PLoS ONE: kiekybinis Chitinase iRNR lygiui žmogaus ir pelės audiniuose realiojo laiko PGR: Rūšys-konkretizacija Rūgštinis žinduolių Chitinase skrandžio audinių

Anotacija

Chitinase hidrolizuojasi Chitinas, kuris yra N
acetil-D-gliukozamino polimeras, esantis įvairių organizmų, įskaitant vabzdžių, parazitų ir grybelių. Nors žinduoliai neturi jokios savaiminės Chitinas, žmonės ir pelės išreikšti dvi veikliosios chitinases, chitotriosidase (Chit1) ir rūgštinis žinduolių chitinase (AMCase). Kadangi išraiškos šių chitinases lygis padidėjo daugelyje uždegiminėms ligoms, įskaitant Gošė ligos ir pelės modelių astma, abu chitinases gali vaidinti svarbų vaidmenį šių ir kitų ligų pathophysiologies. Mes neseniai nustatė kiekybine PGR sistema, naudojant vieną standartinį DNR ir parodė, kad AMCase iRNR yra sintetinamas ne itin aukšto lygio pelių skrandžio audinius. Šiame tyrime mes šiuos metodus į chitinase mRNR iš žmogaus audinių kiekybinio ir nustatė, kad abu chitinase mRNR buvo plačiai išreikštas įprastais žmogaus audiniuose. Chit1 iRNR buvo labai išreikštas žmogaus plaučių, o AMCase iRNR nebuvo ekspresija įprastomis žmogaus skrandžio audinius. Šių mRNR iš žmogaus audinių koncentracija buvo žymiai mažesnė negu namų ruošą genų lygiu. Kadangi AMCase ekspresijos lygis buvo gana skirtingi tarp žmogaus ir pelės skrandžio audinių, mes sukūrėme kiekybine PGR sistema palyginti iRNR lygį tarp žmogaus ir pelės audinių naudojant žmogaus pelės hibridas standartinį DNR. Mūsų analizė parodė, kad Chit1 iRNR yra išreiškiamas panašaus lygio į normalaus žmogaus ir pelės plaučių. Priešingai, AMCase išraiška lygis žmogaus skrandžio buvo gerokai mažesnis nei ekspresijos lygio stebimas pelių pilvo. Šie iRNR skirtumai tarp žmogaus ir pelės skrandžio audinių buvo atspindi skirtumus chitinolytic veiklą ir lygius baltymų išraiška. Taigi pasakymas lygis AMCase skrandyje yra rūšiai specifinis

nurodomoji dalis:. Ohno, M, Togashi Y Tsuda K Okawa K Kamaya, M, Sakaguchi, M, et al., (2013) kiekybinis Chitinase iRNR lygiui žmogaus ir pelės audinių Real-Time PCR: Rūšys-konkretizacija Rūgštinis žinduolių Chitinase pilvo audiniuose. PLoS ONE 8 (6): e67399. Doi: 10,1371 /journal.pone.0067399

redaktorius: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Sausis 5, 2013 m Priėmė: Gegužės 15, 2013 m Paskelbta: Birželis 27, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Ohno et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė projekto mokslinių tyrimų dotaciją iš mokslinių tyrimų instituto mokslo ir technologijų Kogakuin universitete. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Chitinas, kuri yra N
acetilo--d-gliukozamino polimeras, yra antras labiausiai paplitęs polisacharidas pobūdžio [1]. Tai sudėtinė vėžiagyvius ir vabzdžius, kad microfilarial apvalkalai parazitinių nematodų ir grybelio ląstelės sienelės egzoskeletus [1], [2].

Chitinases yra fermentų, kurie virškinti chitino polimeras. Nors žinduoliai negamina Chitinas, žmonės ir pelės turi du genus, kurie koduoja aktyvių chitinases, chitotriosidase (Chit1) ir rūgštus žinduolių chitinase (AMCase) [2], [3]. Chit1 buvo pirmasis žinduolių chitinase turi būti gryninamas ir klonuotas [4], [5]. AMCase, kuri yra antra labiausiai aktyvus chitinase žinduolių, buvo identifikuotas kaip kompensacinė fermentas Chit1 ir pavadintas jo optimalaus veiklos rūgštinėmis sąlygomis [6].

Ir fermentų eksponatas sekos homologiją bakterijų chitinases ir priklauso šeima 18 glikozilinio hidrolazių, kuri taip pat apima chitinase-kaip baltymus, kurie yra struktūriškai susijęs su chitinases bet trūksta chitinolytic veiklą [2], [3]. Pelių AMCase rodo sekos homologiją į Chit1, su 52% identiškumą ir 60% panašumo [6]. Žmogaus Chit1 geno lokuso yra rasti chromosomos [7] 1q32, kadangi žmogaus AMCase genas yra chromosomoje 1p13 [6]. Abu genai yra sudarytas iš 12 egzonų ir koduoti įvairių sandūros izoformų [6] - [9]. Seka homologija ir iš intronui-Exon ribų tarp Chit1 ir AMCase genų išsaugojimo rodo, kad šie genai atsirado iš protėvių genų dubliavimosi [3], [6].

Naujausi tyrimai parodė ryšius tarp iš žinduolių chitinases ir uždegiminėms ligoms išraiška. Pavyzdžiui, iš Chit1 kiekis būna padidėjęs gydant pacientus plazmos su Gošė liga, taip bronchoalveolinio lavažo skysčio rūkančiųjų ir pacientams, sergantiems lėtinės obstrukcinės plaučių ligos (LOPL) ir galvos ir stuburo smegenų skysčio pacientų, sergančių Alzheimerio ligos [9] - [12] , AMCase išraiška ir veikla taip pat aktyvinama per alerginių kvėpavimo takų atsakymų pelės modelių astma [13]. Polimerinis Chitinas skatina AMCase išraiška ir imuninių ląstelių, kurios yra susijusios su alergija ir astma [14] įdarbinimą. Be to, keletas genetiniai variantai AMCase yra susijęs su bronchinės astmos į žmonėms [15], [16]. Šie rezultatai aiškiai rodo, kad chitinolytic fermentai vaidina svarbų vaidmenį reaguojant į ligą. Tačiau jų patofiziologiniai funkcijos lieka menkai suprantamas.

kiekybinis Chit1 ir AMCase mRNR lygių yra svarbus žingsnis link vivo pervežimas reguliavimo chitinases žinduolių supratimą. Mes neseniai nustatė kiekybine PGR sistema, naudojant vieną standartinį DNR kiekybiškai ir palyginti raiškos lygį; chitinase ir nuoroda genų toje pačioje skalėje [17]. Mūsų ankstesnės popieriaus, mes parodėme, kad AMCase yra pagrindinis stenograma to, kad pelės skrandžio ir išreiškiamas tokio lygio, kad yra panašūs į pepsinogen C [17].

Čia mes taikomos mūsų metodiką kiekybinio iRNR lygiai žinduolių chitinases įprastomis žmogaus audinių, kurie yra būtina sąlyga norint suprasti savo patologinių vaidmenis apkrėstų audinių. Be to, mes sukūrėme skaičiais sistemą palyginti iRNR lygius keliais genais tarp žmogaus ir pelės audinių, naudojant žmogaus pelės hibridas standartinį DNR numerį. Mūsų tyrimas rodo, kad kiekybiškai Chit1 iRNR yra išreiškiamas ne panašiai aukšto lygio įprastomis žmogaus ir pelės plaučius. Priešingai, AMCase daugiausia ekspresija pelių, bet ne žmogaus skrandį.

Rezultatai

steigimas ir įteisinimas realaus laiko PGR sistema aptikimas Chitinases žmogaus audiniuose

mes anksčiau nustatytu realaus laiko PGR sistemą, kuri yra pajėgi nustatyti iRNR lygiui dviejų žinduolių chitinases pelių audinių ir lyginant šiuos apimtis su etaloninių genų, naudojant tą patį skalę [17]. Šiame tyrime norėjome palyginti genų ekspresijos lygį; Chit1 ir AMCase genų visoje įprastų žmogaus audinių (1a pav.) Kaip pelė audiniuose [17], mes panaudojome buities genai gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) ir beta-aktino kaip pamatiniai genų, nes jie constitutively išreikšta aukšto lygio daugumoje ląstelių [18]. Be to, mes pasirinkome pepsinogen C (taip pat žinomas kaip progastricsin) kaip atskaitos geno skrandyje, nes AMCase mRNR lygis pelės skrandžio buvo panašus į iRNR lygio pepsinogen C, kuri yra pagrindinė sudedamoji skrandžio gleivinės [ ,,,0],19]. Naudojant šiuos tris pamatinius genus, mes įvertino genų ekspresijos lygį Chit1 ir AMCase įprastomis žmogaus audinių (1A pav.)

Mes sukūrėme keletą rinkinių gruntų kiekybiniam PGR ir įvertinti jų tinkamumą pagal tai, ar jie eksponuojami vieno lydymosi temperatūra (Tm), ir bendru juosta 10% poliakrilamido gelyje [17]. Kaip parodyta pav S1A-E, disociacijos kreivės penkių kDNR eksponuoti kiekvieną tik vieną viršūnę. Gelyje aiškiai parodė vieną juostas numatomai dydžių Chit1 (55 bp), AMCase (62 bp), GAPDH (57 bp), β-aktino (57 BP) ir pepsinogen C (61 BP) (S1F pav.) Taigi, mes patvirtino, kad teisingi PGR produktai buvo papildytas iš žmogaus audinių kDNR mišiniu.

Kitas pastatytas standartinį šabloną DNR realaus laiko PGR iki liguojant penkis tikslines fragmentus į vienas su vienu santykis (1B pav ir S2 pav). 1396-nukleotidų ilgio standartinis šablonas DNR sudarė penki kDNR fragmentų, kad, kuriems PGR tikslinė regione ir 60-143 bazių supančių regionų ir juose BGL
II , Sal
aš, Xho
I ir Ne
i restrikcijos vietas (1b pav ir S2 paveikslas).

iš abiejų chitinases ir referencinių mRNR kiekybinis remiasi standartiniais kreives. Mes naudojome standartines kreives palyginti ir įvertinti realaus laiko PGR kiekybinio strategijas. Kiekvienas standartinė kreivė buvo sukurta naudojant 10 kartų serijiniu būdu atskiedus žmogaus standartinio DNR ir penkių skirtingų pradmenų poros (pav S3A-E, raudona uždarytas apskritimai). Naudojant standartinį šabloną DNR, kuriame yra penki žmogaus kDNR fragmentai, vienodais kiekiais galima priskirti visų penkių genų kiekvieno skiedimui naudoti statyti standartines kreives (pav S3A-E, raudona uždarytas apskritimai).

Norėdami išbandyti iš kreivių lygybę, žinomas koncentracija žmogaus visą kodavimo kDNR buvo išplėstos ir vėliau tiriami kaip nežinomo mėginio. Šiam testui buvo atliktas siekiant patikrinti, kad kiekvienas išbandė praskiedimo lėmė numatomą kiekį. Kaip parodyta pav S3A-E, mėlyna uždaros rombų, lygios kiekiai buvo stebimi kiekvienam tiriamam praskiedimas; jos buvo naudojamos statyti standartinę kreivę.

mažai gausa nuorašai ir gausiai nuorašai kiekybinis leidžia mums patikrinti jautrumą ir patikimumą realaus laiko PGR rodo, kad mūsų realaus laiko PGR metodas suteikia daug dinaminis diapazonas kiekybinio, didelio tikslumo ir didelio jautrumo (pav S3A-E). Taigi, mūsų realaus laiko PGR metodas suteikia patikimus vertės dviejų žmogaus chitinase genų ir trijų žmogaus atskaitos genų toje pačioje skalėje.

išraiška Chit1 ir AMCase normaliomis žmogaus audinių

Jei studijuoti vivo
reguliavimą į žmogaus Chit1 ir AMCase genų raiškos, RNR iš įvairių įprastų žmogaus audinių buvo analizuojami naudojant kiekybinį realaus laiko PGR su specialiai standartinį DNR (1 paveikslas). Gautos reikšmės buvo išreikštas molekulių per 10 ng visų RNR y ašį (2 pav ir 3 pav.)

Ir Chit1 ir AMCase mRNR buvo plačiai išreikštas įprastais žmogaus audinių (2a pav ir 2b). Aukščiausio lygio Chit1 mRNR buvo aptikta žmogaus plaučių, po blužnies, vaisiaus kepenų ir užkrūčio liaukos (2a pav.) Aukščiausio lygio AMCase mRNR buvo aptikta plaučių, po vaisiaus smegenų, kepenų, skydliaukės ir širdies (2b pav.) Nors AMCase iRNR buvo išreikšta nepaprastai aukšto lygio pelių skrandžio [17], jo išraiška lygis žmogaus skrandžio buvo daug mažesnės nei plaučių, vaisiaus smegenų, vaisiaus kepenų, skydliaukės ir širdies (2b pav.) Kituose audiniuose, tiek Chit1 ir AMCase mRNR buvo išreikšta mažas, tačiau nesunkiai nustatyti lygiai virš fone (2A pav ir 2B pav.)

palyginti su AMCase mRNR lygius, Chit1 iRNR buvo išreikšta gana aukštesnį lygį į blužnis ir vaisiaus kepenyse. Priešingai, vaisiaus smegenų, prostatos ir kepenų išreiškė didesnį kiekį AMCase mRNR nei Chit1 mRNR (2 paveikslas).

Analizė posakio Lygiai Chit1, AMCase, GAPDH, beta-aktino ir Pepsinogen C mRNR į normalus žmogaus plaučių ir skrandžio audiniai

Kadangi buvo atlikti daug tyrimų dėl žinduolių chitinases patofiziologija naudojant plaučių ir skrandžio [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], mes, palyginti su išraiška lygmenims chitinases o nuoroda genų šių dviejų žmogaus audiniuose. Kiekybiniai duomenys pateikti 3 normalizuoti Chit1 lygį iki 1,0, santykinis raiškos lygius AMCase, GADPH paveiksle, ir beta-aktino mRNR į žmogiškąjį plaučių audinio buvo 0,8, 39 ir 343, atitinkamai (3a paveikslas). Į GAPDH ir beta-aktino genų yra gerai žinomas buityje genus ir constitutively išreikšta aukšto lygio daugumoje audinių [18]. Mūsų rezultatai rodo, kad Chit1 ir AMCase mRNR yra išreikšti panašaus lygio į normalaus žmogaus plaučių audinio, nors Chit1 išraiška lygis buvo daug žemesnis nei dviejų namų ruošą genų (palyginti ne žurnalo sklypas su žurnalo sklypas 3 pav.)

"normalizuoti Chit1 lygį iki 1,0, santykinis raiškos lygius AMCase, GAPDH, beta-aktino ir pepsinogen C normalios žmogaus skrandžio audinyje buvo 1,5, 323, 1736 ir 3962, atitinkamai (3B pav.) Čia ekspresijos lygis tiek Chit1 ir AMCase buvo daug mažesnės nei GAPDH ir beta-aktino. Nors pepsinogen C iRNR buvo labai išreikštas žmogaus skrandžio mėginius, AMCase iRNR buvo panašus į Chit1. Šie rezultatai rodo, kad Chit1 ir AMCase ekspresijos lygis yra santykinai žemas žmogaus audinių išnagrinėtos ir kad AMCase išraiška lygis skrandyje labai skiriasi žmogaus ir pele.

steigimas ir įteisinimas skaičiais sistemos, skirtos žmogiškiesiems ir pelės Chitinase mRNR naudojant žmogaus-pelės hibridinis DNR

kitas siekė palyginti raiškos lygius dviejų chitinases tarp žmonių ir pelių tuo pačiu mastu, naudojant realaus laiko PGR sistema (4a pav.) Todėl sukonstravo žmogaus pelės hibridas standartinį DNR realaus laiko PGR iki liguojant žmogaus ir pelės standartinį šabloną PNI (4b pav.) Gautas 2305-nukleotidų ilgio DNR šablono pateikta dešimt kDNR fragmentus, kuriems PGR tikslinė regione ir 9-143 bazes supančių regionų žmogaus ir pelės genų (žr detales S4 pav.)

patvirtinimai standartinės kreivės ir kiekybinio realaus laiko PGR sistema buvo atlikta taip, kaip parodyta paveiksle S5, S6 paveiksle S7 pav. Serijinių praskiedimų, susijusių su žmogaus-pelės hibridinis standartinio DNR buvo naudojami statyti standartinę kreivę. Kiekvienas standartinė kreivė buvo sukurta naudojant 10 kartų serijiniu būdu atskiedus standartinį DNR ir penkių skirtingų pradmenų poros (pav S5A-E, raudonųjų uždaros apskritimai). Naudojant standartinį šabloną DNR, kuriame yra penki kDNR fragmentai, vienodais kiekiais galima priskirti visus penkis žmogaus genų naudojant žmogaus konkrečius pradmenų poros kiekvienoje praskiedimas, kuris buvo naudojamas statyti standartines kreives (pav S5A-E, raudona uždarytas ratą ). Be to, lygios kiekius galima priskirti visų penkių pelių genų (pav S6A-E, violetinė uždaros trikampiai).

Jei išbandyti kreivių lygybę, žinomos koncentracijos visą kodavimo kDNR buvo išplėstos ir vėliau analizuojama kaip nežinomo mėginio. Lygios kiekiai žmogaus ištisų kodavimo kDNR buvo stebimi kiekvienam tiriamam praskiedimas; tada šie kiekiai buvo naudojami statyti standartinę kreivę (pav S5A-E, mėlyna uždarytas rombų). Be to, taip pat buvo pastebėta vienodais kiekiais pelės visą kodavimo kDNR (pav S6A-E, žaliosios kryžiai). Mažos gausa nuorašai ir gausiai nuorašai kiekybinis leidžia mums patikrinti jautrumą ir patikimumą realaus laiko PGR rodo, kad mūsų realaus laiko PGR metodas siūlo didelį dinaminį diapazoną skaičiais, didelio tikslumo ir didelio jautrumo (S5A- pav E ir pav 6A-E).

Be to, keturios eilutės (du standartiniai kreivės ir du atskiesti kreivės žinomų koncentracijų žmogaus ir pelės visą kodavimo kDNR, atitinkamai) sutapo (pav S7A-E). Taigi, mūsų realaus laiko PGR metodas suteikia patikimus santykinius vertės keturių chitinase genų ir šešių pamatinių genų (4b pav.)

palyginimas Chit1 ir AMCase iRNR lygiui tarp normalaus žmogaus ir pelės audinių

Mes naudojome žmogaus RNR Master Panel II ir pelės RNR Master Panel (Klontex Laboratories) šaltiniais bendro RNR šiame tyrime. Yra keturi audiniai (plaučių, kepenų, blužnies ir inkstų), kad sutapo tarp žmogaus ir pelės plokštės ir susijęs su astma ir Gošė liga. Kadangi buvo žymūs skirtumai chitinase išraiškos skrandyje audinių, mes taip pat pažvelgė į išraiškos šių chitinases kitų virškinimo organų, seilių liaukų, skrandžio, plonųjų ir storųjų žarnų tarp žmogaus ir pelės lygiais. Mes kiekybiškai ir palyginti ekspresijos lygį šių audinių, naudojant žmogaus pelės hibridas standartinį DNR (4b paveikslas); kiekybiniai duomenys yra pavaizduota 5.

Mes radome aukščiausią išraišką lygio Chit1 mRNR pele (bet ne žmogaus), skrandžio, po žmogaus plaučių audiniuose. Apskritai, Chit 1 iRNR buvo išreikštas aukštesniu lygiu žmogaus audinių nei pelės audiniuose, išskyrus bambą (5a pav.) Didžiausias raiškos lygis iš AMCase mRNR buvo pelių skrandžio, o po to pelės seilių liaukų. Be kitų žmogaus ir pelės audinių, AMCase iRNR lygis buvo žemas žmogaus audinių (5b pav.) Abu Chit1 ir AMCase iRNR lygiai plonųjų ir storųjų žarnų buvo labai mažai žmonių ir pelės audiniuose (5 paveikslas), kuri buvo suderinta su ankstesniais duomenimis, gautais Šiaurės blotingc [6], [21].

nustatė, kad AMCase iRNR buvo išreikštas žemo lygio į normalaus žmogaus skrandžio, bet buvo labai išreikštas pelės skrandžio audinių (5b pav.) Taigi, mes taip pat palygino raiškos lygį; chitinases ir referencinių genų naudojant kDNR, kurie buvo ruošiami iš plaučių ir skrandžio audinius.

normalizuoti žmogaus Chit1 lygį plaučių audinio 1,0, santykinis raiškos lygmenis pelės Chit1, žmogaus AMCase ir pelės AMCase mRNR buvo 0,3, 0,3 ir 7 (atitinkamai 6a paveikslas). Pelių AMCase buvo labai išreikštas pelės plaučių. Iš Chit1 mRNR lygis žmogaus plaučių buvo apie 3 kartus didesnė nei ta, pelės plaučių. Į Chit1 ir AMCase iRNR kiekis buvo žymiai mažesnis nei ekspresijos lygių GAPDH ir beta-aktino genų (6a pav.)

normalizuoja žmogaus Chit1 lygį skrandžio to1.0, santykinė išraiška lygių pele Chit1, žmogaus AMCase ir pele AMCase mRNR buvo 10, 0,7 ir 1978 atitinkamai (6B pav.) Pepsinogen C yra pagrindinis virškinimo fermentas į skrandį. Sąvoka lygis AMCase pelėms buvo daug didesnis nei GAPDH ir beta-aktino ir buvo panaši į pepsinogen C lygio, kadangi žmogaus skrandžio eksponuojami labai žemo lygio AMCase iRNR raiška. Santykiniai ekspresijos lygis mRNR žmogaus ir pelės skrandžio buvo 1,0 ir 2826, atitinkamai.

tam, kad patikrintų, ar lygis mRNR skirtumai tarp pelės ir žmogaus buvo atspindėta baltymų lygiu, mes kitą analizuojami fermentinį aktyvumą, šių chitinases skrandyje audiniuose. Mes pirmą kartą analizuojama AMCase veiklą pele ir žmogaus skrandžio audinius. Pelė AMCase rodo dvigubą pH optimalus su pagrindinių optimalus netoliese pH 2 ir antrinio optimalus netoliese pH 5 [6], kadangi žmogaus AMCase rodo plati optimalus pH pH 2~pH 5 [16], [24]. Tokiu būdu, mes matuojamas chitinolytic veiklą, esant pH 2,0 ir pH 5,0, naudojant sintetinį substrato 4-methylumbelliferyl beta-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Mes nustatėme, tvirtą chitinolytic veiklą pelės skrandžio ekstrakto pH 2.0 ir stiprus veiklos, esant pH 5,0. Priešingai, jokia veikla buvo aptikta, kad žmogaus, kurio pH 2,0 ir labai mažas aktyvumas buvo stebimas esant pH 5,0 (7A pav, kairėje).

standartas Chit1 fermentinis tyrimas buvo atliktas naudojant 4-methylumbelliferyl β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose), esant pH 5.2 [6], [10], [21], [25]. Stebėti AMCase poveikį Chit1 veiklos, mes išanalizavo chitinase veikla, naudojant 4MU-chitotriose esant pH 2.0. Gana stiprus chitinase aktyvumas prieš 4MU-chitotriose buvo aptiktas pelės skrandžio ekstrakto pH 2,0 (7A pav dešinėje), ir mes taip pat aptikta silpna chitinase veiklą esant pH 5,2 (7A pav dešinėje). Nuo AMCase turi antrą optimalus maždaug pH 5, šie rezultatai rodo, kad dauguma chitinolytic veiklos, esant pH 5,2 gali būti dėl AMCase o ne Chit1 ir tos pelės AMCase gali hidrolizuoja 4MU-chitotriose kaip substratu, kurio pH 2,0. Kartu paėmus, iš chitinase veiklos dauguma pelių skrandžio lėmė AMCase veikla. Žmogaus skrandžio ekstrakto mes taip pat pastebėjo, labai silpnas, bet aptinkamas kiekis chitinolytic veiklos, esant pH 2,0 ir pH 5,2 (pav 7A, tiesa, žemesnės skydelis). Chitinase veikla esant pH 5.2 buvo panaši į tą, esant pH 2.0, nurodant Chit1 išraišką žmogaus skrandį.

Galiausiai, mes išanalizavo baltymų ekspresijos lygį imunoblotingo naudojant antikūnus prieš AMCase. Anti-AMCase antikūnai buvo sukurtas prieš anksčiau pranešė pelės peptido [14] ir žmonių kolega. Anti-pelės AMCase antikūnų pripažinta tvirtą bendrą baltymų juostą ištrauka iš pelių skrandžio, bet ne nuo žmogaus (7B pav, kairėje). Panašiai anti-žmogaus AMCase antikūnai taip pat pripažino vieną juostą pelės ekstrakto (pav 7B, dešinėje). Žmogaus ekstrakto ten buvo išsekę juostos šiek tiek didesnę molekulinę masę, kurios buvo pripažintos abiejų žmogaus ir pelės antikūnų (7b pav.) Kadangi nebuvo reikšmingas chitinase veikla abiejuose pH 2.0 ar pH 5,0 stebimi naudojant 4MU-chitobiose žmogaus skrandžio ekstrakto, šios juostos negalėjo būti susijęs su žmogaus AMCase. Todėl chitinolytic veikla ir santykiniai baltymų ekspresijos lygis tarp pelės ir žmogaus skrandžio audinių atitiko mūsų duomenimis, gautais tuo iRNR lygiu.

Diskusijos

Ankstesnės studijos in vivo
reguliavimas Chit1 ir AMCase žmogiškųjų ir pele buvo atlikta naudojant Šiaurės blottingu, pusiau kiekybinis PCR ir realaus laiko PGR [6], [8], [9], [13], [14], [22] [23]. Nors šie metodai turi keletą privalumų per genų ekspresijos modelių tyrimo, jie nepalygindama skirtingų genų transkriptų lygius tą pačią skalę. Atsižvelgiant į dabartinę tyrime mes taikomos mūsų metodiką [17] ištirti raiškos lygį šių chitinases į žmogaus audinių. Be to, siekiant įvertinti raiškos lygius chitinases žmogaus ir pelės audiniuose, mes sukūrėme skaičiais sistemą, naudojant vieno žmogaus ir pelės hibridas standartinį DNR. Mes parodėme audinių ir gyvūnų rūšimis susijusių specialiųjų išraišką dviejų žinduolių aktyvių chitinases, Chit1 ir AMCase. Mūsų duomenys paprastai palaiko ankstesnius tyrimus, apie kuriuos Boot et al [6], [21]. Tačiau mūsų tyrimas yra pakankamai jautrus aptikti iRNR ir suteikia visapusišką tyrimą genų ekspresijos modelių žmogiškųjų ir pelės audiniuose apie tą pačią skalę chitinases.

Vienas pastebimas bruožas iš žinduolių chitinases išraiškos užkonservuoti išraiška Chit1 tarp žmogaus ir pelės plaučių audiniuose. Mes nustatėme, kad Chit1 buvo išreikšta gana aukšto lygio žmonėmis ir pelės plaučių audiniuose, kurie buvo beveik palyginami tarpusavyje, nurodant, kad pasakymas lygis Chit1 mRNR yra užkonservuotas. Į plaučius, Chit1 gali veikti kaip dalis priimančiosios apsaugos sistemos, kuri apsaugo nuo Chitinas, kurių sudėtyje yra patogenų, pavyzdžiui, grybelių ir erkių [25]. Iš Chit1 genų ekspresijos išsaugojimas žmonių ir pelių rodo fiziologinį svarbą Chit1 plaučiuose.

iš chitinases išraiška skrandyje yra ypač svarbus. AMCase mRNR yra sintetinamas ne nepaprastai didelės koncentracijos pelės skrandžio, bet ne žmogaus skrandžio (6B pav). Šių ekspresijos lygio palyginimas parodė, kad AMCase lygis mRNR žmogaus skrandžio buvo apie 1/2800 iš, kad to, kad pelės atitikmens. Mes patvirtino, kad sąvoka lygiai pepsinogen C mRNR ir du namų ruošos genai buvo labai didelis žmogaus ir pelės skrandžio audinių (6b pav.) Tokiu būdu, sumažėjęs raiškos lygis iš AMCase mRNR žmogaus skrandžio yra ne dėl RNR degradacijos metu kDNR preparato. Be to, mes nustatėme, kad pelės skrandžio išreiškė didelį kiekį AMCase, kadangi žmogaus kolega nebuvo (7 pav.) Šie rezultatai rodo, kad pasakymas lygis AMCase skrandyje audinių gerokai skiriasi tarp žmonių ir pelių.

skrandis yra svarbus organas, kuris atlieka pagrindines vaidmenis maisto produktų ir apsaugos nuo kenksmingų organizmų virškinimą. Druskos rūgštis išsiskiria į skrandį, kurti rūgštinėmis sąlygomis (pH = ~2) tinkamus baltymų virškinimo pepsino [19], [26]. Pelių AMCase rodo didelį rūgščių stabilumą ir aktyviausi maždaug Ph2 [6]. Pelė skrandis gamina milžinišką kiekį AMCase mRNR [17] ir jos vertimo produkto (7 pav.) Todėl AMCase gali veikti kaip virškinimo fermento, kuris skaido chitino turinčių maisto produktų, kad pelės skrandį.

Priešingai, sąvoka lygis AMCase mRNR ir jos produkto buvo santykinai mažo žmogaus skrandžio (5 pav, 6 paveiksle ir 7 pav). Tai nėra netikėta, nes šiuolaikiniai žmonės nevalgo didelį kiekį Chitinas turinčių maisto produktų. Šie rezultatai rodo, kad AMCase negali vaidinti vaidmenį gynybos prieš Chitinas turinčių organizmų žmogaus skrandį. Daug skrandžio ligos yra susijusios su infekcijomis nuo išorės organizmų. Gastritas susijusių infekcijų, kaip antai stiprumas, Helicobacter pylori
gali koreliuoja su endogeninių fermentų [23] veikla. Todėl išlieka diskusijų nesvarbu, ar žemo lygio AMCase žmogaus skrandžio dalyvauja reaguojant į skrandžio sutrikimus.

aukšto lygio chitinolytic veikla buvo aptikta ekstraktų pelės skrandžio ir žarnyno [6] , Kadangi yra žymūs skirtumai nuo chitinase raiškos lygių tarp žmogaus ir pelės skrandžio, mes išnagrinėjome išraiškos šių chitinases kitų virškinimo organų, įskaitant seilių liaukos ir plonųjų ir storųjų žarnų lygį. Mūsų rezultatai rodo, kad tiek Chit1 and AMCase mRNR lygiai plonųjų ir storųjų žarnų buvo labai mažai žmonių ir pelės audiniuose, nors pelės seilių liaukos ir skrandžio gaminamos aukšto lygio abiejų chitinases mRNR (5 paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad žinduolių chitinase baltymai to, kad pelės žarnų tikriausiai kilęs iš viršutinių dalių virškinimo trakto, pavyzdžiui, seilių liaukų ir skrandžio, kuris atitinka iš anksto sąvoką pagal įkrovos et al [6], [21].

išraiškos lygiai Chit1 geno plaučių audiniuose yra užkonservuotas tarp žmonių ir pelių. Priešingai, sąvoka lygis AMCase skrandžio audinių yra rūšiai specifinis. Rezultatai rodo, kad iš Chiti1 mRNR ekspresijos plaučių reglamentas evoliucijos eigoje išliko, o sumažėjo išraiška AMCase žmogaus skrandžio gali būti genai yra nuslopinami rezultatas. Iš į šių žinduolių chitinases raiškos reguliavimo tyrimas galėtų suteikti įžvalgų į patofiziologinių vaidmenų šių fermentų. Išsamus apibūdintos promotoriaus regionuose Chit1 ir AMCase genų ir identifikavimo CIS UAB - ir TRANS
-acting koeficientai bus reikalingas atrankinio genų ekspresijos tai suprasti chitinases žmonėms ir pelėmis.

iš Chit1 ir AMCase iRNR raiška sukeltos pagal įvairius patologiniams. Naudojant čia aprašytą kiekybinę sistemą, galėsime palyginti chitinase iRNR lygį visoje žmogaus ir pelės audinių realaus laiko PGR. Ši analizė taip pat padės sukurti biologinio funkcijas ir chitinases suprasti, ypač patofiziologinių tiriant žmogaus ligos, naudojant pelių modelius. Mūsų metodika yra taikoma iš daugelio genų tarpusavio žmogaus ir pelės egzempliorių, naudojant tą patį mastelį mRNR kiekybinio. Praktinis panaudojimas šio lyginamojo kryžminio rūšių genų ekspresijos duomenų yra žmogaus ligų su pele ir ląstelių kultūrų modelių palyginimas.

Medžiagos ir metodai

RNR ir kDNR paruošimas

žmogaus viso RNR magistras skydas II ir pelės viso RNR magistras grupė (Klontex laboratorijos) buvo naudojami išnagrinėti nuorašai pasiskirstymą įvairiuose audiniuose. Žmogaus plonosiose žarnose viso RNR buvo įsigytas iš Klontex Laboratories. Be to, RNR buvo išskirta iš seilių liaukų ir plonųjų ir storųjų žarnų 3-mėnesių amžiaus vyrų pelių. C57BL /6J pelėms (skaidrus Japonija) buvo veisiami ne RIKEN smegenų mokslo institutas gyvūnų priemonę. Visi bandymai su gyvūnais buvo atliekami laikantis įstaigoje patvirtintas gaires. Protokolas buvo patvirtintas dėl pranešimo apie gyvūnų eksperimentai su RIKEN Smegenų mokslų instituto Etikos komiteto (patvirtinimo Nr H19-2B013). Visi chirurgija buvo atliekama naudojant dietilo eteris kaip anestetikas, ir buvo dedamos visos pastangos, kad kuo mažiau kentėtų. Audiniai iRNR rengimo teikė dr. Miyazaki ir Nukina ne RIKEN Smegenų mokslų instituto. Iš viso RNR buvo ruošiamas iš seilių liaukų ir plonųjų ir storųjų žarnų naudojant TRIzol reagento (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. Tyrėme 21 skirtingų žmogaus audinių ir aštuonis suaugusiųjų pelės audinius. Norėdami pašalinti pėdsakų užteršti genomo DNR, RNR mėginiai buvo gydomi RQ1 RNazės-nemokamai DNaze (Promega) pagal gamintojo rekomendacijas. Kiekvienas iš visų RNR mėginių buvo atliktas naudojant atvirkštinę transkripciją heksamerų kaip pradmenų, kaip buvo pranešta anksčiau [17].

Realaus laiko PGR

steigimas ir įteisinimas realiu laiku PGR sistema žmogaus audinių buvo vykdomi, kaip aprašyta [17]; vienintelė išimtis buvo žmogaus pradmenis. Nukleotidų sekos pradmenų, atrinktos realiu laiku PGR metodu dėl žmogaus sistemos yra parodyta S1 lentelėje. Kiekvienas mėginys buvo papildyta trimis egzemplioriais, ir kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas bent du kartus.

Statyba žmogaus standartiniu DNR ir paruošimas Penkių žmogaus kDNR, apimanti visą kodavimo Regionas

statybos Standartinis šablonas DNR už žmogaus genų ir iš penkių žmogaus kDNR, kad apėmė visą koduojančios srities preparato buvo atliktas iš esmės, kaip aprašyta [17]; vienintelė išimtis buvo žmogaus pradmenis. Į priekį ir atbulinės gruntai yra išvardyti S2 lentelėje. PGR produktai buvo suardomas su tam tikromis restrikcijos fermentų ir liguotas naudojant T4 DNR ligazės. Liguotą fragmentai buvo papildyta naudojant priekį gruntas 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 "ir atvirkščią gruntas 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3" ir klonuotas į pGEM-T yra lengva vektoriaus (Promega). Patvirtintų sekas kDNR rodomi S2 pav.

• PLoS ONE: Skrandis Temperatūros Įrašai Atskleisti Slauga elgesį ir perėjimo į kieto maisto vartojimas yra nenujunkyti žinduolis, uosto ruoniukas (Phoca vitulina)
• PLoS ONE: Serumas apolipoproteinais PI ir C III sumažėja skrandžio vėžiu sergantiems pacientams: rezultatai nuo MALDI-Based Peptidome ir imuninės sistemos Pagal Klinikinė Assays