PLOS ONE: Quantificação dos níveis de mRNA Chitinase em humanos e camundongos tecidos por PCR em Tempo Real: Expressão espécie-específicos de Acidic Mammalian Chitinase nos tecidos do estômago

Sumário

quitinase hidrolisa quitina, que é um N
-acetil-D-glucosamina de polímero que está presente em uma ampla gama de organismos, incluindo insectos, parasitas e fungos. Embora mamíferos não contêm quitina endógena, humanos e camundongos expressar dois quitinases ativas, quitotriosidase (chit1) e quitinase mamíferos ácida (AMCase). Uma vez que o nível de expressão destes quitinases é aumentada em várias condições inflamatórias, incluindo a doença de Gaucher e de ratinho modelos de asma, ambas as quitinases podem desempenhar papéis importantes nos fisiopatologias destas e de outras doenças. Recentemente, estabeleceu um sistema de PCR quantitativa usando um único DNA normal e mostraram que mRNA AMCase é sintetizado em níveis extraordinariamente elevados nos tecidos do estômago do rato. Neste estudo, aplicou-se esta metodologia para a quantificação de ARNm em tecidos humanos quitinase e descobriram que ambos os mRNAs de quitinase foram amplamente expressos em tecidos humanos normais. ARNm chit1 foi altamente expresso no pulmão humano, ao passo que o ARNm AMCase não foi sobre-expresso em tecidos normais do estômago humanos. Os níveis destes ARNms em tecidos humanos foram significativamente mais baixos do que os níveis de genes housekeeping. Porque os níveis de expressão AMCase eram bastante diferentes entre os tecidos humanos e de rato do estômago, foi desenvolvido um sistema de PCR quantitativo para comparar os níveis de ARNm entre os tecidos humanos e de ratinho utilizando um ratinho-humano híbrido de ADN padrão. A análise mostrou que o ARNm chit1 é expressa em níveis semelhantes em pulmão humano e de murganho normal. Em contraste, o nível de expressão AMCase no estômago humano foi significativamente menor do que o nível de expressão observado no estômago do rato. Estas diferenças de mRNA entre os tecidos do estômago humano e do rato foram refletindo diferenças nas atividades quitinolíticas e níveis de expressão da proteína. Assim, o nível de expressão do AMCase no estômago é específico da espécie

citação:. Ohno H, Y Togashi, Tsuda K, K Okawa, Kamaya H, Sakaguchi, M. et al. (2013) Quantificação dos níveis de mRNA Chitinase em humanos e camundongos tecidos por PCR em Tempo Real: Expressão espécie-específicos de Acidic Mammalian Chitinase nos tecidos do estômago. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10.1371 /journal.pone.0067399

editor: Emiko Mizoguchi, Hospital Geral de Massachusetts, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de janeiro de 2013; Aceito: 15 de maio de 2013; Publicação: 27 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ohno et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Research Grant Projeto do Instituto de Pesquisa de Ciência e Tecnologia, Universidade de Kogakuin. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

quitina, que é um polímero de N
-acetil-D-glucosamina, é o segundo polissacárido mais abundante na natureza [1]. É um componente integral dos exoesqueletos de insectos e crustáceos, as bainhas microfilária de nemátodos parasitas e das paredes celulares dos fungos [1], [2].

quitinases são enzimas que digerem o polímero quitina. Embora os mamíferos não produzem quitina, os seres humanos e os ratos têm dois genes que codificam quitinases activas, quitotriosidase (chit1) e quitinase ácida de mamífero (AMCase) [2], [3]. Chit1 foi o primeiro quitinase de mamífero a ser purificado e clonado [4], [5]. AMCase, que é o segundo mais activo quitinase em mamíferos, foi identificada como uma enzima de compensação, para chit1 e nomeado para a sua actividade óptima em condições ácidas [6].

ambas as enzimas exibem homologia de sequência de quitinases bacterianas e pertencem 18 família de glicosil hidrolases, que inclui também proteínas quitinase-like que estão estruturalmente relacionados com, mas não têm actividade quitinases quitinolítica [2], [3]. O AMCase murino apresenta homologia de sequência com chit1, com uma identidade de 52% e uma similaridade de 60% [6]. O locus do gene chit1 humana é encontrado no cromossoma [7] 1q32, enquanto que o gene AMCase humano está localizado no cromossoma 1p13 [6]. Ambos os genes são compostas por 12 exões e codificar diversas isoformas de splicing [6] - [9]. A homologia de sequência e a conservação das fronteiras intrão-exão entre os genes chit1 e AMCase sugerem que estes genes surgiu a partir de uma duplicação de um gene ancestral [3], [6].

Estudos recentes têm mostrado associações entre a expressão das quitinases de mamíferos e condições inflamatórias. Por exemplo, os níveis de chit1 são elevados no plasma de pacientes com a doença de Gaucher, o fluido de lavagem broncoalveolar de fumadores e doentes com doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) e no fluido cerebrospinal de pacientes com a doença de Alzheimer [9] - [12] . expressão e actividade AMCase também são regulados positivamente durante as respostas alérgicas das vias aéreas em modelos de ratinho de asma [13]. quitina polimérico AMCase induz a expressão e o recrutamento de células imunitárias que estão associados com a alergia e asma [14]. Além disso, várias variantes genéticas de AMCase estão associados com asma brônquica em seres humanos [15], [16]. Estes resultados sugerem fortemente que as enzimas quitinolíticas desempenham papéis importantes na resposta à doença. No entanto, suas funções fisiopatológicos permanecem pouco compreendidos.

Quantificação de chit1 e níveis de mRNA AMCase é um passo importante para a compreensão do in vivo
regulação da quitinases em mamíferos. Recentemente, estabeleceu um sistema de PCR quantitativo utilizando um único ADN padrão para quantificar e comparar os níveis dos genes quitinase e referência da expressão na mesma escala [17]. Em nosso artigo anterior, mostramos que AMCase é um grande transcrito no estômago do rato e é expresso em níveis que são comparáveis ​​aos de pepsinogen C [17].

Aqui, nós aplicamos nossa metodologia para a quantificação da os níveis de ARNm das quitinases de mamífero em tecidos humanos normais, o que é um pré-requisito para compreender os seus papéis patológicos em tecidos doentes. Além disso, foi estabelecido um sistema de quantificação para comparar os níveis de mARN de vários genes de entre uma série de tecidos humanos e de ratinho, utilizando um ratinho-humano híbrido de ADN padrão. O nosso estudo mostra que o ARNm quantitativamente chit1 é expresso em níveis igualmente elevados em pulmões de humano e de ratinho normais. Em contraste, AMCase é predominantemente sobre-expressos em rato, mas não no estômago humano.

Resultados

Criação e validação de um Real-time PCR System para detecção de Quitinases em tecidos humanos

Nós previamente estabelecido um sistema de PCR em tempo real que é capaz de determinar os níveis de ARNm das duas quitinases de mamífero em tecidos de ratinho e de comparar estes níveis com os dos genes de referência usando a mesma escala [17]. No presente estudo, nós quisemos comparar os níveis dos genes chit1 AMCase e de expressão de genes através de tecidos humanos normais (Figura 1A). Tal como em tecidos de rato [17], utilizou-se a genes de manutenção desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) e β-actina como genes de referência, porque eles são constitutivamente expressas em níveis elevados na maioria das células [18]. Além disso, nós escolhemos pepsinogénios C (também conhecida como progastricsin) como um gene de referência no estômago, porque o nível de ARNm AMCase no estômago do rato era comparável para o nível de mRNA de pepsinogénio C, o que constitui um importante componente da mucosa gástrica [ ,,,0],19]. Usando estes três genes de referência, foram avaliados os níveis de chit1 AMCase e expressão de genes em tecidos humanos normais (Figura 1A).

concebidos vários conjuntos de iniciadores para a PCR quantitativa e avaliada a sua adequação com base em se eles exibiram um Single temperatura de fusão (Tm) e uma única banda num gel de poliacrilamida a 10% [17]. Como mostrado na Figura S1A-E, as curvas de dissociação de os cinco ADNc exibem apenas um pico cada. eletroforese em gel mostrou claramente bandas individuais nos tamanhos esperados para chit1 (55 pb), AMCase (62 pb), GAPDH (57 pb), β-actina (57 pb) e pepsinogênio C (61 pb) (Figura S1F). Assim, confirmou-se que os produtos de PCR foram amplificados correctas a partir da mistura de ADNc de tecido humano.

próxima construído um ADN modelo padrão para PCR em tempo real através da ligação das cinco fragmentos alvo em um-para-um rácio (Figura 1B e Figura S2). O 1396-nucleotide-longa DNA modelo padrão consistiu em cinco fragmentos de cDNA que cobriam a região alvo PCR e 60-143 bases das regiões de flanqueamento e continha Bgl
II, Sal
I, Xho
I e Não
sites que eu restrição (Figura 1B e Figura S2).

A quantificação de ambas as quitinases e os mRNAs de referência baseia-se em curvas padrão. Usamos as curvas padrão para comparar e avaliar as estratégias em tempo real quantificação PCR. Cada curva padrão foi gerada utilizando 10 diluições em série de ADN humano normal e os cinco pares de iniciadores diferentes (Figura S3A-E, vermelho círculos fechados). Usando o ADN molde padrão contendo os cinco fragmentos de ADNc humano, quantidades iguais pode ser atribuído a todos os cinco genes em cada diluição utilizar para construir as curvas padrão (Figura S3A-E, vermelho círculos fechados).

Para testar a igualdade das curvas, uma concentração conhecida do ADNc humano de codificação inteira foi amplificada e subsequentemente analisados ​​como uma amostra desconhecida. Este ensaio foi realizado para verificar que cada diluição testada resultou na quantidade esperada. Como mostrado na Figura S3A-E, azul losangos fechados, foram observadas quantidades iguais para cada diluição testada; estes foram usados ​​para construir a curva padrão.

A quantificação de transcritos baixa abundância e transcrições abundantes nos permite validar a sensibilidade e fiabilidade de PCR em tempo real, indicando que o nosso tempo real método de PCR oferece uma grande faixa dinâmica de quantificação, de alta precisão e alta sensibilidade (Figura S3A-e). Assim, o nosso tempo real método de PCR fornece valores confiáveis ​​para os dois genes quitinase humanos e os três genes de referência humanos na mesma escala.

A expressão de chit1 e AMCase em Normal Tecidos Humanos

Para estudar o in vivo
regulação da expressão dos genes e chit1 AMCase humanos, o ARN total a partir de vários tecidos humanos normais foi analisada utilizando um ensaio em tempo real quantitativa de PCR com o ADN tipo especialmente concebido (Figura 1). Os valores resultantes foram expressas como moléculas por 10 ng de ARN total em eixo Y (Figura 2 e Figura 3).

Ambos chit1 e AMCase mRNAs foram amplamente expressos em tecidos normais humanos (Figura 2A e 2B). Os níveis mais elevados de ARNm chit1 foram detectados em pulmão humano, seguindo-se o baço, o fígado fetal e timo (Figura 2A). Os níveis mais elevados de ARNm AMCase foram detectados em pulmão, seguido de cérebro fetal, fígado, glândula da tiróide e do coração (Figura 2B). Embora ARNm AMCase foi expressa a níveis extraordinariamente elevados no estômago do rato [17], o seu nível de expressão no estômago humano foi muito mais baixa do que aqueles no pulmão, cérebro fetal, fígado fetal, tiróide e coração (Figura 2B). Em outros tecidos, tanto o chit1 e AMCase mRNAs foram expressos em baixo, mas os níveis facilmente detectáveis ​​acima do fundo (Figura 2A e Figura 2B).

Quando comparado com os níveis de ARNm AMCase, ARNm chit1 foi expresso em níveis relativamente mais elevados no baço e no fígado fetal. Em contraste, cérebro fetal, próstata e fígado expressa uma quantidade mais elevada de ARNm de ARNm AMCase chit1 (Figura 2).

A análise dos níveis de expressão de chit1, AMCase, GAPDH, β-actina e Pepsinogênio C mRNAs normais tecidos do pulmão humano e de estômago

Uma vez que muitos estudos sobre a fisiopatologia da quitinases de mamíferos foram realizadas utilizando pulmão e estômago [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], foram comparados os níveis de expressão das quitinases e os genes de referência nestes dois tecidos humanos. Os dados quantitativos são mostrados na Figura 3. A normalização do nível chit1 a 1,0, os níveis de expressão relativos de AMCase, GADPH, e ARNm de p-actina em tecido de pulmão humano foram de 0,8, 39 e 343, respectivamente (Figura 3A). Os genes GAPDH e? -actina São bem conhecidos e genes de manutenção são constitutivamente expressas em níveis elevados na maioria dos tecidos [18]. Os nossos resultados indicam que chit1 e AMCase mRNAs são expressos em níveis semelhantes em tecido de pulmão humano normal, embora o nível de expressão chit1 foi muito mais baixa do que as dos dois genes de manutenção (comparar trama não-log com gráfico log na Figura 3).

Normalizando o nível chit1 a 1,0, os níveis de expressão relativos da AMCase, GAPDH, β-actina e pepsinogénios C em tecido de estômago humano normal foram de 1,5, 323, 1736 e 3962, respectivamente (Figura 3B). Aqui, os níveis de ambos chit1 e AMCase expressão eram muito mais baixos do que aqueles de GAPDH e β-actina. Embora pepsinogénios C ARNm foi altamente expressa nas amostras estômago humano, AMCase ARNm foi comparável à chit1. Estes resultados indicam que os níveis de expressão chit1 e AMCase são relativamente baixos nos tecidos humanos examinados e que o nível de expressão AMCase no estômago difere significativamente entre o ser humano e do rato.

Criação e validação de um Sistema de Quantificação para Humana e rato quitinase mRNAs usando um ADN híbrido humano-ratinho

próxima procurado para comparar os níveis das duas quitinases entre humanos e ratinhos de expressão na mesma escala, utilizando um sistema de PCR em tempo real (Figura 4A). Por isso, construiu um ratinho-humano de DNA padrão híbrido para PCR em tempo real através da ligação dos ADNs molde padrão humano e do rato (Figura 4B). O modelo 2305-nucleotide-longa resultante DNA continha dez fragmentos de cDNA que cobriam a região alvo PCR e 9-143 bases das regiões de flanqueamento dos genes humanos e de rato (ver detalhes na Figura S4).

As validações da curva padrão e o sistema quantitativo PCR em tempo real foram realizados como se mostra na figura S5, S6 e Figura Figura S7. As diluições em série do ratinho-humano híbrido de ADN padrão foram utilizados para construir uma curva padrão. Cada curva padrão foi gerada utilizando 10 diluições em série de ADN padrão e os cinco pares de iniciadores diferentes (Figura S5A-E, círculos fechados vermelho). Usando o ADN molde padrão contendo os cinco fragmentos de ADNc, quantidades iguais pode ser atribuído a todos os cinco genes humanos, utilizando pares de iniciadores específicos de humano em cada diluição, que foi usado para construir as curvas padrão (Figura S5A-E, vermelho círculos fechados ). Do mesmo modo, quantidades iguais pode ser atribuído a todos os cinco genes de murino (Figura S6A-E, triângulos fechados roxo).

Para testar a igualdade das curvas, uma concentração conhecida de todo o ADNc codificante foi amplificado e subsequentemente analisados ​​como uma amostra desconhecida. Quantidades iguais de ADNc de codificação inteira humanos foram observados para cada uma das diluições testadas; Estas quantidades foram em seguida utilizadas para construir a curva padrão (Figura S5A-E, azul losangos fechados). Da mesma forma, as quantidades iguais de ADNc de codificação inteiras de rato também foram observados (Figura S6A-E, cruzes verdes). A quantificação de transcritos baixa abundância e transcrições abundantes nos permite validar a sensibilidade e fiabilidade de PCR em tempo real, indicando que o nosso tempo real método de PCR oferece uma grande gama dinâmica de quantificação, de alta precisão e alta sensibilidade (Figura S5A- e e Figura 6A-e).

Além disso, as quatro linhas (duas curvas padrão e duas curvas de diluição das concentrações conhecidas de todo os ADNc que codificam humano e de ratinho, respectivamente) sobrepostos (Figura S7A-e). Assim, o nosso tempo real método de PCR fornece valores relativos confiáveis ​​para os quatro genes quitinase e os seis genes de referência (Figura 4B).

Comparação de chit1 e mRNA AMCase Níveis entre tecidos normais humanos e do rato

Foi utilizado o total RNA Mestre Painel II Humano e o RNA total Painel-Mestre mouse (Clontech Laboratories) como fontes de RNA total para este estudo. Existem quatro tecidos (pulmão, fígado, baço e rim que se sobrepunham) entre os painéis de humano e de ratinho e relacionados com a asma e a doença de Gaucher. Uma vez que havia diferenças importantes na expressão de quitinase nos tecidos do estômago, que também analisaram os níveis de expressão destes quitinases em outros órgãos digestivos, glândulas salivares, estômago, intestinos delgado e grosso entre o ser humano e do rato. Foram quantificados e comparados os níveis de expressão nestes tecidos usando o DNA humano-rato padrão híbrido (Figura 4B); os dados quantitativos são mostrados na Figura 5.

Encontrámos o mais alto nível de expressão de ARNm chit1 no rato (mas não humano) no estômago, seguido de tecidos de pulmão humano. Em geral, Chit um ARNm foi expresso em níveis elevados nos tecidos humanos do que nos tecidos de ratinho, excepto para o estômago (Figura 5A). O nível mais elevado de ARNm AMCase expressão era no estômago do rato, seguida pela glândula salivar do rato. Nos outros tecidos humanos e de ratinho, os níveis de ARNm AMCase eram baixos em tecidos humanos (Figura 5B). Ambos os níveis chit1 e mRNA AMCase em intestinos delgado e grosso foram muito baixas em ambos os tecidos humanos e de rato (Figura 5), ​​que foram consistentes com os dados anteriores obtidos por Northern blotting [6], [21].

descobriram que AMCase ARNm foi expressa em baixos níveis no estômago humano normal, mas foi fortemente expressa em tecidos do estômago do rato (Figura 5B). Assim, nós também comparados os níveis das quitinases e os genes de referência, utilizando os ADNc que foram preparados a partir dos tecidos do pulmão e do estômago de expressão.

normalizando o nível chit1 humano no tecido pulmonar a 1,0, os níveis de expressão relativos chit1 do rato, de ratinho e humana AMCase AMCase mRNAs foram de 0,3, 0,3 e 7, respectivamente (Figura 6A). Murino AMCase foi altamente expresso no pulmão do rato. O nível de ARNm chit1 no pulmão humano foi cerca de 3 vezes mais elevada do que no pulmão do rato. Os níveis de ARNm e chit1 AMCase foram significativamente inferiores aos níveis dos genes GAPDH e p-actina (Figura 6A) de expressão.

Normalizando o nível chit1 humano em to1.0 estômago, os níveis de expressão relativos do rato chit1, o AMCase humano e o de ratinho AMCase mRNAs foram de 10, 0,7 e 1,978, respectivamente (Figura 6B). Pepsinogênio C é um importante enzima digestiva no estômago. O nível de expressão de AMCase em ratinhos foi muito maior do que os da GAPDH e β-actina e foi comparável para o nível de pepsinogénio C, enquanto que o estômago humano exibiu um nível muito baixo de expressão de ARNm de AMCase. Os níveis de expressão relativa de mRNA no estômago humano e rato foram de 1,0 e 2,826, respectivamente.

A fim de verificar se as diferenças de nível de mRNA entre rato e humano foram refletidos no nível de proteína, o próximo analisados ​​atividade enzimática destes quitinases nos tecidos gástricos. Nós primeiramente analisados ​​atividade AMCase nos tecidos do estômago de ratinho e humanas. O AMCase rato mostra um pH óptimo dupla com um grande óptima à volta de pH 2 e uma óptima secundário à volta de pH 5 [6], ao passo que AMCase humano mostra largo de pH óptimo a pH 5 2~pH [16], [24]. Assim, nós medimos a actividade quitinolítica a pH 2.0 e pH 5.0 utilizando o substrato sintético do β-D-N 4-metil, N-diacetylchitobiose (4MU-quitobiose) [6], [21]. Detectamos atividade quitinolítica robusta no extrato de estômago mouse no pH 2.0 e forte atividade em pH 5,0. Em contraste, nenhuma actividade foi detectada em que de humano a pH 2,0 e uma actividade muito baixa foi observada a pH 5,0 (Figura 7A, esquerda).

O ensaio enzimático chit1 padrão foi realizada utilizando 4-metilumbeliferil β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) a pH 5,2 [6], [10], [21], [25]. Para monitorar o efeito de AMCase sobre a atividade chit1, analisamos a atividade de quitinase usando 4MU-chitotriose em pH 2.0. Relativamente forte atividade de quitinase contra 4MU-chitotriose foi detectada no extrato de estômago mouse no pH 2,0 (Figura 7A direita), e também detectada atividade de quitinase fraco a pH 5,2 (Figura 7A direita). Desde AMCase tem uma segunda óptima a cerca de pH 5, estes resultados indicaram que a maioria da actividade de quitinase a pH 5,2 pode ser devido a AMCase em vez de chit1 e que rato AMCase pode hidrolisar-4MU chitotriose como substrato, a pH 2,0. Tomados em conjunto, a maior parte da actividade de quitinase no estômago do rato resultou de actividade AMCase. No extrato estômago humano também observamos níveis muito fracos, mas detectáveis ​​de actividade quitinolítica em pH 2.0 e pH 5.2 (Figura 7A, direito, painel inferior). actividade de quitinase a pH 5,2 foi comparável à que a pH 2,0, indicando expressão chit1 no estômago humano.

Finalmente, analisou-se os níveis de expressão de proteína através de Western blotting utilizando anticorpos contra AMCase. Os anticorpos anti-AMCase foram gerados contra o péptido anteriormente relatado rato [14] e contraparte humana. anticorpo AMCase anti-rato reconheceu uma única banda de proteína robusto no extrato do estômago do rato, mas não de humano (Figura 7B, à esquerda). Da mesma forma anticorpo AMCase anti-humano também reconheceu uma única banda no extrato do mouse (Figura 7B, à direita). No extracto humana havia bandas fracas de peso molecular ligeiramente mais elevado que foram reconhecidos por ambos os anticorpos humanos e de rato (Figura 7B). Uma vez que não havia nenhuma actividade de quitinase significativa em qualquer pH 2,0 ou pH 5,0 monitorizadas utilizando 4MU-quitobiose no extracto estômago humano, estas bandas não poderia estar relacionada com a AMCase humano. Consequentemente, as atividades quitinolíticas e os níveis de expressão de proteína relativos entre tecidos estômago humano mouse e foram consistentes com os nossos dados obtidos ao nível do ARNm.

Discussão

Estudos anteriores sobre o In vivo
regulação da chit1 e AMCase em humano e de ratinho foram realizadas utilizando manchas de Northern, PCR semi-quantitativa e em tempo real de PCR [6], [8], [9], [13], [14], [22] , [23]. Embora estes métodos têm várias vantagens sobre o exame de padrões de expressão de genes, eles falharam para comparar os níveis dos transcritos de genes diferentes na mesma escala. No estudo atual, nós aplicamos a nossa metodologia [17] para investigar os níveis desses quitinases em tecidos humanos de expressão. Além disso, para avaliar os níveis de quitinases em tecidos humanos e do rato de expressão, foi desenvolvido um sistema de quantificação utilizando um único ser humano e DNA padrão híbrido mouse. Nós mostramos para tecidos e de expressão das duas quitinases ativas de mamíferos, chit1 e AMCase espécie-específico. Nossos dados geralmente apóia estudos anteriores relatados pela bota et al [6], [21]. No entanto, nossa análise é suficientemente sensível para detectar mRNA e fornece um completo levantamento dos padrões das quitinases em tecidos humanos e de rato na mesma escala de expressão gênica.

Uma característica notável da expressão das quitinases de mamíferos é a expressão conservada do chit1 entre tecidos do pulmão humano e do rato. Descobrimos que chit1 foi expressa em níveis relativamente elevados nos tecidos de pulmão humano e de ratinho que foram quase comparáveis ​​umas com as outras, o que indica que o nível de expressão do ARNm chit1 é conservada. Nos pulmões, chit1 pode actuar como parte do sistema de defesa do hospedeiro que protege contra agentes patogénicos contendo quitina, tais como fungos e ácaros [25]. A conservação da expressão do gene chit1 em humanos e ratos sugere a importância fisiológica de chit1 no pulmão.

A expressão de quitinases no estômago é de particular interesse. ARNm AMCase é sintetizado a níveis extraordinariamente elevados no estômago do rato mas não no estômago humano (Figura 6B). A comparação dos níveis de expressão destes mostrou que o nível de ARNm AMCase no estômago humano foi de cerca de 1 /2.800 de que, no homólogo de rato. Confirmou-se que os níveis de expressão de ARNm de pepsinogénio C e os dois genes de manutenção eram muito elevados nos tecidos do estômago humano e de ratinho (Figura 6B). Assim, o nível de expressão de ARNm diminuída AMCase no estômago humano não é devido à degradação do ARN durante a preparação de ADNc. Além disso, verificou-se que o estômago do rato expressaram grande quantidade de AMCase, enquanto que o homólogo humano não o fez (Figura 7). Estes resultados indicam que o nível de expressão do AMCase nos tecidos do estômago difere significativamente entre humanos e ratinhos.

O estômago é um órgão importante que desempenha papéis fundamentais na digestão de alimentos e de protecção contra organismos prejudiciais. O ácido clorídrico é secretada no estômago, criando condições ácidas (pH = ~ 2) adequadas para a digestão de proteínas por pepsina [19], [26]. Murino AMCase mostra estabilidade ácida profunda e é mais ativa em cerca de pH 2 [6]. O estômago do rato produz uma quantidade enorme de ARNm AMCase [17] e o seu produto de tradução (Figura 7). Consequentemente, AMCase pode funcionar como uma enzima digestiva que decompõe alimentos contendo quitina no estômago do rato.

Em contraste, o nível de ARNm AMCase e seu produto de expressão foram relativamente baixos no estômago humano (Figura 5, A Figura 6 e Figura 7). Isso não é inesperado porque os seres humanos modernos não comer uma quantidade significativa de alimentos contendo quitina. Estes resultados sugerem que AMCase não podem desempenhar um papel na defesa contra organismos contendo quitina no estômago humano. Muitas doenças do estômago estão associadas com a infecção por organismos exógenos. A gravidade de infecções associadas aos gastrite, como Helicobacter pylori
pode se correlacionar com a atividade das enzimas endógenas [23]. Resta, portanto, um assunto de debate se o baixo nível de AMCase no estômago humano participa na resposta a perturbações gástricas
.

Um elevado nível de actividades quitinolíticas têm sido detectadas em extractos do estômago e do intestino de rato [6] . Uma vez que existem diferenças importantes nos níveis de expressão da quitinase no estômago entre humano e de ratinho, foram examinados os níveis de expressão destes quitinases em outros órgãos digestivos, incluindo glândulas salivares e intestino delgado e grosso. Nossos resultados indicam que os níveis tanto chit1 e mRNA AMCase em intestinos delgado e grosso foram muito baixas em ambos os tecidos humanos e de rato, embora glândula salivar do rato e do estômago produziram altos níveis de ambas as quitinases mRNAs (Figura 5). Estes resultados sugerem que as proteínas quitinase de mamíferos no intestino do rato são provavelmente derivada a partir das partes superiores do tracto gastrintestinal, tais como a da glândula salivar e do estômago, o que é consistente com a noção prévia pela bota et ai [6], [21].

os níveis de expressão do gene em tecidos de pulmão chit1 é conservada entre humanos e ratinhos. Em contraste, o nível de expressão do AMCase nos tecidos do estômago é específico da espécie. Os resultados sugerem que a regulação da expressão de ARNm Chiti1 no pulmão foi preservada durante a evolução, ao passo que a diminuição da expressão de AMCase no estômago humano pode ser o resultado do silenciamento do gene. A análise da regulação da expressão destes quitinases mamíferos poderia dar insights sobre os papéis fisiopatológicos destas enzimas. A caracterização detalhada das regiões promotoras dos genes chit1 e AMCase e a identificação do cis
- e factores trans actuando
irá ser necessário para a compreensão da expressão de genes selectiva destes quitinases em seres humanos e murganhos.

A expressão de ARNm AMCase chit1 e é induzida sob várias condições patológicas. Usando o sistema quantitativo descrito aqui, nós será capaz de comparar os níveis de mRNA de quitinase em todo tecidos humanos e de rato por PCR em tempo real. Esta análise irá auxiliar a compreensão da função biológica destes quitinases, especialmente nos estudos de fisiopatologia de doenças humanas usando modelos murinos. A nossa metodologia é aplicável para a quantificação do ARNm de genes múltiplos entre amostras humanas e de ratinho, utilizando a mesma escala. A utilização prática dos dados de expressão de genes entre espécies comparativa é a comparação de doenças humanas com modelos de ratos e de cultura de células.

Materiais e Métodos

RNA e cDNA Preparação

o ARN total mestre Panel II humana e o ARN total do painel mestre do rato (Clontech Laboratories) foram utilizados para examinar a distribuição de transcritos em diferentes tecidos. Intestino delgado humano ARN total foi adquirido a Clontech Laboratories. Além disso, o ARN foi isolado a partir das glândulas salivares e intestino grosso e delgado de ratinhos macho de 3 meses de idade. Camundongos C57BL /6J (CLEAR Japão) foram criados no Centro de RIKEN Brain Science Institute Animal. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal do Instituto de Ciência do cérebro RIKEN (Aprovação No. H19-2B013). Todos cirurgia foi realizada utilizando éter dietílico como um anestésico, e todos foram feitos esforços para minimizar o sofrimento. Tecidos para a preparação de mRNA foram fornecidos pelos Drs. Miyazaki e Nukina em RIKEN Cérebro Science Institute. O ARN total foi preparado a partir de glândulas salivares e intestino delgado e grosso, utilizando TRIzol Reagent (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Foram analisados ​​21 diferentes tecidos humanos e oito tecidos de ratinho adulto. Para remover quantidades vestigiais de contaminantes de ADN genómico, as amostras de RNA total foram tratados com ADNase RQ1 isenta de RNase (Promega) de acordo com as recomendações do fabricante. Cada uma das amostras de ARN total foi submetido a transcrição reversa usando hexâmeros aleatórios como iniciadores, como descrito anteriormente [17].

-PCR em tempo real

O estabelecimento e validação do tempo real sistema de PCR de tecidos humanos foram realizados como descrito [17]; A única excepção foi a utilização de iniciadores humanos. As sequências de nucleótidos dos iniciadores que foram seleccionadas para a PCR em tempo real para o sistema humano são apresentados na Tabela S1. Cada amostra foi amplificado em triplicado e cada experiência foi repetida pelo menos duas vezes.

A construção do ADN padrão humano e Cinco Preparação de cDNAs humanos, abrangendo toda a região de codificação de

A construção do ADN modelo padrão para os genes humanos e a preparação dos cinco ADNc humanos que cobriam a totalidade da região de codificação foram realizadas essencialmente como descrito [17]; A única excepção foi a utilização de iniciadores humanos. Os iniciadores directos e reversos estão listados na Tabela S2. Os produtos de PCR foram digeridos com as enzimas de restrição apropriadas e ligado utilizando a ligase de ADN de T4. Os fragmentos ligados foram amplificados utilizando o iniciador de sentido directo 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'e o iniciador inverso 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' e clonado no vector pGEM-T Easy (Promega). As sequências verificadas dos ADNc são mostradas na Figura S2. não.

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