PLoS ONE: Количественное Хитиназная мРНК уровней в человеческих и мышиных тканей ПЦР в реальном времени: Вид-специфическая экспрессия Кислотные МЛЕКОПИТАЮЩИХ хитиназе в Желудок Tissues

Абстрактный
<р> Хитиназная гидролизует хитина, который является N
ацетил- D-глюкозамина полимер, который присутствует в широком диапазоне организмов, в том числе насекомых, паразитов и грибов. Хотя млекопитающие не содержат эндогенный хитин, люди и мыши выражают два активных хитиназы хитотриозидазы (Chit1) и кислой хитиназе млекопитающим (AMCase). Поскольку уровень экспрессии этих хитиназы увеличивается во многих воспалительных заболеваний, в том числе болезнь Гоше и мыши моделей астмы, как хитиназы могут играть важную роль в pathophysiologies этих и других заболеваний. Недавно мы установили систему количественной ПЦР с использованием стандартной ДНК и показал, что мРНК AMCase синтезируется на чрезвычайно высоких уровнях в тканях желудка мыши. В данном исследовании мы применили эту методику к количественной оценке хитиназы мРНК в тканях человека и обнаружили, что оба хитиназе мРНК широко экспрессируется в нормальных тканях человека. мРНК Chit1 была высоко выражена в легком человека, тогда как мРНК AMCase не избыточно экспрессируется в нормальных тканях желудка человека. Уровни этих мРНК в тканях человека, были значительно ниже, чем уровни генов домашнего хозяйства. Поскольку уровни экспрессии AMCase были весьма различны между тканями человека и мыши желудка, мы разработали систему количественной ПЦР для сравнения уровней мРНК между человека и мыши тканей с использованием человеческого-мышиного гибридного стандартной ДНК. Наш анализ показал, что мРНК Chit1 выражается на том же уровне в нормальных человека и мыши легких. В отличие от этого, уровень экспрессии AMCase в человеческом желудке был значительно ниже, чем уровень экспрессии, наблюдаемой в желудке мыши. Эти различия между мРНК тканей желудка человека и мыши были отражающие различия в хитинолитических деятельности и уровни экспрессии белка. Таким образом, уровень экспрессии AMCase в желудке видоспецифична
<р> Цитирование:. Ohno M, Тогаси Y, Цуда K, Okawa K, M Kamaya, Сакагучи М., и др. (2013) Количественная Хитиназная мРНК уровней в человеческих и мышиных тканей ПЦР в реальном времени: Вид-специфическая экспрессия Кислотные МЛЕКОПИТАЮЩИХ хитиназе в Желудок ТКАНЕЙ. PLoS ONE 8 (6): e67399. DOI: 10.1371 /journal.pone.0067399
<р> Редактор: Emiko Мидзогути, Massachusetts General Hospital, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 5 января, 2013 года; Принято: 15 мая 2013 года; Опубликовано: 27 июня 2013
<р> Copyright: © 2013 Ohno и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке исследовательского гранта проекта из научно-исследовательского института науки и техники, Kogakuin университета. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> хитин, который представляет собой полимер N
-он-D-глюкозамина, является вторым наиболее распространенным полисахарид в природе [1]. Это является неотъемлемым компонентом экзоскелетов ракообразных и насекомых, в микрофилярий оболочках паразитических нематод и грибковых клеточных стенок [1], [2].
<Р> хитиназы являются ферменты, которые переваривают хитин полимера. Хотя млекопитающие не производят хитина, люди и мыши имеют два гена, которые кодируют активные хитиназы хитотриозидазы (Chit1) и кислой хитиназу млекопитающих (AMCase) [2], [3]. Chit1 был первым хитиназы млекопитающим который должен быть очищен и клонирован [4], [5]. AMCase, который является вторым наиболее активным хитиназы у млекопитающих, был идентифицирован как компенсаторную фермента для Chit1 и назван в честь его оптимальной активности в кислых условиях [6].
<Р> Оба фермента последовательности проявляют гомологию к бактериальным хитиназы и принадлежат семейство 18 из гликозилгидролаз, который также включает в себя хитиназе-подобные белки, которые структурно связаны с хитиназы, но испытывают недостаток хитинолитических активности [2], [3]. Мышиный AMCase показывает последовательность, гомологичную Chit1, с идентичностью 52% и схожесть 60% [6]. Локус гена Chit1 человека находится на хромосоме 1q32 [7], в то время как ген AMCase человек находится на хромосоме 1p13 [6]. Оба гена состоят из 12 экзонов и кодирует различные сплайс-изоформы [6] - [9]. Гомологии последовательности и сохранение границ интрон-экзон между генами Chit1 и AMCase предполагают, что эти гены возникли из дублированию гена наследственного [3], [6].
<Р> Недавние исследования показали связь между экспрессия хитиназы млекопитающих и воспалительных состояний. Например, уровни Chit1 повышаются в плазме пациентов с болезнью Гоше, в БАЛ курильщиков и пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и спинномозговой жидкости пациентов с болезнью Альцгеймера [9] - [12] , AMCase выражение и активность также повышалась во время аллергических реакций в дыхательных путях в мышиных моделях астмы [13]. Полимерное хитин индуцирует экспрессию AMCase и набор иммунных клеток, которые связаны с аллергией и астмой [14]. Кроме того, некоторые генетические варианты AMCase связаны с бронхиальной астмой у людей [15], [16]. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что хитинолитических ферменты играют важную роль в борьбе с болезнью. Тем не менее, их патофизиологические функции остаются плохо изучены.
<Р> Количественное Chit1 и уровней AMCase мРНК является важным шагом на пути к пониманию в естественных условиях
регуляции хитиназы у млекопитающих. Недавно мы установили систему количественной ПЦР с использованием стандартной ДНК для количественного определения и сравнения уровней экспрессии генов хитиназы и эталонным по той же шкале [17]. В нашей предыдущей статье мы показали, что AMCase является одним из основных транскрипт в желудке мыши и выражается на уровнях, которые сопоставимы с пепсиногена С [17].
<Р> Здесь мы применили нашу методику количественной оценки уровни мРНК хитиназы млекопитающих в нормальных тканях человека, что является необходимым условием для понимания их роли в патологических тканях. больных Кроме того, мы создали систему количественного определения для сравнения уровней мРНК множественных генов между количеством человеческих и мышиных тканей с использованием человеческого-мышиного гибридного стандартной ДНК. Наше исследование показывает, что количественно мРНК Chit1 выражается в так же высоком уровне в нормальных человеческих и мышиных легких. В противоположность этому, AMCase преимущественно избыточно экспрессируется у мышей, но не человеческого желудка.

Результаты

Создание и проверка на ПЦР в реальном времени системы для обнаружения хитиназы в тканях человека
<р> ранее мы установили в режиме реального времени система PCR, которая способна определять уровни мРНК двух хитиназы млекопитающих в тканях мыши и сравнения этих уровней с теми эталонных генов с использованием той же шкалы [17]. В данном исследовании мы хотели сравнить уровни экспрессии генов генов Chit1 и AMCase через нормальных тканей человека (Рис. 1А) Как и в тканях мыши [17], мы использовали генов домашнего хозяйства глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) и бета-актина в качестве эталонных генов, поскольку они конститутивно экспрессируется на высоком уровне в большинстве клеток [18]. Кроме того, мы выбрали пепсиногена C (также известный как progastricsin) в качестве эталонного гена в желудке, так как уровень мРНК AMCase в желудке мыши была сравнима с уровнем мРНК пепсиногена С, которая составляет основной компонент слизистой оболочки желудка [ ,,,0],19]. С помощью этих трех опорных генов, мы оценивали уровни экспрессии генов Chit1 и AMCase в нормальных тканях человека (Рис. 1А)
<р> Мы разработали несколько наборов праймеров для количественной ПЦР и оценивали их пригодность на основе выставлены ли они одна температура плавления (Tm), и одна полоса на 10% -ном полиакриламидном геле [17]. Как показано на рисунке S1A-E, диссоциация кривые пяти кДНК демонстрируют только один пик каждый. Гель-электрофорез ясно показали отдельные полосы на ожидаемых размеров для Chit1 (55 б.п.), AMCase (62 б.п.), GAPDH (57 б.п.), β-актина (57 б.п.) и пепсиногена C (61 б.п.) (рис S1F). Таким образом, мы подтвердили, что правильные продукты ПЦР амплифицировали из смеси кДНК человека ткани.
<Р> Затем мы сконструировали стандартную матричной ДНК для ПЦР в реальном времени путем лигирования пяти целевых фрагментов в один-к-одному отношение (Фигура 1В и рис S2). 1396-нуклеотида длиной стандартной матричной ДНК состояла из пяти фрагментов кДНК, покрывавших мишень ПЦР область и 60-143 основаниями фланкирующих и содержали Bgl
II, Sal
I, Xho
I и Не
сайтов рестрикции I (рис 1В и рисунок S2).
<р> количественное обоих хитиназы и эталонных мРНК опирается на стандартных кривых. Мы использовали стандартные кривые для сравнения и оценки в режиме реального времени стратегии ПЦР количественной оценки. Каждая стандартная кривая была сгенерирована с использованием 10-кратных серийных разведений стандартной ДНК человека и пяти различных пар праймеров (рис S3A-Е, красный закрашенные кружки). При использовании стандартной матричной ДНК, содержащий пять фрагментов кДНК человека, равные количества могут быть назначены для всех пяти генов в каждом разведении для построения стандартных кривых (рис S3A-E, красный закрыты кружки).
<Р> Чтобы проверить равенство кривых, известную концентрацию всей кДНК, кодирующей человеческий усиливался и затем анализировали в качестве неизвестного образца. Этот анализ проводили с целью проверки того, что в каждой из испытуемых разбавление привела к ожидаемому количеству. Как показано на рисунке S3A-E, голубые замкнутые ромбы, наблюдались равные количества для каждого испытуемого разведения; они были использованы для построения стандартной кривой.
<р> Количественное низкого обилия транскриптов и обильными транскриптов позволяет проверить чувствительность и надежность ПЦР в реальном времени, что свидетельствует о том, что наша в режиме реального времени методом ПЦР предлагает большой динамический диапазон количественной оценки, высокая точность и высокая чувствительность (рис S3A-E). Таким образом, наше в реальном времени методом ПЦР обеспечивает надежные значения для двух генов человека хитиназе и трех эталонных генов человека в том же масштабе.

Выражение Chit1 и AMCase в нормальных тканях человека
<р> Для изучить в естественных условиях
регуляции экспрессии генов Chit1 и AMCase человека, тотальной РНК из различных нормальных тканей человека анализировали с использованием количественного ПЦР в реальном времени анализа с специально разработанной стандартной ДНК (рисунок 1). Полученные значения были выражены в виде молекул в 10 нг общей РНК в оси у (рис 2 и рисунок 3).
<Р> Оба Chit1 и AMCase мРНК широко экспрессируется в нормальных тканях человека (рис 2А и 2В). Самые высокие уровни мРНК Chit1 были обнаружены в легких человека, а затем селезенки, печени плода и тимуса (фиг.2А). Самые высокие уровни мРНК AMCase были обнаружены в легких, а затем эмбрионального мозга, печени, щитовидной железы и сердца (Фигура 2В). Хотя мРНК AMCase была выражена на чрезвычайно высоком уровне в желудке мыши [17], его уровень экспрессии в желудке человека была значительно ниже, чем в легких, головного мозга плода, фетальной печени, щитовидной железы и сердца (рис 2В). В других тканях, были выражены как Chit1 и AMCase мРНК при низких, но легко обнаруживаемые уровни выше фона (рис 2А и 2В).
<Р> При сравнении с уровнями AMCase мРНК была выражена мРНК Chit1 при относительно высоких уровнях в селезенке и печени плода. В отличие от этого, плода мозга, простаты и печени, выраженный большее количество мРНК AMCase чем мРНК Chit1 (рисунок 2).

Анализ выражения уровней Chit1, AMCase, GAPDH, бета-актина и пепсиногена C в мРНК Нормальные человеческие легких и желудка тканей
<р> Потому что многие исследования по патофизиологии хитиназы млекопитающих были выполнены с использованием легких и желудка [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], мы сравнили уровни экспрессии хитиназы и эталонных генов в этих двух человеческих тканей. Количественные данные представлены на рисунке 3. Нормализация уровня Chit1 до 1,0, относительные уровни экспрессии AMCase, GADPH, и бета-актина мРНК в ткани легкого человека были 0,8, 39 и 343, соответственно (рис 3А). Гены GAPDH и бета-актина хорошо известны генов домашнего хозяйства и конститутивно экспрессируется на высоких уровнях в большинстве тканей [18]. Наши результаты указывают на то, что Chit1 и AMCase мРНК выражаются на том же уровне в нормальной человеческой легочной ткани, хотя уровень экспрессии Chit1 был значительно ниже, чем у двух генов домашнего хозяйства (сравните без журнала участок с бревенчатыми участка на рисунке 3).
<р> Нормализация уровня Chit1 до 1,0, относительные уровни экспрессии AMCase, GAPDH, бета-актина и пепсиногена с в нормальной ткани желудка человека были 1,5, 323, 1736 и 3962, соответственно (рис 3B). При этом уровни экспрессии обоих Chit1 и AMCase были намного ниже, чем у GAPDH и бета-актина. Хотя пепсиногена С мРНК экспрессируется на высоком уровне в образцах желудка человека, AMCase мРНК была сравнима с Chit1. Эти результаты указывают на то, что уровни экспрессии Chit1 и AMCase являются относительно низкими в тканях человека, рассмотренных и что уровень экспрессии AMCase в желудке значительно отличается между человеком и мышью.

Создание и проверка Системы квантификации для человека и Мышь Хитиназная мРНК Использование человеко-мыши гибридной ДНК
<р> Далее мы пытались сравнить уровни экспрессии двух хитиназы между людьми и мышами в том же масштабе, используя в режиме реального времени система PCR (рис 4а). Поэтому мы построили человек-мышь гибрид стандартной ДНК для ПЦР в реальном времени путем лигирования стандартных матричных ДНК человека и мыши (рис 4В). Полученную 2305-нуклеотида длиной матричной ДНК содержала десять фрагментов кДНК, которые покрывали целевой ПЦР и область 9-143 основы фланкирующих участков генов человека и мыши (подробности см на рисунке S4).

валидаций стандартной кривой и количественной системы реального времени ПЦР проводили, как показано на рисунке S5, S6 и рис рис S7. Дублированные серийные разведения человеческого-мышиного гибридного стандартной ДНК были использованы для построения калибровочной кривой. Каждая стандартная кривая была сгенерирована с использованием 10-кратных серийных разведений стандартной ДНК и пяти различных пар праймеров (рис S5A-E, красные заштрихованные кружки). При использовании стандартной ДНК шаблон, содержащий пять фрагментов кДНК, равные количества могут быть назначены для всех пяти человеческих генов с использованием человеческих-специфических пар праймеров в каждом разведении, которое использовалось для построения стандартных кривых (рис S5A-Е, красный закрашенные кружки ). Точно так же, равные количества могут быть назначены на все пять мышиных генов (рис S6A-E, фиолетовые закрашенные треугольники).
<Р> Чтобы проверить равенство кривых, известную концентрацию всей кодирующей кДНК амплифицировали и затем анализировали, как неизвестного образца. Равные количества всей кодирующей кДНК человека наблюдались для каждого испытуемого разведения; эти величины были затем использованы для построения стандартной кривой (рис S5A-E, синий закрыто ромбы). Точно так же, равные количества мыши целые кДНК, кодирующие также наблюдались (рис S6A-Е, зеленые крестики). Количественное низкого обилия транскриптов и обильными транскриптов позволяет проверить чувствительность и надежность ПЦР в реальном времени, что свидетельствует о том, что наша в режиме реального времени методом ПЦР предлагает большой динамический диапазон количественной оценки, высокая точность и высокая чувствительность (рис S5A- Е и 6А-Е).
<р> Кроме того, четыре линии (две стандартные кривые и две кривые разбавления известных концентраций всего кДНК кодирования человека и мыши соответственно) перекрываются (рис S7A-E). Таким образом, наше в реальном времени методом ПЦР обеспечивает надежные относительные значения для четырех хитиназе генов и шести опорных генов (рис 4б).

Сравнение Chit1 и мРНК AMCase уровней между нормальным человека и мыши ТКАНЕЙ
<р> Мы использовали Human тотальную РНК Master Panel II и мышь Общая РНК Master Panel (Clontech Laboratories) в качестве источника общей РНК для данного исследования. Есть четыре ткани (легких, печени, селезенки и почек), которые перекрывались между мыши и человека панелей и связанных с астмой и болезнью Гоше. Поскольку были видные различия в экспрессии хитиназной в тканях желудка, мы также смотрели на уровни экспрессии этих хитиназы в других органах пищеварения, слюнных желез, желудка, тонкого и толстого кишечника между человеком и мышью. Мы количественно и сравнивали уровни экспрессии в этих тканях с использованием человеческой мыши гибрид стандартной ДНК (рис 4б); количественные данные представлены на рисунке 5.
<р> Мы нашли самый высокий уровень экспрессии мРНК Chit1 в мыши (но не человека) желудка, а затем легочной ткани человека. В целом, была выражена мРНК Чит 1 на более высоких уровнях в человеческих тканях, чем в тканях мыши для желудка (рис 5А), за исключением. Самый высокий уровень экспрессии мРНК AMCase был в желудке мыши, а затем мыши слюнной железы. В других человеческих и мышиных тканях, уровни AMCase мРНК были низкими в тканях человека (рис 5б). Оба уровня Chit1 и мРНК AMCase в тонкой и толстой кишки были очень низкими в обоих человеческих и мышиных тканей (рисунок 5), которые согласуются с предыдущими данными, полученными с помощью нозерн-блоттинга [6], [21].

We обнаружено, что было выражено AMCase мРНК на низких уровнях в нормальном человеческом желудке, но был высоко экспрессируются в тканях желудка мыши (Рисунок 5В). Таким образом, мы также сравнили уровни экспрессии хитиназы и эталонных генов с использованием кДНК, которые были получены из легких и желудка тканей.

нормализующее человеческий уровень Chit1 в легочной ткани до 1,0, относительные уровни экспрессии мышиного Chit1, AMCase человека и мыши AMCase мРНК 0,3, 0,3 и 7 соответственно (рисунок 6, а). Мышиные AMCase была высоко выражена в легких мышей. Уровень мРНК Chit1 в легком человека было примерно в 3 раза выше, чем в легких мышей. Уровни Chit1 и AMCase мРНК были значительно ниже, чем уровни экспрессии GAPDH и бета-актина генов (6А).
<Р> Нормализация человеческий уровень Chit1 в to1.0 желудка, относительные уровни экспрессии мыши Chit1, человеческий AMCase и мышь AMCase мРНК 10, 0,7 и соответственно +1978 (6Б). Пепсиноген C является одним из основных пищеварительного фермента в желудке. Уровень экспрессии AMCase у мышей была значительно выше, чем у GAPDH и бета-актина и был сопоставим с уровнем пепсиногена С, в то время как человеческий желудок проявлял очень низкий уровень экспрессии мРНК AMCase. Относительные уровни экспрессии мРНК в организме человека и мыши желудка были 1,0 и 2826, соответственно.
<Р> Для того, чтобы проверить, является ли разность уровней мРНК между мыши и человека нашли свое отражение на уровне белка, мы в следующий раз анализировали ферментативную активность из этих хитиназы в тканях желудка. Сначала мы анализировали AMCase активность у мышей и тканей желудка человека. AMCase мыши показывает двойственную оптимальное значение рН с основным оптимума рН около 2 и вторичный оптимум рН около 5 [6], в то время как человек AMCase показывает широкое оптимальное значение рН при рН 2~pH 5 [16], [24]. Таким образом, мы измерили хитинолитических активность при рН 2,0 и рН 5,0 с использованием синтетического субстрата из 4-метилубеллиферилфосфат бета-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Мы обнаружили надежную хитинолитических активность в экстракте желудка мыши при рН 2,0 и сильной активностью при рН 5,0. В отличие от этого, никакой активности не было обнаружено, что из человека при рН 2,0 и очень низкую активность наблюдалась при рН 5,0 (фиг.7А, слева).
<Р> Стандартный ферментативный анализ Chit1 было выполнено с использованием 4-метилумбеллиферил- β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) при рН 5,2 [6], [10], [21], [25]. Для того, чтобы контролировать влияние AMCase на активности Chit1, мы проанализировали активность хитиназы с использованием 4MU-chitotriose при рН 2,0. Относительно сильная хитиназы активность против 4MU-chitotriose был обнаружен в экстракте желудка мыши при рН 2,0 (7А справа), и мы также обнаружили слабую хитиназной активности при рН 5,2 (7А справа). Так как AMCase имеет второй оптимум при рН около 5, эти результаты показали, что большинство хитинолитических активности при рН 5,2 может быть из-за AMCase, а не Chit1 и что мыши AMCase может гидролизовать 4MU-chitotriose в качестве субстрата при рН 2,0. Взятые вместе, большинство хитиназы активности в желудке мыши результатом AMCase активности. В экстракте желудка человека мы также наблюдали очень слабые, но поддающиеся обнаружению уровни хитинолитических активности при рН 2,0 и рН 5,2 (рис 7А, справа, нижняя панель). Хитиназная активность при рН 5,2 была сравнима с таковой при рН 2,0, что указывает на экспрессию Chit1 в желудке человека.
<Р> Наконец, мы проанализировали уровни экспрессии белка с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител против AMCase. Анти-AMCase антитела генерировались против ранее сообщенным пептида мыши [14] и человеческого аналога. Анти-мышиного антитела AMCase признали надежную одну полосу белка в экстракте из желудка мышей, но не от человека (рис 7В, слева). Точно так же анти-человеческое антитело AMCase также признал одну полосу в экстракте мыши (рис 7В, справа). В человеческом экстракте были слабые полосы чуть более высокой молекулярной массой, которые были признаны как мыши и человека антител (рис 7б). Так как не было никакого существенного хитиназы активность при любой рН 2,0 или при рН 5,0 контролировать с помощью 4MU-chitobiose в экстракте в желудке человека, эти группы не могут быть связаны с человеческим AMCase. Следовательно, хитинолитических деятельность и относительные уровни экспрессии белка между мышью и тканей желудка человека согласуются с нашими данными, полученными на уровне мРНК.

Обсуждение
<р> Предыдущие исследования на странице В естественных условиях
регулирование Chit1 и AMCase у человека и мыши были проведены с использованием Нозерн-блоттинг, полуколичественный ПЦР и ПЦР в реальном времени [6], [8], [9], [13], [14], [22] , [23]. Хотя эти методы имеют ряд преимуществ перед рассмотрением паттернов экспрессии генов, они не смогли сравнить уровни различных транскриптов генов в том же масштабе. В настоящем исследовании мы применили нашу методику [17], чтобы исследовать уровни экспрессии этих хитиназы в тканях человека. Кроме того, для оценки уровней экспрессии хитиназы в человеческих и мышиных тканях, мы разработали систему количественного определения с помощью одного человека и мыши гибрид стандартной ДНК. Мы показали ткане и видоспецифична экспрессию двух млекопитающих активных хитиназы Chit1 и AMCase. Наши данные в целом подтверждает результаты предыдущих исследований, о которых сообщили загрузки и др [6], [21]. Тем не менее, наш анализ является достаточно чувствительным, чтобы обнаружить мРНК и обеспечивает всесторонний обзор экспрессии генов узорах хитиназы в человеческих и мышиных тканей в том же масштабе.
<Р> Одна заметная характеристика экспрессии хитиназы млекопитающих сохраняющаяся экспрессия Chit1 между человека и мыши легочной ткани. Мы обнаружили, что выражалось Chit1 на относительно высоком уровне в человеческих и мышиных тканей легкого, которые были почти сопоставимы друг с другом, что указывает на уровень экспрессии мРНК Chit1 сохраняется. В легких Chit1 может выступать в качестве части системы защиты организма, который защищает от хитином, содержащих патогенные организмы, такие как грибы и клещей [25]. Сохранение экспрессии генов Chit1 в организме человека и мышей предполагает Физиологическое значение Chit1 в легких.
<Р> Выражение хитиназы в желудке представляет особый интерес. мРНК AMCase синтезируется при чрезвычайно высоких уровнях в желудке мыши, но не в желудке человека (Фиг.6В). Сравнение этих уровней экспрессии показали, что уровень мРНК AMCase в желудке человека составляет около 1 /2,800 того, что в ответной мыши. Мы подтвердили, что уровни экспрессии мРНК пепсиногена С и двух генов домашнего хозяйства были очень высоки в тканях человека и мыши желудка (Фиг.6В). Таким образом, пониженный уровень экспрессии мРНК AMCase в желудке человека не из-за деградации РНК в процессе синтеза кДНК. Кроме того, мы обнаружили, что желудок мыши выражали большое количество AMCase, в то время как человеческий аналог не сделал (рисунок 7). Эти результаты указывают на то, что уровень экспрессии AMCase в тканях желудка значительно отличается от человека и мыши.
<Р> Желудок является важным органом, который играет фундаментальную роль в переваривании пищи и защиты от вредных организмов. Соляная кислота выделяется в желудке, создавая кислых условиях (рН ~ 2), подходящих для переваривания белков пепсином [19], [26]. Мышиные AMCase показывает стабильность и глубокую кислоты наиболее активен при рН около 2 [6]. Желудок мыши производит огромное количество мРНК AMCase [17] и его переводного продукта (рисунок 7). Следовательно, AMCase может функционировать как пищеварительный фермент, который разрушает хитин-содержащих продуктов в желудке мыши.
<Р> В отличие от этого, уровень экспрессии мРНК AMCase и ее продукции были относительно низкими в желудке человека (рис 5, Рисунок 6 и Рисунок 7). Это не является неожиданным, потому что современные люди не едят значительное количество хитин-содержащих продуктов. Эти результаты свидетельствуют о том, что AMCase не может играть определенную роль в защите против хитин-содержащих организмов в желудке человека. Многие болезни желудка связаны с инфицированием экзогенных организмов. Тяжесть гастрита ассоциированных инфекций, таких как хеликобактер пилори
может коррелировать с активностью эндогенных ферментов [23]. Таким образом, остается предметом дискуссий, участвует ли низкий уровень AMCase в желудке человека в ответ на желудочных расстройств.
<р> Высокий уровень хитинолитических деятельности были обнаружены в экстрактах желудка и кишечника мыши [6] , Поскольку существуют известные различия в уровнях экспрессии хитиназной в желудке между человеком и мышью, мы исследовали уровни экспрессии этих хитиназы в других органах пищеварения, в том числе слюнной железы и тонкого и толстого кишечника. Наши результаты указывают на то, что оба Chit1 и мРНК AMCase уровней в тонкой и толстой кишки были очень низкими в обоих человеческих и мышиных тканях, хотя мыши слюнной железы и желудка получают высокие уровни обоих хитиназы мРНК (рисунок 5). Эти результаты свидетельствуют о том, что у млекопитающих хитиназе белки в кишечнике мыши, вероятно, происходит из верхних отделов желудочно-кишечного тракта, таких как слюнные железы и желудка, что согласуется с предыдущим понятием загрузочными и др [6], [21].

уровни экспрессии гена Chit1 в легочной ткани сохраняется между людьми и мышами. В отличие от этого, уровень экспрессии AMCase в тканях желудка видовой специфичностью. Эти результаты свидетельствуют о том, что регуляция экспрессии мРНК Chiti1 в легких были сохранены в процессе эволюции, в то время как уменьшение экспрессии AMCase в желудке человека может быть результатом молчанием генов. Изучение регуляции экспрессии этих хитиназы млекопитающих может дать понимание патофизиологических роли этих ферментов. Детальная характеристика промоторных участков генов Chit1 и AMCase и отождествление цис
- и транс
-Актерское факторы будут необходимы для понимания селективного экспрессии генов этих хитиназы у людей и мышей.
<р> выражение Chit1 и AMCase мРНК индуцируется при различных патологических состояниях. Используя количественную систему, описанную здесь, мы сможем сравнить уровни мРНК хитиназы через ткани человека и мыши с помощью ПЦР в реальном времени. Этот анализ будет способствовать пониманию биологической функции этих хитиназы, особенно в патофизиологических исследованиях заболеваний человека с использованием мышиных моделей. Наша методика применима к квантификации мРНК нескольких генов между мыши и человека образцов с использованием той же шкалы. Практическое использование этого сравнительного экспрессии генов данных межвидовой является сравнение человеческих болезней с помощью мыши и клеточных культур, моделей.

Материалы и методы исследования

РНК и кДНК Получение
<р> Человеческая Общую РНК Master Panel II и Мышь Общую РНК Master Panel (Clontech Laboratories) были использованы для изучения распределения транскриптов в различных тканях. Человек Тонкая кишка Общую РНК был приобретен у фирмы Clontech Laboratories. Кроме того, РНК выделяли из слюнных желез и тонкой и толстой кишок 3-месячных мышей-самцов. C57BL /6J (CLEAR Япония) были выведены в RIKEN Brain Science Institute вивария. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных в RIKEN Brain Science Institute (утверждение № H19-2B013) путем. Все операции проводили с использованием диэтилового эфира в качестве анестезирующего средства, и все усилия были сделаны, чтобы свести к минимуму страдания. Ткани для получения мРНК были представлены Drs. Миядзаки и Nukina в RIKEN Brain Science Institute. Общую РНК получали из слюнной железы и тонкого и толстого кишечника с использованием TRIzol Реагент (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Мы проанализировали 21 различных тканей человека и восемь тканей взрослых мышей. Для того, чтобы удалить следовые количества загрязняющих геномной ДНК, РНК общие образцы обрабатывали RQ1 РНКазы ДНКазы (Promega) в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя. Каждая из общего количества образцов РНК подвергали обратной транскрипции с использованием случайных гексамеров в качестве праймеров, как сообщалось ранее [17].

ПЦР в реальном времени
<р> Создание и проверка в режиме реального времени система ПЦР для тканей человека проводили, как описано [17]; Единственным исключением является использование человеческих праймеров. Нуклеотидные последовательности праймеров, которые были выбраны для ПЦР в реальном времени для человеческой системы, приведены в таблице S1. Каждый образец был усилен в трех экземплярах, и каждый эксперимент повторяли по крайней мере два раза.

Строительство ДНК человека Стандарт и подготовка пяти человеческих кДНК, охватывающих всю область кодирования
<р> на строительство Стандартный матричной ДНК для генов человека и подготовки пяти человеческих кДНК, которая охватывает всю кодирующую область, были выполнены, по существу, как описано [17]; Единственным исключением является использование человеческих праймеров. Прямого и обратного праймеров приведены в таблице S2. Продукты ПЦР переваривали соответствующими ферментами рестрикции и лигируют с использованием ДНК-лигазы Т4. Лигированные фрагменты амплифицировали с использованием прямого праймера 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'и обратный праймер 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' и клонировали в pGEM-T Easy вектором (Promega). Проверенные последовательности кДНК, показаны на рис S2. нет.

• PLoS ONE: Желудок Температурные отчеты Reveal Уход Поведение и переход к потребления твердых продуктов питания в ка…
• PLoS ONE: Сыворотка Аполипопротеины C-I и C-III уменьшены в рак желудка пациентов: Результаты MALDI на основе Peptidome и имм…