PLoS ONE: Kvantificering af chitinase- mRNA Niveauer i mennesker og mus væv ved Real-Time PCR: artsspecifik ekspression af sure pattedyr chitinase i mave væv

abstrakt

chitinase hydrolyserer chitin, som er en N
acetyl-D-glucosamin polymer, der er til stede i en lang række organismer, herunder insekter, parasitter og svampe. Selvom pattedyr ikke indeholder endogene chitin, mennesker og mus udtrykker to aktive kitinaser, chitotriosidase (Chit1) og sure pattedyr chitinase (AMCase). Fordi niveauet af ekspression af disse chitinaser er forøget i mange inflammatoriske tilstande, herunder Gauchers sygdom og musemodeller for astma kan begge chitinaser spiller vigtige roller i patofysiologier af disse og andre sygdomme. Vi har for nylig etableret et kvantitativ PCR-system ved hjælp af en enkelt standard DNA og viste, at AMCase mRNA syntetiseres på ekstraordinært høje niveauer i mus mave væv. I denne undersøgelse har vi anvendt denne metode til kvantificering af chitinase mRNA'er i humane væv og fandt, at begge chitinase mRNA'er bredt blev udtrykt i normale humane væv. Chit1 mRNA blev højt udtrykt i human lunge, hvorimod AMCase mRNA ikke blev overudtrykt i normale humane mave væv. Niveauerne af disse mRNA i humane væv var betydeligt lavere end niveauet af husholdning gener. Fordi AMCase ekspressionsniveauer var meget forskellige for de humane og muse mave væv, udviklede vi et kvantitativt PCR-system til at sammenligne mRNA niveauer mellem humane og murine væv anvendelse af et humant-muse-hybrid standard DNA. Vores analyse viste, at Chit1 mRNA udtrykkes ved tilsvarende niveauer i normal human og muse lunge. I modsætning hertil AMCase ekspressionsniveau i menneskelige mave var signifikant lavere end ekspressionsniveau observeret i mus maven. Disse mRNA forskelle mellem mennesker og mus mave væv blev der afspejler forskelle i de kitinolytiske aktiviteter og niveauer af protein-ekspression. Således er ekspressionsniveauet af det AMCase i maven er artsspecifik

Henvisning:. Ohno M, Togashi Y, Tsuda K, Okawa K, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) Kvantificering af chitinase- mRNA-niveauer i mennesker og mus Væv af Real-Time PCR: artsspecifik ekspression af sure pattedyr chitinase i mave væv. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10,1371 /journal.pone.0067399

Redaktør: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, USA

Modtaget: Januar 5, 2013; Accepteret: 15. maj 2013; Udgivet: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Ohno et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Project Research Grant fra Research Institut for Videnskab og Teknologi, Kogakuin Universitet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

chitin, som er en polymer af N
acetyl-D-glucosamin, er den anden mest forekommende polysaccharid i naturen [1]. Det er en integreret del af de exoskeletons af krebsdyr og insekter, de microfilarial skeder af nematoder og svampe-cellevægge [1], [2].

chitinaser er enzymer, fordøje den kitin polymer. Selvom pattedyr ikke frembringer chitin, mennesker og mus har to gener, der koder aktive chitinaser, chitotriosidase (Chit1) og sure pattedyr chitinase (AMCase) [2], [3]. Chit1 var den første mammale chitinase, der skal oprenses og klonet [4], [5]. AMCase, som er den anden mest aktive chitinase i pattedyr, blev identificeret som en kompenserende enzym til Chit1 og opkaldt efter sin optimale aktivitet i sure betingelser [6].

Begge enzymer udviser sekvenshomologi til bakterielle chitinaser og tilhører familie 18 af glycosylhydrolaser, som også omfatter chitinase-lignende proteiner, som er strukturelt beslægtet med chitinaser men mangler kitinolytisk aktivitet [2], [3]. Den murine AMCase viser sekvenshomologi til Chit1, med en identitet på 52% og en lighed på 60% [6]. Det geometriske sted for den humane Chit1 genet findes på kromosom 1q32 [7], hvorimod den humane AMCase genet er lokaliseret på kromosom 1p13 [6]. Begge gener er sammensat af 12 exoner og kode forskellige splejsningsisoformer [6] - [9]. Sekvensen homologi og bevarelse af intron-exon grænserne mellem Chit1 og AMCase generne tyder på, at disse gener er opstået fra en gentagelse af en nedarvet gen [3], [6].

Nylige undersøgelser har vist associationer mellem ekspressionen af ​​de mammale chitinaser og inflammatoriske tilstande. For eksempel er niveauet af Chit1 forhøjede i plasma hos patienter med Gauchers sygdom, bronkoalveolærvaskevæsken af ​​rygere og patienter med kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) og cerebrospinalvæsken hos patienter med Alzheimers sygdom [9] - [12] . AMCase ekspression og aktivitet er også opreguleret under allergiske luftvejsresponser i musemodeller for astma [13]. Polymere kitin inducerer AMCase udtryk og rekruttering af immunceller, der er forbundet med allergi og astma [14]. Derudover er adskillige genetiske varianter af AMCase forbundet med bronkial astma i mennesker [15], [16]. Disse resultater antyder kraftigt, at de kitinolytiske enzymer spiller en vigtig rolle i respons på sygdom. Men stadig deres patofysiologiske funktioner dårligt forstået.

Kvantificering af Chit1 og AMCase mRNA-niveauer er et vigtigt skridt hen imod forståelse af in vivo
regulering af chitinaser i pattedyr. Vi har for nylig etableret et kvantitativ PCR-system ved hjælp af en enkelt standard DNA at kvantificere og sammenligne ekspressionsniveauerne af de chitinase og reference- gener i samme omfang [17]. I vores tidligere papir, viste vi, at AMCase er en stor udskrift i musen maven og udtrykkes på niveauer, der er sammenlignelige med dem af pepsinogen C [17].

Her har vi anvendt vores metode til kvantificering af mRNA-niveauer af pattedyr-chitinaser i normale humane væv, hvilket er en forudsætning for at forstå deres patologiske roller i sygt væv. Endvidere har vi etableret en kvantificering system til at sammenligne mRNA niveauerne af multiple gener mellem et antal humane og musevæv anvendelse af et humant-muse-hybrid standard DNA. Vores undersøgelse viser kvantitativt at Chit1 mRNA udtrykkes ved tilsvarende høje niveauer i normale mennesker og mus lunger. I modsætning hertil er AMCase overvejende overudtrykt i mus, men ikke menneskelige mave.

Resultater

Etablering og Validering af en Real-time PCR-systemet til detektion af chitinaser i humant væv

vi har tidligere etableret en real-time PCR-system, der er i stand til at bestemme mRNA-niveauer i de to mammale chitinaser i musevæv og sammenligne disse niveauer med de reference- gener efter samme tabel [17]. I denne undersøgelse ønskede vi at sammenligne genekspressionsniveauer af Chit1 og AMCase gener tværs normale humane væv (figur 1A). Som i muse væv [17], brugte vi husholdning gener glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) og β-actin som referencepunkter gener, fordi de konstitutivt udtrykkes på højt niveau i de fleste celler [18]. Desuden valgte vi pepsinogen C (også kendt som progastricsin) som reference gen i maven, fordi niveauet af AMCase mRNA i muse maven var sammenlignelig med mRNA-niveauet af pepsinogen C, hvilket udgør en væsentlig bestanddel af maveslimhinden [ ,,,0],19]. Ved hjælp af disse tre referencepunkter gener, vi evaluerede genekspressionsniveauer af Chit1 og AMCase i normale humane væv (figur 1A).

Vi har designet flere sæt af primere for kvantitativ PCR og evalueret deres egnethed baseret på, om de udviste en enkelt smeltetemperatur (Tm) og et enkelt bånd på en 10% polyacrylamidgel [17]. Som vist i figur S1A-E, dissociationsprodukterne kurver for de fem cDNA'er udviser kun én top hver. Gelelektroforese viste klart enkelt bands på de forventede størrelser for Chit1 (55 bp), AMCase (62 bp), GAPDH (57 bp), β-actin (57 bp) og pepsinogen C (61 bp) (figur S1F). Vi bekræftede således, at de korrekte PCR-produkter blev amplificeret fra den humane væv cDNA blanding.

Vi næste konstrueret en standard template DNA til realtids-PCR ved at ligere de fem target-fragmenter i en en-til-en-forhold (Figur 1B og Figur S2). Den 1396-nukleotid-lange standard skabelon-DNA bestod af fem cDNA fragmenter, der er omfattet PCR målområdet og 60-143 baser af de flankerende regioner og indeholdt Bgl
II, Sal
jeg, Xho
i og Ikke
i restriktionssites (figur 1B og Figur S2).

kvantificering af både chitinaser og reference- mRNA afhængig standardkurver. Vi brugte de standard kurver at sammenligne og evaluere de real-time PCR kvantificering strategier. Hver standardkurve blev genereret ved anvendelse af 10-foldige seriefortyndinger af den humane standard DNA og de fem forskellige primerpar (figur S3A-E, rød lukkede cirkler). Ved at bruge standard template DNA, der indeholder de fem menneskelige cDNA fragmenter, kan lige mængder tildeles alle fem gener i hver fortynding brug for at konstruere standard kurver (Figur S3A-E, rød lukkede cirkler).

For at teste lighed for kurverne, en kendt koncentration af det humane hele den kodende cDNA blev amplificeret og efterfølgende analyseret som en ukendt prøve. Dette assay blev udført for at verificere, at hver testet fortynding resulterede i den forventede mængde. Som vist i figur S3A-E, blå lukkede romber, lige mængder blev observeret for hver testet fortynding; disse blev anvendt til at konstruere standardkurven.

Kvantificeringen af ​​med lav hyppighed transkripter og rigelige transkripter tillader os at validere følsomhed og pålidelighed realtids-PCR, hvilket indikerer, at vores real-time PCR-metoden tilbyder et dynamikområde kvantificering, høj nøjagtighed og høj følsomhed (Figur S3A-E). Således er vores real-time PCR-metode giver pålidelige værdier for de to menneskelige chitinase gener og de tre menneskelige reference- gener på samme skala.

Angivelse af Chit1 og AMCase i normalt humant væv

Til studere in vivo
regulering af ekspressionen af ​​de humane Chit1 og AMCase generne, blev totalt RNA fra forskellige normale humane væv analyseres ved anvendelse af en kvantitativ real-time PCR-analyse med specielt designet standard DNA (figur 1). De resulterende værdier blev udtrykt som molekyler pr 10 ng af total RNA i y-aksen (figur 2 og figur 3).

Både Chit1 og AMCase mRNA'er blev bredt udtrykt i normale humane væv (figur 2A og 2B). blev påvist de højeste niveauer af Chit1 mRNA i human lunge, efterfulgt af milt, føtal lever og thymus (figur 2A). blev påvist de højeste niveauer af AMCase mRNA i lungen, efterfulgt af føtal hjerne, lever, skjoldbruskkirtel og hjerte (figur 2B). Selv AMCase mRNA blev udtrykt på ekstraordinært høje niveauer i musen maven [17], dens udtryk niveau i den menneskelige mave var meget lavere end i lunge, føtal hjerne, føtal lever, skjoldbruskkirtel og hjerte (figur 2B). I andre væv, blev både Chit1 og AMCase mRNA udtrykt ved lav, men let påviselige niveauer over baggrund (figur 2A og 2B).

Sammenlignet med AMCase mRNA-niveauer, Chit1 mRNA blev udtrykt ved relativt højere niveauer i milt og føtal lever. I modsætning hertil føtal hjerne, prostata og lever udtrykt en større mængde AMCase mRNA end Chit1 mRNA (figur 2).

Analyse af ekspressionsniveauerne af Chit1, AMCase, GAPDH, β-actin og Pepsinogen C mRNA i normale human lunge og mave Væv

Fordi mange undersøgelser om patofysiologien af ​​mammale chitinaser er blevet udført under anvendelse af lunge og mave [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], sammenlignede vi ekspressionsniveauerne af de chitinaser og reference- gener i disse to humane væv. De kvantitative data er vist i figur 3. normalisere Chit1 niveau til 1,0, de relative ekspressionsniveauer af AMCase, GADPH, og p-actin mRNA'er i humant lungevæv var 0,8, 39 og 343, henholdsvis (figur 3A). GAPDH og p-actin gener er velkendte husholdningsgener og er konstitutivt udtrykt i høje niveauer i de fleste væv [18]. Vores resultater viser, at Chit1 og AMCase mRNA'er er udtrykt på tilsvarende niveauer i normalt humant lungevæv, selv om Chit1 ekspressionsniveauet var meget lavere end for de to housekeeping-gener (sammenlign non-log plot med log plot i figur 3).

normalisere Chit1 niveau til 1,0, de relative ekspressionsniveauer af AMCase, GAPDH, β-actin og pepsinogen C i normalt humant mavevæv var 1,5, 323, 1.736 og 3.962, henholdsvis (figur 3B). Her ekspressionsniveauerne af både Chit1 og AMCase var meget lavere end GAPDH og β-actin. Selvom pepsinogen C mRNA blev højt udtrykt i de humane mave prøver, AMCase mRNA var sammenlignelig med Chit1. Disse resultater indikerer, at Chit1 og AMCase ekspressionsniveauerne er relativt lavt i de humane væv undersøgt og at AMCase ekspressionsniveauet i maven varierer betydeligt mellem mennesker og mus.

Etablering og Validering af en Kvantificering System for menneskelige og mus chitinase mRNA'er anvendelse af et humant-muse-hybrid-DNA

Vi næste søgt at sammenligne ekspressionsniveauerne af de to chitinaser mellem mennesker og mus i samme målestok under anvendelse af et realtids-PCR (figur 4A). Vi konstruerede derfor et humant-muse-hybrid standard DNA for realtids-PCR ved at ligere de humane og muse standard template-DNA'er (figur 4B). Det resulterende 2305-nukleotid-lang template DNA indeholdt ti cDNA fragmenter, der er omfattet PCR målområdet og 9-143 baser af flankerende regioner af de humane og murine gener (se detaljer i figur S4).

De valideringer af standardkurven og kvantitativ real-time PCR-system blev udført som vist i figur S5, S6 figur og figur S7. Seriefortyndinger af menneske-muse-hybrid standard DNA blev anvendt til at konstruere en standardkurve. Hver standardkurve blev genereret ved anvendelse af 10-foldige seriefortyndinger af standard DNA og de fem forskellige primerpar (figur S5A-E, rød lukkede cirkler). Ved anvendelse af standard template DNA indeholdende de fem cDNA-fragmenter, kan lige mængder tildeles alle de fem menneskelige gener under anvendelse human-specifikke primerpar i hver fortynding, der blev anvendt til at konstruere de standardkurver (Figur S5A-E, rød lukkede cirkler ). Tilsvarende kan lige mængder tildeles alle fem murine gener (figur S6A-E, lilla lukkede trekanter).

For at teste ligestilling af kurverne, en kendt koncentration af hele den kodende cDNA blev amplificeret og efterfølgende analyseret som en ukendt prøve. Lige mængder af de humane hele den kodende cDNA'er blev observeret for hver testet fortynding; disse mængder er derefter anvendt til at konstruere standardkurven (figur S5A-E, blå lukkede romber). Ligeledes blev lige store mængder af muse hele den kodende cDNA'er også observeret (figur S6A-E, grønne krydser). Kvantificeringen af ​​med lav hyppighed transkripter og rigelige transkripter tillader os at validere følsomhed og pålidelighed realtids-PCR, hvilket indikerer, at vores real-time PCR-metoden tilbyder et stort dynamisk område på kvantificering, høj nøjagtighed og høj følsomhed (fig S5A- E og Figur 6A-E).

Desuden fire linjer (to standardkurver og to fortyndingskurver ved de kendte koncentrationer af de humane og muse hele den kodende cDNA'er, henholdsvis) overlappet (Figur S7A-E). Således er vores real-time PCR-metode giver pålidelige relative værdier for de fire chitinase gener og de seks referencepunkter gener (figur 4B).

Sammenligning af Chit1 og AMCase mRNA niveauer mellem Normal mennesker og mus væv

Vi bruges human Total RNA Master Panel II og Mouse Total RNA Master Panel (Clontech Laboratories) som kilder til total RNA til denne undersøgelse. Der er fire væv (lunge, lever, milt og nyre), der overlappede mellem de humane og muse-paneler og relateret til astma og Gauchers sygdom. Da der var fremtrædende forskelle i chitinase udtryk i maven væv, vi også set på niveauerne af ekspression af disse chitinaser i andre fordøjelsesorganer, spytkirtel, mave, små og store tarme mellem mennesker og mus. Vi kvantificeres og sammenlignes ekspressionsniveauerne i disse væv ved hjælp af menneske-muse-hybrid standard DNA (figur 4B); de kvantitative data er vist i figur 5.

Vi fandt det højeste ekspressionsniveau af Chit1 mRNA i mus (men ikke human) mave, efterfulgt af humane lungevæv. Samlet set blev Chit en mRNA udtrykt ved højere niveauer i de humane væv end i mus væv undtagen for maven (figur 5A). Det højeste ekspressionsniveau for AMCase mRNA var i muse maven, efterfulgt af muse spytkirtel. I de andre humane og murine væv, de AMCase mRNA-niveauer var lave i humane væv (figur 5B). Både Chit1 og AMCase mRNA niveauer i små og store tarme var meget lave i både mennesker og mus væv (figur 5), der var i overensstemmelse med tidligere data opnået ved Northern blotting [6], [21].

Vi fundet, at AMCase mRNA blev udtrykt i lave niveauer i normal human mave, men var stærkt udtrykt i muse mave væv (figur 5B). Således har vi sammenlignede også ekspressionsniveauerne af de chitinaser og reference- gener ved anvendelse cDNA'erne, der blev fremstillet ud fra lunge- og mave væv. Salg

normalisere den humane Chit1 niveau i lungevævet til 1,0, de relative ekspressionsniveauer af muse Chit1, humant AMCase og muse AMCase mRNA'er var 0,3, 0,3 og 7, henholdsvis (figur 6A). Murint AMCase blev højt udtrykt i muse lunge. Niveauet af Chit1 mRNA i human lunge var omkring 3 gange højere end den muselunge. De Chit1 og AMCase mRNA niveauer var væsentligt lavere end ekspressionsniveauerne af GAPDH og p-actin-gener (figur 6A).

normalisere humane Chit1 niveau i mave to1.0, de relative ekspressionsniveauer af musen Chit1, den humane AMCase og muse AMCase mRNA'er var 10, 0,7 og 1,978 (figur 6B). Pepsinogen C er en stor fordøjelsesenzym i maven. Ekspressionsniveauet af AMCase i mus var meget højere end for GAPDH og β-actin og var sammenlignelig med niveauet af pepsinogen C, hvorimod den menneskelige mave udviste et meget lavt niveau af AMCase mRNA-ekspression. De relative ekspressionsniveauer af mRNA i den menneskelige og mus mave var 1,0 og 2826, hhv.

For at kontrollere, om mRNA niveau forskelle mellem mus og menneske blev afspejlet på proteinniveauet, vi næste analyseret enzymatisk aktivitet af disse chitinaser i maven væv. Vi analyserede først AMCase aktivitet i mus og humane mave væv. Musen AMCase viser en dobbelt pH optimum med en større optimum omkring pH 2 og en sekundær optimum omkring pH 5 [6], mens den menneskelige AMCase viser bred optimale pH ved pH 2~pH 5 [16], [24]. Således har vi målt kitinolytisk aktivitet ved pH 2,0 og pH 5,0 ved anvendelse af det syntetiske substrat af 4-methylumbelliferyl β-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Vi har registreret robust kitinolytisk aktivitet i mus maven ekstrakt ved pH 2,0 og stærk aktivitet ved pH 5,0. I modsætning hertil blev der ikke aktivitet detekteret i humant ved pH 2,0 og meget lav aktivitet blev observeret ved pH 5,0 (figur 7A, venstre).

standard Chit1 enzymatisk assay er blevet udført under anvendelse af 4-methylumbelliferyl β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) ved pH 5,2 [6], [10], [21], [25]. For at overvåge effekten af ​​AMCase på Chit1 aktivitet, vi analyserede chitinase aktivitet ved hjælp 4MU-chitotriose ved pH 2,0. blev påvist relativt stærk chitinase aktivitet mod 4MU-chitotriose i musen maven ekstrakt ved pH 2,0 (figur 7A til højre), og vi har registreret også svag chitinase-aktivitet ved pH 5,2 (figur 7A højre). Da AMCase har en anden optimum ved omkring pH 5, viste disse resultater, at de fleste af kitinolytisk aktivitet ved pH 5,2 kan skyldes AMCase stedet Chit1 og at muse AMCase kunne hydrolysere 4MU-chitotriose som substrat ved pH 2,0. Tilsammen størstedelen af ​​chitinase-aktivitet i muse maven skyldtes AMCase aktivitet. I menneskelige mave ekstrakt vi også observeret meget svage, men påviselige niveauer af kitinolytisk aktivitet ved pH 2,0 og pH 5,2 (figur 7A, højre, nedre panel). Chitinase-aktivitet ved pH 5,2 var sammenlignelig ved pH 2,0, hvilket indikerer Chit1 ekspression i menneskelige mave.

Endelig har vi analyseret niveauerne af proteinekspression ved Western blotting under anvendelse af antistoffer mod AMCase. De anti-AMCase antistoffer blev genereret mod den tidligere rapporterede muse-peptid [14] og human modpart. Anti-muse AMCase antistof genkendte et robust enkelt proteinbånd i ekstrakt fra muse maven, men ikke fra human (figur 7B, venstre). Tilsvarende anti-humant AMCase antistof genkendes også et enkelt bånd i muse-ekstrakt (figur 7B, højre). I den menneskelige ekstrakt der var svage bånd af lidt højere molekylvægt, der blev anerkendt af både humane og murine antistoffer (figur 7B). Da der ikke var nogen signifikant chitinase aktivitet ved enten pH 2,0 eller pH 5,0 overvåges ved hjælp 4MU-chitobiose i menneskelige mave ekstrakt, kunne disse bånd ikke relateres til den humane AMCase. Derfor kitinolytisk aktiviteter og de relative protein udtryk niveauer mellem mus og mennesker mave væv var i overensstemmelse med vores data opnået på mRNA niveau.

Diskussion

Tidligere undersøgelser af in vivo
regulering af Chit1 og AMCase i mennesker og mus blev udført under anvendelse northern blotting, semi-kvantitativ PCR og real-time PCR [6], [8], [9], [13], [14], [22] , [23]. Selv om disse fremgangsmåder har adskillige fordele i forhold til behandlingen af ​​genekspressionsmønstre, de undlod at sammenligne niveauerne af de forskellige gentranskripter i samme målestok. I den aktuelle undersøgelse, vi anvendt vores metodik [17] for at undersøge ekspressionsniveauerne af disse chitinaser i humane væv. Desuden at evaluere ekspressionsniveauerne af chitinaser i humane og murine væv, udviklede vi et kvantificering system ved hjælp af et enkelt menneske og mus hybrid standard DNA. Vi viste vævs- og artsspecifikke udtryk for de to pattedyr aktive kitinaser, Chit1 og AMCase. Vores data generelt understøtter tidligere undersøgelser rapporteret af Boot et al [6], [21]. Men vores analyse er tilstrækkelig følsom til at påvise mRNA og giver en omfattende undersøgelse af de genekspressionsmønstre af chitinaser i humane og murine væv på samme skala.

Et bemærkelsesværdigt træk af ekspressionen af ​​de pattedyr chitinaser er den konserverede ekspression af Chit1 mellem mennesker og mus lungevæv. Vi fandt, at Chit1 blev udtrykt ved forholdsvis høje niveauer i humane og muse lungevæv, der var næsten sammenlignelig med hinanden, hvilket indikerer, at ekspressionsniveauet af Chit1 mRNA er konserveret. I lungerne, kan Chit1 fungere som en del af værtens forsvarssystem, som beskytter mod chitin-indeholdende patogener, såsom svampe og mider [25]. Bevarelsen af ​​Chit1 genekspression hos mennesker og mus antyder den fysiologiske betydning Chit1 i lungen.

Ekspressionen af ​​chitinaser i maven er af særlig interesse. AMCase mRNA syntetiseres ved ekstraordinært høje niveauer i muse maven, men ikke i den humane mave (figur 6B). Sammenligningen af ​​disse ekspressionsniveauer viste, at AMCase mRNA-niveauet i den menneskelige mave var omkring 1 /2.800 af det i musen modstykke. Vi bekræftede, at ekspressionsniveauerne af pepsinogen C mRNA, og de to husholdning gener var meget højt i mennesker og mus mave væv (Figur 6B). Således faldt ekspressionsniveauet af AMCase mRNA i humane mave ikke skyldes RNA-nedbrydning under cDNA præparat. Desuden fandt vi, at mus mave udtrykte stor mængde AMCase, mens den menneskelige modstykke ikke gjorde (figur 7). Disse resultater indikerer, at udtrykket niveau AMCase i maven væv varierer betydeligt mellem mennesker og mus.

Maven er et vigtigt organ, der spiller grundlæggende roller i fordøjelsen af ​​fødevarer og beskyttelse mod skadelige organismer. Saltsyre udskilles i maven, hvilket skaber sure betingelser (pH = ca. 2) egnede til fordøjelse af proteiner ved pepsin [19], [26]. Murin AMCase viser dyb syre stabilitet og er mest aktive ved omkring pH 2 [6]. Musen maven producerer en enorm mængde af AMCase mRNA [17] og oversættelsen produkt (figur 7). Følgelig kan AMCase fungere som et fordøjelsesfremmende enzym, der nedbryder chitin-holdige fødevarer i musen maven.

I modsætning hertil ekspressionsniveauet af AMCase mRNA og dets produkt var relativt lavt i den menneskelige mave (figur 5, Figur 6 og figur 7). Dette er ikke uventet, fordi moderne mennesker ikke spiser en betydelig mængde af chitin-holdige fødevarer. Disse resultater antyder, AMCase ikke kan spille en rolle i forsvaret mod chitin-indeholdende organismer i den menneskelige mave. Mange mave sygdomme er forbundet med infektion med exogene organismer. Sværhedsgraden af ​​gastritis infektioner såsom Helicobacter pylori
kan korrelere med aktiviteten af ​​endogene enzymer [23]. Det forbliver således et spørgsmål om forhandling om det lave niveau af AMCase i den menneskelige mave deltager i reaktionen på gastriske lidelser.

Et højt kitinolytisk aktiviteter er blevet påvist i ekstrakter af muse maven og tarmen [6] . Da der er fremtrædende forskelle i niveauet af chitinase udtryk i maven mellem menneske og mus, vi undersøgte niveauer af ekspression af disse chitinaser i andre fordøjelsesorganer, herunder spytkirtel og små og store tarmene. Vores resultater indikerer, at både Chit1 og AMCase mRNA niveauer i tynd- og tyktarm var meget lav i både humane og muse væv, selvom mus spytkirtel og mave produceret høje niveauer af begge chitinaser mRNA'er (figur 5). Disse resultater antyder, at mammale chitinase proteiner i muse tarme sandsynligvis er afledt fra de øvre dele af mave-tarmkanalen, såsom spytkirtel og mave, som er konsistent med den kendte begreb ved Boot et al [6], [21].

ekspressionsniveauerne af Chit1 genet i lungevæv er konserveret mellem mennesker og mus. I modsætning hertil ekspressionsniveauet af AMCase i maven væv er artsspecifik. Resultaterne antyder, at reguleringen af ​​ekspressionen af ​​Chiti1 mRNA i lungen er bevaret under evolutionen, hvorimod nedsat ekspression af AMCase i den humane mave kan være resultatet af gendæmpning. Undersøgelsen af ​​reguleringen af ​​ekspressionen af ​​disse pattedyr chitinaser kunne give indsigt i de patofysiologiske roller af disse enzymer. En detaljeret karakterisering af promotor-regioner Chit1 og AMCase gener og identifikation af cis
- og vil blive krævet trans
virkende faktorer for forståelsen af ​​den selektive genekspression af disse chitinaser hos mennesker og mus.

udtryk for Chit1 og AMCase mRNA induceres under forskellige patologiske tilstande. Brug af kvantitative system, der beskrives her, vil vi være i stand til at sammenligne de chitinase mRNA niveauer på tværs af humane og murine væv ved real-time PCR. Denne analyse vil lette forståelsen af ​​den biologiske funktion af disse chitinaser, især i de patofysiologiske undersøgelser af human sygdom ved hjælp af murine modeller. Vores metode er anvendelig til kvantificering af mRNA for flere gener mellem humane og murine prøver vha samme målestok. En praktisk anvendelse af denne sammenlignende tværs af arterne genekspression data sammenligning af humane sygdomme med mus og cellekultur modeller.

Materialer og metoder

RNA og cDNA Forberedelse

The human Total RNA Master Panel II og Mouse Total RNA Master Panel (Clontech Laboratories) blev anvendt til at undersøge fordelingen af ​​transkripter i forskellige væv. Human Tyndtarmen Total RNA blev indkøbt fra Clontech Laboratories. Derudover blev RNA isoleret fra spytkirtel og tynd- og tyktarm af 3-måneder gamle hanmus. C57BL /6J mus (CLEAR Japan) blev avlet på Riken Brain Science Institute Animal Facility. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske dyreforsøg af Riken Brain Science Institute (Godkendelse nr H19-2B013). Alle operation blev udført ved hjælp af diethylether som et bedøvelsesmiddel, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Væv til mRNA forberedelse blev leveret af Drs. Miyazaki og Nukina på Riken Brain Science Institute. Totalt RNA blev fremstillet ud fra spytkirtel og tynd- og tyktarm ved hjælp TRIzol Reagent (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Vi analyserede 21 forskellige humane væv og otte voksne musevæv. For at fjerne spormængder af kontaminerende genomisk DNA, blev de samlede RNA-prøver behandlet med RQ1 RNase-fri DNase (Promega) ifølge producentens anbefalinger. Hver af de samlede RNA-prøver blev udsat for revers transkription hjælp vilkårlige hexamerer som primerne, som tidligere rapporteret [17].

Real-time PCR

Etablering og validering af real-time PCR-system for humane væv blev udført som beskrevet [17]; den eneste undtagelse var anvendelse af menneskelige primere. Nukleotidsekvenserne af primerne, der blev udvalgt til real-time PCR for det humane system er vist i tabel S1. Hver prøve blev forstærket i tre eksemplarer, og hvert forsøg blev gentaget mindst to gange.

Konstruktion af Human Standard DNA og Udarbejdelse af fem Menneskelige cDNA'er, der dækker hele den kodende region

Opførelsen af standardskabelon DNA for de menneskelige gener og udarbejdelsen af ​​de fem menneskelige cDNA, der dækkede hele den kodende region blev udført i det væsentlige som beskrevet [17]; den eneste undtagelse var anvendelse af menneskelige primere. De forreste og reverse primere er anført i tabel S2. PCR-produkterne blev fordøjet med de egnede restriktionsenzymer og ligeret under anvendelse af T4 DNA-ligase. De ligerede fragmenter blev amplificeret under anvendelse af forward primeren 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'og den reverse primer 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' og klonet ind i pGEM-T Easy-vektoren (Promega). De verificerede sekvenser af cDNA'erne er vist i figur S2. ingen.

• PLoS ONE: Mave Temperatur Records Reveal Sygepleje Adfærd og overgang til fast føde Forbrug i en fravænnede Pattedyr, Harbour Seal Pup (Phoca vitulina)
• PLoS ONE: Serum Apolipoproteiner CI og C-III reduceres i mavekræft Patienter: Resultater fra MALDI-Based peptidindhold og Immuno-Based Clinical Assays