RNA je bila kupljena od Clontech Laboratories. Poleg tega je bila RNA izoliramo iz žleze slinavke in tankega in debelega črevesa za 3-mesečno starih samcih. C57BL /6J miši (CLEAR Japonska) so redili na instrumentu RIKEN Brain Science Institute živali. Vsi poskusi na živalih so bile izvedene v skladu s smernicami ustanove. Protokol je odobril Odbor za etiko o poskusih na živalih v RIKEN Brain Science Institute (Odobritev št H19-2B013). Vse operacija je bila izvedena z dietil eter kot anestetik, in si je prizadevala za zmanjšanje trpljenja. Robčki za pripravo mRNA so posredovali Drs. Miyazaki in Nukina na RIKEN Brain Science Institute. Skupno RNK smo pripravili iz žleze slinavke in tankega in debelega črevesa ob uporabi TRIzola Reagent (Invitrogen) v skladu z navodili proizvajalca. Analizirali smo 21 različnih človeških tkiv in osem odraslih z miško tkiva. Če želite odstraniti sledove kontaminiranja genomske DNK, so bile skupne vzorce RNA zdravijo z RQ1 RNase proste DNazo (Promega), v skladu s priporočili proizvajalca. Vsak od vseh vzorcev RNA smo izpostavili, da se obrne transkripcijo s pomočjo naključne heksamerov kot primerji, kot smo že poročali [17].

Real-time PCR

Oblikovanje in potrjevanje realnem času sistem PCR za človeška tkiva smo izvedli, kot je opisano [17]; Edina izjema je bila uporaba človeških oligonukleotidov. Nukleotidna zaporedja iz primerji, ki so bili izbrani za PCR v realnem času za človeško sistema so prikazani v tabeli S1. Vsak vzorec smo pomnožili v treh izvodih, in vsak poskus smo ponovili vsaj dvakrat.

Gradnja Human standardne DNA in pripravo petih človekovih cDNA, ki pokrivajo celotno kodiranje Regija

izgradnje standardno predlogo DNK pri človeških genov in pripravo pet človeških cDNA, ki pokriva celotno kodirno regijo smo izvedli v bistvu, kot je opisano [17]; Edina izjema je bila uporaba človeških oligonukleotidov. Za naprej in povratne primerji so navedene v tabeli S2. PCR produkt smo digerirali z ustreznimi restrikcijskimi encimi in ligirali s pomočjo T4 DNA ligaze. Ligirani fragmente smo pomnožili z uporabo naprej premaza 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'in povratne premaz 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' in klonirali v pGEM-T enostaven vektor (Promega). Preverjene sekvence v cDNA so prikazani na sliki S2.

• Plos ONE: Želodec temperature Records odkriti Zdravstvena Obnašanje in Prehod na trdnih potrošnjo hrane pri sesnih sesalcih, Harbour Seal Pup (Phoca vitulina)
• Plos ONE: Serum apolipoproteinov C-I in C-III zmanjšajo v želodcu bolnikih z rakom: Rezultati MALDI-Based Peptidome in imunsko osnovi kliničnih Preiskus