PLoS ONE: Kwantificering van Chitinase mRNA Levels bij mens en muis weefsels door Real-Time PCR: Species-specifieke expressie van de zure zoogdieren Chitinase in de maag weefsels

Samenvatting

Chitinase hydrolyseert chitine, dat een N
acetyl-D-glucosamine polymeer dat aanwezig is in een groot aantal organismen, waaronder insecten, parasieten en schimmels. Hoewel zoogdieren geen endogeen chitine bevatten, mensen en muizen uiten twee actieve chitinasen, chitotriosidase (Chit1) en zure zoogdieren chitinase (AMCase). Omdat het niveau van expressie van deze chitinasen verhoogd in vele inflammatoire aandoeningen, waaronder de ziekte van Gaucher en muismodellen van astma kunnen beide chitinasen belangrijke rol spelen in de pathofysiologie van deze en andere ziekten. We hebben onlangs een kwantitatieve PCR onder toepassing van een enkele standaard DNA en toonde dat AMCase mRNA gesynthetiseerd op uitzonderlijk hoge niveaus maag muizenweefsels. In deze studie, pasten we deze werkwijze de kwantificering van chitinase mRNA in menselijke weefsels en vond dat beide chitinase mRNA sterk tot expressie werden gebracht in normale humane weefsels. Chit1 mRNA sterk tot expressie gebracht in de menselijke long, terwijl AMCase mRNA niet werd tot overexpressie gebracht in normale humane weefsels maag. De niveaus van deze mRNA in menselijke weefsels was significant lager dan de niveaus van housekeeping genen. Omdat de AMCase expressieniveaus sterk verschilt tussen de maag mens en muis weefsels, ontwikkelden we een kwantitatieve PCR systeem om de mRNA-niveaus tussen mens en muis weefsels te vergelijken met een mens-muis-hybride standaard DNA. Onze analyse toonde aan dat Chit1 mRNA tot expressie wordt gebracht op vergelijkbare niveaus in normale humane en muizenlong. Daarentegen AMCase het expressieniveau in menselijke maag was significant lager dan die expressieniveau waargenomen in maag muis. Deze mRNA verschillen tussen mens en muis maag weefsels werden als gevolg van verschillen in de chitinolytische activiteiten en de niveaus van eiwitexpressie. Zo is de expressie van de AMCase in de maag is soortspecifiek

Visum:. Ohno M, Togashi Y, Tsuda K, Okawa K, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) Kwantificering van Chitinase mRNA Levels bij mens en muis weefsels door Real-Time PCR: Species-specifieke expressie van de zure zoogdieren Chitinase in de maag weefsels. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10.1371 /journal.pone.0067399

Editor: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 5 januari 2013; Geaccepteerd: 15 mei 2013; Gepubliceerd: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Ohno et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd gesteund door de Project Research Grant van het Research Institute of Science and Technology, Kogakuin University. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

chitine, dat een polymeer van N
acetyl-D-glucosamine, is de tweede meest voorkomende polysaccharide in de natuur [1]. Het is een integraal onderdeel van de exoskeletons van schaaldieren en insecten, de microfilarial omhulsels van parasitaire nematoden en schimmel celwanden [1], [2].

chitinasen zijn enzymen die de chitine polymeer verteren. Hoewel zoogdieren niet chitine produceren, mensen en muizen hebben twee genen die actief chitinasen chitotriosidase (Chit1) en zure zoogdieren chitinase (AMCase) coderen [2], [3]. Chit1 was de eerste zoogdieren chitinase worden gezuiverd en gekloond [4], [5]. AMCase, dat is de tweede meest actieve chitinase bij zoogdieren werd geïdentificeerd als compenserende enzym Chit1 en genoemd naar zijn optimale activiteit onder zure omstandigheden [6].

Beide enzymen vertonen sequentiehomologie bacteriële chitinasen en behoren familie 18 van glycosylhydrolasen, die ook chitinase-achtige eiwitten die structureel verwant is aan chitinasen maar missen chitinolytische activiteit [2], [3]. Het murine AMCase toont sequentiehomologie Chit1 met een identiteit van 52% en gelijkenis van 60% [6]. De locus van de humane Chit1 gen wordt gevonden op chromosoom 1Q32 [7], terwijl de humane AMCase gen is gelokaliseerd op chromosoom 1p13 [6]. Beide genen zijn samengesteld uit 12 exonen en coderen voor verschillende splice isovormen [6] - [9]. De sequentiehomologie en het behoud van de intron-exon grenzen tussen de Chit1 en AMCase genen suggereren dat deze genen is ontstaan ​​uit een duplicatie van een voorouderlijk gen [3], [6].

Recente studies hebben aangetoond associaties tussen de expressie van het zoogdierlijke chitinasen en ontstekingsaandoeningen. Zo worden de niveaus van Chit1 verhoogd in het plasma van patiënten met de ziekte van Gaucher, de bronchoalveolaire lavage vloeistof van rokers en patiënten met chronische obstructieve longziekte (COPD) en de cerebrospinale vloeistof van patiënten met de ziekte van Alzheimer [9] - [12] . AMCase expressie en activiteit worden ook opgereguleerd tijdens allergische reacties van de luchtwegen in muismodellen van astma [13]. Polymere chitine AMCase induceert expressie en de rekrutering van immuuncellen die zijn geassocieerd met allergie en astma [14]. Bovendien worden verschillende genetische varianten van AMCase geassocieerd met astma bij de mens [15], [16]. Deze resultaten suggereren sterk dat de chitinolytische enzymen spelen een belangrijke rol in de reactie op ziekte. Echter, hun pathofysiologische functies blijven slecht begrepen.

Het kwantificeren van Chit1 en AMCase mRNA-niveaus is een belangrijke stap in de richting van het begrip van de In vivo
regulering van chitinasen bij zoogdieren. We hebben onlangs een kwantitatieve PCR onder toepassing van een enkele standaard DNA te kwantificeren en vergelijk de expressieniveaus van het chitinase en referentie-genen op dezelfde schaal [17]. In onze vorige artikel hebben we aangetoond dat AMCase een belangrijk transcript in de maag van de muis tot expressie wordt gebracht op niveaus die vergelijkbaar zijn met die van pepsinogeen C [17] zijn.

Hier hebben we onze methodiek toegepast op de kwantificering van mRNA niveaus van het zoogdier chitinasen in normale humane weefsels, die een voorwaarde is voor het begrijpen van hun pathologische rol in zieke weefsels. Verder hebben we een kwantificering systeem om de mRNA niveaus van meerdere genen te vergelijken tussen verschillende humane weefsels en muis met een humaan-muis-hybride standaard DNA. Onze studie toont aan dat kwantitatief Chit1 mRNA expressie wordt gebracht op dezelfde wijze een hoog niveau in de normale mens en muis longen. Daarentegen wordt AMCase voornamelijk overexpressie in muizen, maar niet menselijke maag.

Resultaten

Oprichting en Validatie van een real-time PCR-systeem voor detectie van chitinasen in menselijke weefsels

we eerder vastgestelde een real-time PCR systeem geschikt zijn om de mRNA-niveaus van de twee zoogdiersoorten chitinasen in muizenweefsels en vergelijken van deze niveaus met die referentie genen met dezelfde schaal [17] is. In deze studie, wilden we de genexpressie niveaus van de Chit1 en AMCase genen vergelijken uit verschillende normale menselijke weefsels (Figuur 1A). Zoals in muizenweefsels [17] gebruikten we de housekeeping genen glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) en β-actine als referentie genen omdat zij constitutief op hoge niveaus tot expressie gebracht in de meeste cellen [18]. Daarnaast hebben we kozen pepsinogeen C (ook bekend als progastricsin) als een referentie-gen in de maag omdat het niveau van AMCase mRNA in de maag van de muis vergelijkbaar met het mRNA niveau van pepsinogeen C, dat een belangrijke component van het maagslijmvlies [vormt was ,,,0],19]. Met deze drie referentie genen, onderzochten we het gen expressieniveaus van Chit1 en AMCase in normale humane weefsels (Figuur 1A).

We ontwierpen verschillende sets primers voor de kwantitatieve PCR en evalueerden hun geschiktheid afhankelijk van of ze vertoonden een interne temperatuur smelten (Tm) en een enkele band op een 10% polyacrylamidegel [17]. Zie figuur S1A-E, de dissociatie curven van de vijf cDNA's vertonen slechts één piek elk. Gelelektroforese bleek duidelijk enkele banden bij de verwachte grootte voor Chit1 (55 bp), AMCase (62 bp), GAPDH (57 bp), β-actine (57 bp) en pepsinogeen C (61 bp) (figuur S1F). Zo bevestigden we de juiste PCR-producten werden geamplificeerd uit het humane cDNA weefsel mengsel.

We vervolgens geconstrueerd standaard template DNA voor real-time PCR door het ligeren van de fragmenten in vijf doel een één-op-één verhouding (Figuur 1B en Figuur S2). De 1396-nucleotide-lange standaard template-DNA bestond uit vijf cDNA fragmenten die de PCR doelgebied overdekt en 60-143 bases van de flankerende gebieden en bevatte Bgl
II, Sal
I, Xho
I en Niet
I restrictieplaatsen (Figuur 1B en figuur S2).

de kwantificering van zowel de chitinasen en de referentie-mRNA is gebaseerd op standaard curves. We gebruikten de standaard curves te vergelijken en evalueren van de real-time PCR kwantificering strategieën. Elke standaardkromme werd gegenereerd met behulp van 10-voudige seriële verdunningen van de standaard menselijke DNA en vijf verschillende primerparen (Figuur S3A-E, red gesloten cirkels). Door het standaard template DNA met de vijf menselijke cDNA-fragmenten, kunnen gelijke hoeveelheden worden toegewezen aan de vijf genen in elke verdunning gebruikt de standaard curves construct (Figuur S3A-E, red gesloten cirkels).

Testen de gelijkheid van de bochten, een bekende concentratie van het humane volledige coderende cDNA werd geamplificeerd en vervolgens geanalyseerd als een onbekend monster. Deze test werd uitgevoerd om te controleren of elke geteste verdunning resulteerde in de verwachte hoeveelheid. Zoals getoond in Figuur S3A-E, blauw gesloten ruiten, gelijke hoeveelheden werden waargenomen voor elke geteste verdunning; Deze werden gebruikt om de standaardkromme te construeren.

De kwantificatie van lage abundantie transcripten en overvloedige transcripten kunnen we de gevoeligheid en betrouwbaarheid van real-time PCR bevestigen, wat aangeeft dat onze real-time PCR methode biedt een groot dynamische bereik van kwantificering, hoge nauwkeurigheid en hoge gevoeligheid (Figuur S3A-E). Zo, onze real-time PCR-methode zorgt voor een betrouwbare waarden voor de twee menselijke chitinase genen en de drie menselijke verwijzing genen op dezelfde schaal.

Expressie van Chit1 en AMCase in normale humane weefsels

Om bestuderen in vivo
regulatie van de expressie van de menselijke Chit1 en AMCase genen totaal RNA uit verschillende normale humane weefsels werd geanalyseerd met een kwantitatieve real-time PCR met specifiek ontworpen standaard DNA (Figuur 1). De verkregen waarden werden uitgedrukt als moleculen per 10 ng totaal RNA in y-richting (Figuur 2 en Figuur 3).

Zowel Chit1 en AMCase mRNA's werden algemeen voor in normale humane weefsels (figuur 2A en 2B). De hoogste Chit1 mRNA werden gedetecteerd in menselijke long, gevolgd door milt, foetale lever en thymus (Figuur 2A). De hoogste AMCase mRNA werden gedetecteerd in de longen, gevolgd door foetale hersenen, lever, schildklier en hart (Figuur 2B). Hoewel AMCase mRNA tot expressie kwam uitzonderlijk hoge niveaus in de maag van de muis [17], het expressieniveau in het menselijke maag was veel lager dan in long, foetale hersenen, foetale lever, schildklier en hart (Figuur 2B). In andere weefsels, werden zowel de Chit1 en AMCase mRNA expressie bij lage, maar gemakkelijk detecteerbare niveaus boven de achtergrond (Figuur 2A en Figuur 2B).

Vergeleken met AMCase mRNA, Chit1 mRNA tot expressie kwam relatief hogere niveaus in milt en foetale lever. Daarentegen, foetale hersenen, prostaat en lever tot expressie een grotere hoeveelheid mRNA AMCase dan Chit1 mRNA (Figuur 2).

Analyse van de expressieniveaus van Chit1, AMCase, GAPDH, β-actine en Pepsinogen C mRNAs in normale Menselijke long en maag weefsels

Omdat veel studies naar de pathofysiologie van zoogdier chitinases zijn uitgevoerd via long en maag [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], vergeleken we de expressieniveaus van de chitinasen en de verwijzing genen in deze twee menselijke weefsels. De kwantitatieve gegevens worden getoond in figuur 3. normaliseren Chit1 het niveau 1,0, de relatieve expressieniveaus van AMCase, GADPH en β-actine mRNA in humaan longweefsel waren 0,8, 39 en 343, respectievelijk (figuur 3A). De GAPDH en β-actine-genen zijn bekend housekeeping genen worden constitutief tot expressie op hoog niveau in de meeste weefsels [18]. Onze resultaten geven aan dat Chit1 en AMCase mRNA expressie op vergelijkbare niveaus in normaal menselijk longweefsel, hoewel de Chit1 expressie was veel lager dan die van de twee housekeeping genen (vergelijk non-log grafiek van log grafiek in figuur 3).

normaliseren Chit1 het niveau 1,0, de relatieve expressieniveaus van de AMCase, GAPDH, β-actine en pepsinogeen C bij normale menselijke maag weefsel waren 1,5, 323, 1736 en 3962, respectievelijk (Figuur 3B). Hier, de expressieniveaus van zowel Chit1 en AMCase waren veel lager dan die van GAPDH en β-actine. Hoewel pepsinogeen C mRNA sterk tot expressie werd gebracht in de menselijke maag monsters AMCase mRNA was vergelijkbaar met Chit1. Deze resultaten geven aan dat de Chit1 en AMCase expressie niveaus zijn relatief laag in de menselijke weefsels onderzocht en dat de AMCase expressie niveau in de maag verschilt sterk tussen mens en muis.

Oprichting en validatie van een kwantificering systeem voor de mens en de Chitinase muis mRNA's met behulp van een muis-menselijk hybride DNA

We naast getracht de expressieniveaus van beide chitinasen tussen mensen en muizen te vergelijken op dezelfde schaal met een real-time PCR (zie figuur 4A). Daarom construeerden een mens-muis-hybride standaard DNA voor real-time PCR door het ligeren van de mens en muis standaard template DNA (Figuur 4B). Het resulterende 2305-nucleotide-lange template-DNA bevatte tien cDNA fragmenten die de PCR doelgebied overdekt en 9-143 bases van de flankerende gebieden van de mens en muis genen (zie details in figuur S4).

De validaties van de standaardcurve en kwantitatieve real-time PCR systeem werden uitgevoerd zoals getoond in figuur S5, S6 en Figuur Figuur S7. Seriële verdunningen van de mens-muis-hybride standaard DNA werden gebruikt om een ​​standaardkromme te construeren. Elke standaardkromme werd gegenereerd met behulp van 10-voudige seriële verdunningen van de standaard DNA en de vijf verschillende primerparen (Figuur S5A-E, red dichte cirkels). Door het standaard template DNA dat de vijf cDNA-fragmenten, kunnen gelijke hoeveelheden worden toegewezen aan alle vijf menselijke genen middels humaan-specifieke primerparen in elke verdunning werd gebruikt om de standaard curves construct (Figuur S5A-E, red gesloten cirkels ). Evenzo kunnen gelijke hoeveelheden aan alle vijf muizen genen (Figuur S6A-E, paars dichte driehoeken) worden toegewezen.

De gelijkheid van de bochten, een bekende concentratie van de volledige coderende cDNA werd geamplificeerd en getest vervolgens geanalyseerd als een onbekend monster. Gelijke hoeveelheden van de menselijke volledige coderende cDNA's werden waargenomen voor elke geteste verdunning; deze hoeveelheden werden vervolgens gebruikt om de standaardkromme te construeren (fig S5A-E, blauw gesloten ruiten). Zo werden gelijke hoeveelheden van de muis volledige coderende cDNAs ook waargenomen (Figuur S6A-E, groene kruisjes). De kwantificatie van lage abundantie transcripten en overvloedige transcripten kunnen we de gevoeligheid en betrouwbaarheid van real-time PCR bevestigen, wat aangeeft dat onze real-time PCR methode biedt een groot dynamisch bereik van de kwantificatie, hoge nauwkeurigheid en hoge gevoeligheid (Figuur S5A- E en Figuur 6A-E).

Bovendien, de vier lijnen (twee standaard krommen en twee verdunningscurven van de bekende concentraties van de mens en muis gehele coderende cDNAs respectievelijk) overlapt (figuur S7a-E). Aldus onze real-time PCR-methode betrouwbare relatieve waarden voor de vier chitinase genen en de zes referentie genen (Figuur 4B).

Vergelijking van Chit1 en AMCase mRNA niveaus tussen normale menselijke weefsels en Muis

We gebruikten de Human Totaal RNA Master Panel II en de muis Totaal RNA Master Panel (Clontech Laboratories) als bron van totaal RNA voor deze studie. Er zijn vier weefsels (longen, lever, milt en nier) dat overlap tussen de mens en muis panelen en in verband met astma en de ziekte van Gaucher. Aangezien op opvallende verschillen in de chitinase expressie in de maag weefsels waren, keken we ook de niveaus van expressie van deze chitinasen in andere spijsverteringsorganen, speekselklier, maag, dunne en dikke darm tussen mens en muis. Wij gekwantificeerd en vergeleken de expressieniveaus in deze weefsels met de mens-muis-hybride standaard DNA (Figuur 4B); de kwantitatieve gegevens worden getoond in figuur 5.

We hebben het hoogste expressieniveau van Chit1 mRNA in muis (maar niet menselijk) maag, gevolgd door menselijke longen. Overall, werd Chit 1 mRNA expressie op hogere niveaus in de menselijke weefsels dan bij muizen weefsels behalve maag (figuur 5A). De hoogste expressie niveau van AMCase mRNA was in de maag muis, gevolgd door muis speekselklier. In de andere humane en muisweefsels de AMCase mRNA niveaus waren laag in menselijke weefsels (figuur 5B). Zowel Chit1 en AMCase mRNA in kleine en grote darm waren zeer laag in zowel mens en muis weefsels (figuur 5), die in overeenstemming met eerdere gegevens verkregen door Northern blotting [6], [21].

We waren gevonden dat AMCase mRNA expressie werd gebracht op lage niveaus in normale humane maag maar werd sterk tot expressie gebracht in de maag muisweefsels (Figuur 5B). Dus vergeleken we ook de expressieniveaus van de chitinasen en de referentie-genen met de cDNA's die werden bereid uit de long en maag weefsels.

normaliseren menselijke Chit1 niveau in het longweefsel 1,0, de relatieve expressieniveaus van de muis Chit1, humaan en muis AMCase AMCase mRNA's waren 0,3, 0,3 en 7, respectievelijk (figuur 6A). Murine AMCase werd sterk tot expressie gebracht in de muizenlong. Het niveau van mRNA Chit1 in de menselijke long was ongeveer 3 maal hoger dan in muizenlong. De Chit1 en AMCase mRNA niveaus waren significant lager dan de expressieniveaus van GAPDH en β-actine-genen (Figuur 6A).

normaliseren het menselijke Chit1 niveau to1.0 maag, de relatieve expressieniveaus van de muis Chit1 het menselijk AMCase en muis AMCase mRNAs waren 10, 0,7 en 1978 respectievelijk (Figuur 6B). Pepsinogeen C is een belangrijke verteringsenzymen in de maag. Het expressieniveau van AMCase bij muizen was veel hoger dan die van GAPDH en β-actine en was vergelijkbaar met het niveau van pepsinogeen C, terwijl de menselijke maag vertoonde een zeer lage AMCase mRNA expressie. De relatieve expressieniveaus van mRNA in de maag mens en muis waren 1,0 en 2826 respectievelijk.

Om te controleren of het mRNA niveauverschillen tussen muis en mens werden gereflecteerd op het eiwitniveau, we vervolgens geanalyseerd enzymatische activiteit deze chitinasen in de maag weefsels. We hebben eerst geanalyseerd AMCase activiteit in muizen en menselijke maag weefsels. De muis AMCase toont een dual pH optimum bij een grote optimum tussen pH 2 en een tweede optimum pH 5 [6], terwijl menselijke AMCase toont brede optimale pH bij pH 2~pH 5 [16], [24]. Derhalve maten wij chitinolytische activiteit bij pH 2,0 en pH 5,0 met behulp van het synthetische substraat 4-methylumbelliferyl-β-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Detecteerden we sterke chitinolytische activiteit in muizen maag extract bij pH 2,0 en sterke activiteit bij pH 5,0. Daarentegen werd geen activiteit gedetecteerd in die van humaan bij pH 2,0 en zeer lage activiteit werd waargenomen bij pH 5,0 (Figuur 7A, links).

De algemene Chit1 enzymatische test werd uitgevoerd onder toepassing van 4-methylumbelliferyl β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) bij pH 5,2 [6], [10], [21], [25]. Om het effect van AMCase op Chit1 activiteit monitoren, analyseren we de chitinase activiteit met 4MU-chitotriose bij pH 2,0. Relatief sterke chitinase activiteit tegen 4MU-chitotriose werd gedetecteerd in de muis maag extract bij pH 2,0 (Figuur 7A rechts), en detecteerden we ook zwakke chitinase activiteit bij pH 5,2 (Figuur 7A rechts). Aangezien AMCase een tweede optimum bij ongeveer pH 5 deze resultaten aan dat het merendeel van chitinolytische activiteit bij pH 5,2 kan worden veroorzaakt AMCase plaats Chit1 en muis AMCase 4MU-chitotriose kan hydrolyseren als substraat bij pH 2,0. Samengevat, de meerderheid van chitinaseactiviteit in de maag van de muis gevolg van AMCase activiteit. In de menselijke maag extract zagen we ook zeer zwak, maar detecteerbare niveaus van chitinolytische activiteit bij pH 2,0 en pH 5,2 (Figuur 7A, rechts, onderste paneel). Chitinase activiteit bij pH 5,2 was vergelijkbaar met dat bij pH 2,0, wat aangeeft Chit1 expressie in menselijke maag.

Tenslotte wij de niveaus van eiwitexpressie geanalyseerd door Western blotting met gebruik van antilichamen tegen AMCase. De anti-AMCase antilichamen werden gegenereerd tegen de eerder gerapporteerde muis peptide [14] en menselijke tegenhanger. Anti-muis AMCase antilichaam herkende een robuust enkel eiwit band in uittreksel uit maag muis maar niet van de mens (Figuur 7B, links). Evenzo anti-humaan antilichaam AMCase balans een enkele band bij de muis extract (figuur 7B, rechts). In het menselijk extract waren vage banden van enigszins hoger molecuulgewicht die zowel mens en muis antilichamen (Figuur 7B) werden opgenomen. Aangezien er geen significant chitinaseactiviteit op ofwel pH 2,0 of pH 5,0 gevolgd door het gebruik 4MU-chitobiose in menselijke maag extract, kon deze banden niet worden gekoppeld aan de menselijke AMCase. Bijgevolg chitinolytische activiteiten en de relatieve eiwit expressie niveaus tussen muis en menselijke maag weefsels waren in overeenstemming met onze gegevens die zijn verkregen op het mRNA-niveau.

Discussie

Vorige studies over de In vivo
regulatie van Chit1 en AMCase bij mens en muis werden uitgevoerd onder toepassing van Northern blotting, semi-kwantitatieve PCR en real-time PCR [6], [8], [9], [13], [14], [22] , [23]. Hoewel deze werkwijzen hebben verscheidene voordelen boven het onderzoek van genexpressie patronen, niet zij de niveaus van de verschillende gentranscripten vergelijken op dezelfde schaal. In de huidige studie, pasten we onze methode [17] om de expressieniveaus van deze chitinasen in menselijke weefsels te onderzoeken. Teneinde voorts de expressieniveaus van chitinasen bij mens en muis weefsels evalueren, ontwikkelden we een kwantificering systeem met een enkele menselijke en muis-hybride standaard DNA. We toonden weefsel- en species-specifieke expressie van de twee zoogdieren actieve chitinasen, Chit1 en AMCase. Onze gegevens ondersteunt het algemeen eerdere studies door Boot et al [6], [21]. Echter, de analyse is voldoende gevoelig om mRNA te detecteren en geeft een uitgebreid overzicht van de genexpressiepatronen van de chitinasen bij mens en muis weefsels op dezelfde schaal.

Een opvallend kenmerk van de expressie van het zoogdierlijke chitinasen is de geconserveerde expressie van Chit1 tussen mens en muis longen. We vonden dat Chit1 werd uitgedrukt relatief hoog bij mens en muis longen bijna met elkaar vergelijkbaar zijn, wat aangeeft dat het expressieniveau van het mRNA Chit1 behouden. In de longen, kan Chit1 optreden als deel van het gastheer afweersysteem dat beschermt tegen chitine bevattende ziekteverwekkers, zoals schimmels en mijten [25]. Het behoud van Chit1 genexpressie bij mensen en muizen suggereert het fysiologisch belang van Chit1 in de longen.

De expressie van chitinasen in de maag van bijzonder belang. AMCase mRNA wordt gesynthetiseerd op uitzonderlijk hoge niveaus in de maag van de muis, maar niet in de menselijke maag (figuur 6B). De vergelijking van deze expressieniveaus gebleken dat de AMCase mRNA-niveau in de menselijke maag ongeveer 1/2800 van dat in de muizen tegenhanger. We bevestigden dat de expressieniveaus van mRNA pepsinogeen C en de twee housekeeping genen waren zeer hoog in de maag mens en muis weefsel (Figuur 6B). Aldus verminderde het expressieniveau van mRNA AMCase in de menselijke maag is niet te wijten aan RNA-afbraak tijdens de cDNA bereiding. Verder vonden we dat de maag muis uitgedrukt grote hoeveelheid AMCase, terwijl de menselijke tegenhanger niet (Figuur 7). Deze resultaten geven aan dat het expressieniveau van het AMCase in de maag weefsels sterk verschilt tussen mensen en muizen.

De maag is een belangrijk orgaan dat een fundamentele rol bij de vertering van voedingsmiddelen tegen schadelijke organismen speelt. Zoutzuur wordt uitgescheiden in de maag, waardoor zure omstandigheden (pH = -2) geschikt voor de vertering van eiwitten door pepsine [19], [26]. Murine AMCase toont diepe zuurstabiliteit en het meest actief bij ongeveer pH 2 [6]. De maag muis produceert een enorme hoeveelheid AMCase mRNA [17] en het translatieproduct (Figuur 7). Bijgevolg AMCase kan functioneren als een digestief enzym dat chitine bevattende voedingsmiddelen in de maag van de muis.

In tegenstelling, het expressieniveau van mRNA AMCase en het product relatief laag in de menselijke maag (figuur 5, figuur 6 en figuur 7). Dit is niet onverwachts omdat de moderne mens geen significante hoeveelheid chitine-bevattende voedingsmiddelen te eten. Deze resultaten suggereren dat AMCase geen rol kan spelen bij de afweer tegen chitine bevattende organismen in de menselijke maag. Veel maag ziekten zijn geassocieerd met infectie door exogene organismen. De ernst van gastritis infecties zoals Helicobacter pylori
correleren met de werking van endogene enzymen [23]. Het blijft derhalve een punt van discussie of de lage AMCase in de menselijke maag deelneemt aan de reactie op maagaandoeningen.

Een hoog chitinolytische activiteiten werden gedetecteerd in extracten van maag en darmen muis [6] . Aangezien er belangrijke verschillen in de niveaus van chitinase expressie in de maag tussen mens en muis, onderzochten we de expressieniveaus van deze chitinasen in andere spijsverteringsorganen, zoals speekselklier en dunne en dikke darm. Onze resultaten geven aan dat zowel Chit1 en AMCase mRNA in kleine en grote darm waren zeer laag in zowel mens en muis weefsels, hoewel muis speekselklier en maag geproduceerd hoge niveaus van zowel chitinases mRNA (Figuur 5). Deze resultaten suggereren dat zoogdieren chitinase eiwitten in de muis darm waarschijnlijk afgeleid van de bovenste delen van het maagdarmkanaal, zoals speekselklier en maag, die in overeenstemming met de stand begrip door Boot et al [6], [21].

de expressieniveaus van het gen Chit1 in longweefsel is geconserveerd tussen muis en mens. In tegenstelling, het expressieniveau van het AMCase in maag weefsels soortspecifiek. De resultaten suggereren dat de regulering van de expressie van mRNA Chiti1 in de longen is bewaard gebleven tijdens de evolutie, dat de verminderde expressie van AMCase in de menselijke maag het gevolg van genuitschakeling kan zijn. Het onderzoek naar de regulering van de expressie van deze zoogdieren chitinasen kon inzichten in de pathofysiologische rol van deze enzymen geven. Een gedetailleerde karakterisering van de promotor regio's van de Chit1 en AMCase genen en de identificatie van de cis
- en trans
-werkende factoren die nodig zal zijn voor het begrijpen van het selectieve genexpressie van deze chitinasen bij mensen en muizen.

De expressie van Chit1 en AMCase mRNA geïnduceerd onder verschillende pathologische omstandigheden. Met behulp van de kwantitatieve systeem hier beschreven, zullen we in staat zijn om de chitinase mRNA niveaus in mens en muis weefsels met elkaar vergelijken door real-time PCR. Deze analyse zal het inzicht in de biologische functie van deze chitinasen steun, vooral in de pathofysiologische studies van humane ziekte met knaagdiermodellen. Onze werkwijze is toepasbaar voor de kwantificering van het mRNA van meerdere genen tussen mens en muis specimens volgens dezelfde schaal. Een praktische toepassing van deze vergelijkende cross-species genexpressie data is de vergelijking van ziekten bij de mens met muis en celcultuur modellen.

Materialen en methoden

RNA en cDNA Voorbereiding

het menselijk Totaal RNA Master Panel II en de muis Totaal RNA Master Panel (Clontech Laboratories) werd gebruikt om de verdeling van transcripten in verschillende weefsels te onderzoeken. Menselijke dunne darm Totaal RNA werd gekocht bij Clontech Laboratories. Daarnaast werd RNA geïsoleerd uit speekselklier en dunne en dikke darm van 3 maanden oude mannelijke muizen. C57BL /6J muizen (CLEAR Japan) werden gefokt op het RIKEN Brain Science Institute Animal Facility. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Het protocol werd goedgekeurd door het Comité voor de ethiek van dierproeven van de RIKEN Brain Science Institute (Goedkeuring nr H19-2B013). Alle operatie werd uitgevoerd met behulp van diethylether als verdovingsmiddel, en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. Doekjes voor het mRNA voorbereiding werden verstrekt door Drs. Miyazaki en Nukina bij RIKEN Brain Science Institute. Totaal RNA werd bereid uit speekselklier en dunne en dikke darm via TRIzol Reagent (Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant. We analyseerden 21 verschillende menselijke weefsels en acht volwassen muizenweefsels. Om sporen te verwijderen van verontreinigend genomisch DNA, werden totale RNA monsters behandeld met RQ1 RNase-vrij DNase (Promega) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Elk van de totale RNA-monsters onderworpen aan reverse transcriptie met behulp van willekeurige hexameren als primers, zoals eerder beschreven [17].

Real-time PCR

De opstelling en validatie van de real-time PCR voor humaan weefsel werden uitgevoerd zoals beschreven [17]; De enige uitzondering was het gebruik van menselijke primers. De nucleotide sequenties van de primers die werden geselecteerd voor de real-time PCR voor het menselijk lichaam worden in Tabel S1. Elk monster werd geamplificeerd in drievoud, en elk experiment werd ten minste tweemaal herhaald.

Constructie van het menselijk standaard DNA en bereiding van vijf menselijke cDNA's die het gehele coderende gebied

De constructie van de standaard template DNA voor de menselijke genen en de opstelling van de vijf menselijke cDNA's die het gehele coderende gebied bedekt werden in hoofdzaak uitgevoerd zoals beschreven [17]; De enige uitzondering was het gebruik van menselijke primers. De voorwaartse en omgekeerde primers zijn opgesomd in Tabel S2. De PCR-producten werden gedigereerd met de geschikte restrictie-enzymen en geligeerd met T4 DNA ligase. De geligeerde fragmenten werden geamplificeerd met de voorwaartse primer 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'en de reverse primer 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' en gekloneerd in de pGEM-T Easy-vector (Promega). De gecontroleerde sequenties van de cDNA's weergegeven in figuur S2. Nee.

• PLoS ONE: Maag Temperatuur Records Reveal Nursing Gedrag en Overgang naar Solid Verbruik Eten in een niet-gespeende Zoogdier, de Harbour Seal Pup (Phoca vitulina)
• PLoS ONE: Serum apolipoproteïnen CI en C-III worden gereduceerd in maagkankerpatiënten: Resultaten uit MALDI-Based Peptidoomanalyse en Immuno-gebaseerde klinische Assays