PLoS ONE: Kvantifisering av Chitinase mRNA nivåer i menneske og mus vev ved Real-Time PCR: artsspesifikke uttrykk for Surt pattedyr Chitinase i magen Vev

Abstract

Chitinase hydrolyserer chitin, som er et N
-acetyl-D-glukosamin polymer som er til stede i et bredt spekter av organismer, inklusive insekter, parasitter og sopp. Selv om pattedyr inneholder ikke endogen kitin, mennesker og mus uttrykke to aktive kitinaser, chitotriosidase (Chit1) og syrlig pattedyr kitinase (AMCase). På grunn av at nivået av ekspresjon av disse kitinaser økes i mange inflammatoriske tilstander, blant Gauchers sykdom og musemodeller av astma, kan begge kitinaser spiller viktige roller i pathophysiologies av disse og andre sykdommer. Vi har nylig etablert en kvantitativ PCR system ved hjelp av en enkel standard DNA og viste at AMCase mRNA er syntetisert på ekstraordinært høye nivåer i mus magen vev. I denne studien, søkte vi denne metodikken til kvantifisering av kitinase mRNA i humant vev og fant at begge kitinase mRNA ble allment uttrykt i normale humane vev. Chit1 mRNA ble sterkt uttrykt i den humane lunge, mens AMCase mRNA ikke ble overuttrykt i normale humane mage vev. Nivåene av disse mRNA i menneskelig vev var betydelig lavere enn nivåene av housekeeping gener. Fordi AMCase ekspresjonsnivåene var ganske forskjellig mellom de humane og mus mage vev, har vi utviklet en kvantitativ PCR system for å sammenligne mRNA-nivåer mellom menneske- og musevev ved anvendelse av en human-mus-hybrid standard DNA. Analysen viste at Chit1 mRNA er uttrykt på tilsvarende nivå i normal human og mus lunge. I motsetning til dette AMCase ekspresjonsnivået i human magesekken var signifikant lavere enn ekspresjonsnivået observert i mus magen. Disse mRNA-forskjellene mellom mus og menneske mage vev ble reflekterer forskjeller i kitinolytiske aktiviteter og nivåer av proteinekspresjon. Således ekspresjonsnivået av AMCase i magen er artsspesifikt

relasjon:. Ohno M, Togashi Y, Tsuda K, Okawa K, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) Kvantifisering av Chitinase mRNA nivåer i menneskelig og mus vev ved Real-Time PCR: artsspesifikke uttrykk for Surt pattedyr Chitinase i magen vev. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10,1371 /journal.pone.0067399

Redaktør: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, USA

mottatt: 05.01.2013; Godkjent: 15 mai 2013; Publisert: 27 juni 2013

Copyright: © 2013 Ohno et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prosjektstipend fra Research Institute of Science and Technology, Kogakuin University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Chitin, som er en polymer av N
-acetyl-D-glukosamin, er det andre mest tallrike polysakkarid i naturen [1]. Det er en integrert del av de exoskeletons av krepsdyr og insekter, de mikrofila kapper av kveis og soppcelleveggene [1], [2].

kitinaser er enzymer som fordøye den kitin polymer. Selv om pattedyr ikke produsere kitin, mennesker og mus har to gener som koder aktive kitinaser, chitotriosidase (Chit1) og surt pattedyr kitinase (AMCase) [2], [3]. Chit1 var den første pattedyr kitinase som skal renses og klones [4], [5]. AMCase, som er den nest mest aktive kitinase hos pattedyr, ble identifisert som et kompenserende enzym for Chit1 og oppkalt etter sin optimal aktivitet i sure forhold [6].

Begge enzymer utstillings sekvenshomologi bakterielle kitinaser og tilhører familie av glykosyltransferaser 18 hydrolaser, som også inkluderer kitinase-lignende proteiner som er strukturelt relatert til kitinaser men mangler kitinolytiske aktivitet [2], [3]. Den murine AMCase viser sekvenshomologi Chit1, med en identitet på 52% og en likhet på 60% [6]. Det geometriske sted for det humane genet Chit1 er funnet på kromosom 1q32 [7], mens det humane AMCase-genet er lokalisert på kromosom 1p13 [6]. Begge gener er sammensatt av 12 eksoner og koder for forskjellige spleise isoformer [6] - [9]. Sekvensen homologi og bevaring av intron-exon grensene mellom Chit1 og AMCase gener tyder på at disse genene oppsto fra en duplisering av en nedarvet genet [3], [6].

Nyere studier har vist sammenheng mellom ekspresjon av pattedyr kitinaser og inflammatoriske tilstander. For eksempel, er nivåene av Chit1 forhøyet i plasma hos pasienter med Gauchers sykdom, bronkoalveolar vaskevæske fra røykere og pasienter med kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) og cerebrospinalvæsken til pasienter med Alzheimers sykdom [9] - [12] . AMCase uttrykk og aktivitet er også oppregulert i løpet av allergiske luftveisresponser i musemodeller av astma [13]. Polymer kitin induserer AMCase uttrykk og rekruttering av immunceller som er forbundet med allergi og astma [14]. I tillegg er flere genetiske varianter av AMCase forbundet med bronkial astma hos mennesker [15], [16]. Disse resultatene tyder sterkt på at de kitinolytiske enzymer spiller viktige roller i responsen på sykdommen. Men fortsatt sine patofysiologiske funksjoner dårlig forstått.

Kvantifisering av Chit1 og AMCase mRNA nivåer er et viktig skritt mot forståelsen av in vivo
regulering av kitinaser hos pattedyr. Vi har nylig etablert en kvantitativ PCR system som bruker en enkelt standard DNA for å kvantifisere og sammenligne uttrykket nivåer av kitinase og referanse gener i samme målestokk [17]. I vår tidligere papir, viste vi at AMCase er en vesentlig transkripsjon i muse magen og er uttrykt på nivåer som er sammenlignbare med de av pepsinogen C [17].

Her har vi anvendt vår metode for kvantifisering av mRNA-nivåer fra pattedyr kitinaser i normale humane vev, noe som er en forutsetning for å forstå deres patologiske roller i syke vev. Videre er etablert vi et kvantifisering system for å sammenligne mRNA-nivåene av multiple gener mellom et antall humane og musevev ved hjelp av en human-mus-hybrid standard DNA. Vår studie viser kvantitativt at Chit1 mRNA uttrykkes på tilsvarende høye nivåer i normale menneskelige og mus lungene. I kontrast er AMCase hovedsakelig uttrykt i mus, men ikke menneskelige magen.

Resultater

Etablering og validering av en Real-time PCR System for deteksjon av kitinaser i menneskelig vev

Vi har tidligere etablert en real-time PCR system som er i stand til å bestemme mRNA-nivåer i de to pattedyr kitinaser i musevev og å sammenlikne disse nivåene med de fra referanse gener ved anvendelse av samme skala [17]. I denne studien ønsket vi å sammenligne genuttrykk nivåer av Chit1 og AMCase gener på tvers av normale menneskelige vev (Figur 1a). Som i mus vev [17], vi brukte housekeeping gener glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og β-actin som referanse gener fordi de er konstitutivt uttrykt ved høye nivåer i de fleste celler [18]. I tillegg valgte vi pepsinogen C (også kjent som progastricsin) som en referanse gen i magesekken, fordi nivået av AMCase mRNA i mus magen var sammenlignbar med mRNA-nivået av pepsinogen C, som utgjør en hovedkomponent av den gastriske mucosa [ ,,,0],19]. Ved hjelp av disse tre referanse gener, vi har evaluert genuttrykk nivåer av Chit1 og AMCase i normale menneskelige vev (figur 1A).

Vi har utformet flere sett med primere for kvantitativ PCR og evaluert deres egnethet basert på om de viste en enkelt smeltetemperatur (Tm) og et enkelt bånd på en 10% polyakrylamidgel [17]. Som vist i fig S1A-E, er dissosiasjon kurver av de fem cDNA oppviser bare en topp hver. Gel elektroforese viste tydelig enkle bånd på de forventede størrelser for Chit1 (55 bp), AMCase (62 bp), GAPDH (57 bp), β-aktin (57 bp) og pepsinogen C (61 bp) (figur S1F). Således bekreftet vi at de korrekte PCR-produkter ble amplifisert fra humant vev cDNA-blanding.

neste konstruert en standard templat DNA for real-time PCR ved ligering av de fem puls fragmentene i en en-til-en forholdet (figur 1B og Figur S2). Den 1396-nukleotid lange standard mal DNA besto av fem cDNA fragmenter som dekket PCR målområdet og 60-143 baser av flankerende områder og inneholdt Bgl
II, Sal
jeg, Xho
jeg og Ikke
jeg restriksjonsseter (Figur 1B og figur S2).

kvantifisering av både kitinaser og referanse mRNA er avhengig av standardkurver. Vi brukte standardkurvene til å sammenligne og vurdere real-time PCR kvantifisering strategier. Hvert standardkurve ble generert ved bruk av 10-gangers seriefortynninger av human standard DNA og de fem forskjellige primerparene (figur S3A-E, rød lukkede sirkler). Ved å bruke standard mal DNA som inneholder de fem menneskelige cDNA fragmenter, kan like mengder tilordnes alle fem gener i hver fortynning bruk for å konstruere standardkurver (Figur S3A-E, rød stengt sirkler).

For å teste likheten av kurvene, en kjent konsentrasjon av det humane hele den kodende cDNA ble amplifisert og deretter analysert som en ukjent prøve. Denne analysen ble utført for å kontrollere at hver testet fortynning resulterte i den forventede mengde. Som vist i fig S3A-E, blå lukkede rhombuses, like mengder ble observert for hver testet fortynning; disse ble brukt til å konstruere standardkurven.

Kvantifisering av lav overflod utskrifter og rikelig transkripsjoner tillater oss å validere følsomhet og pålitelighet real-time PCR, noe som indikerer at vår real-time PCR-metoden tilbyr et stort dynamisk område på kvantifisering, høy nøyaktighet og høy følsomhet (Figur S3A-E). Dermed gir vår real-time PCR-metoden pålitelige verdier for de to menneskelige kitinase gener og de tre menneskelige referanse gener på samme skala.

Uttrykk for Chit1 og AMCase i Normal menneskelig vev

Å studere in vivo
regulering av ekspresjon av humane Chit1 og AMCase-genene, ble total RNA fra forskjellige normale humane vev analysert ved hjelp av en kvantitativ real-time PCR-analyse med spesielt utformet standard DNA (figur 1). De resulterende verdier ble uttrykt som molekyler pr 10 ng av total RNA i y-aksen (figur 2 og figur 3).

Både Chit1 og AMCase mRNA ble allment uttrykt i normale humane vev (Figur 2A og 2B). De høyeste nivåene av Chit1 mRNA ble påvist i human lunge, etterfulgt av milt, føtal lever og thymus (figur 2A). De høyeste nivåene av AMCase mRNA ble påvist i lunge, etterfulgt av fosterets hjerne, lever, skjoldbruskkjertelen og hjerte (figur 2B). Selv om AMCase mRNA ble uttrykt ved usedvanlig høye nivåer i mus magen [17], dens ekspresjon nivå i magesekken hos mennesket var mye lavere enn de i lunge, føtal hjerne, føtal lever, skjoldbruskkjertel og hjerte (figur 2B). I andre vev, ble både Chit1 og AMCase mRNA uttrykt ved lave, men lett detekterbare nivåer over bakgrunnen (figur 2A og figur 2B).

Sammenlignet med AMCase mRNA-nivåer, Chit1 mRNA ble uttrykt ved relativt høyere nivå i milt og fosterets lever. I motsetning til fosterets hjerne, prostata og lever uttrykt et høyere beløp av AMCase mRNA enn Chit1 mRNA (figur 2).

Analyse av Expression Nivåer av Chit1, AMCase, GAPDH, β-aktin og pepsinogen C mRNA i normal human lunge og mage Vev

Fordi mange studier på patofysiologien av pattedyr kitinaser er blitt utført ved hjelp av lunge og mage [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], sammenlignet vi uttrykket nivåer av kitinaser og referanse genene i disse to humane vev. De kvantitative data er vist i figur 3. normalisere Chit1 nivå til 1,0, de relative ekspresjonsnivåer av AMCase, GADPH, og p-aktin mRNA i humant lungevev var 0,8, 39 og 343, henholdsvis (figur 3A). GAPDH og p-aktin-genene er velkjente husholdningsgener, og er konstitutivt uttrykt i høye nivåer i de fleste vev [18]. Våre resultater tyder på at Chit1 og AMCase mRNA er uttrykt på tilsvarende nivå i normalt humant lungevev, selv om det Chit1 ekspresjonsnivået var mye lavere enn for de to husholdningsgener (sammenligne ikke-log plott med log plott i figur 3).

å normalisere Chit1 nivå til 1,0, de relative ekspresjonsnivåer av AMCase, GAPDH, β-actin og pepsinogen C i normalt humant vev magesekken var 1.5, 323, 1736 og 3962, henholdsvis (figur 3B). Her betyr uttrykket nivåer av både Chit1 og AMCase var mye lavere enn de av GAPDH og β-aktin. Selv pepsinogen C mRNA ble sterkt uttrykt i den menneskelige mageprøver, AMCase mRNA var sammenlign Chit1. Disse resultatene indikerer at de Chit1 og AMCase uttrykk nivåer er relativt lav i menneskelig vev undersøkt og at AMCase uttrykket nivå i magen varierer sterkt mellom menneske og mus.

Etablering og validering av en Kvantifisering System for menneskelig og mus Chitinase mRNA ved hjelp av en human-mus hybrid DNA

neste søkt å sammenligne uttrykket nivåer av de to kitinaser mellom mennesker og mus på samme skala ved hjelp av en real-time PCR system (figur 4A). Vi konstruerte derfor en human-muse hybrid standard DNA for real-time PCR ved ligering av de humane og muse standard mal-DNA (figur 4B). Det resulterende 2305-nukleotid lange templat-DNA inneholdt ti cDNA-fragmenter som dekket PCR målområdet og 9-143 baser av de flankerende regioner av de humane og musegener (se detaljer i fig S4).

validations av standardkurven og den kvantitative real-time PCR system ble utført som vist på fig S5, S6 og Figur Figur S7. Serielle fortynninger av det humane-muse hybrid standard-DNA ble brukt til å konstruere en standardkurve. Hvert standardkurve ble generert ved bruk av 10-gangers seriefortynninger av standard DNA og de fem forskjellige primer-par (fig S5a-E, rød lukkede sirkler). Ved å bruke standard templat-DNA inneholdende de fem cDNA-fragmenter, kan like mengder tilordnes til alle de fem humane gener ved hjelp av human-spesifikke primer-par i hver fortynning som ble brukt for å konstruere standardkurver (fig S5a-E, red lukkede sirkler ). På samme måte kan like mengder tildeles til alle de fem muse genene (Figur S6a-E, lilla lukkede trekanter).

For å teste likestilling av kurvene, en kjent konsentrasjon av hele kodings cDNA ble forsterket og deretter analysert som en ukjent prøve. Like mengder av de humane Hele de kodende cDNA ble observert for hver testet fortynning; Disse mengder ble deretter anvendt for å konstruere standardkurven (figur S5a-E, lukket blå rhombuses). Tilsvarende like mengder muse hele kodende cDNA ble også observert (figur S6a-E, grønne kors). Kvantifisering av lav overflod utskrifter og rikelig transkripsjoner tillater oss å validere følsomhet og pålitelighet real-time PCR, noe som indikerer at vår real-time PCR metoden gir et stort dynamisk område på kvantifisering, høy nøyaktighet og høy følsomhet (Figur S5A- E og figur 6A-E).

Videre er de fire linjer (to standardkurver og to fortynningstrinn kurver av kjente konsentrasjoner av de humane og muse hele de kodende cDNA, henholdsvis) overlappes (fig S7A-E). Dermed gir vår real-time PCR-metoden pålitelige relative verdier for de fire kitinase gener og de seks referanse gener (figur 4B).

Sammenligning av Chit1 og AMCase mRNA nivåer mellom Normal menneske og mus Vev

Vi brukte Humant Total RNA Master Panel II og mus Total RNA Master panelet (Clontech Laboratories) som kilder for total RNA for denne studien. Det er fire vev (lunge, lever, milt og nyre) som overlappet mellom de humane og muse paneler og relatert til astma og Gauchers sykdom. Siden det var fremtredende forskjeller i kitinase uttrykk i magen vev, vi har også sett på nivåene av uttrykket av disse kitinaser i andre fordøyelsesorganer, spyttkjertel, mage, små og store tarmen mellom menneske og mus. Vi kvantifisert og sammen uttrykket nivåer i disse vevene ved hjelp av humane-muse hybrid standard-DNA (figur 4B); de kvantitative data er vist i figur 5.

Vi fant det høyeste ekspresjonsnivået av Chit1 mRNA i mus (men ikke human) mage, etterfulgt av humane lungevevet. Totalt sett Chit en mRNA ble uttrykt ved høyere nivåer i menneskelig vev enn i mus vev unntatt magen (figur 5A). Det høyeste nivået av ekspresjon AMCase mRNA var i mus magen, etterfulgt av mus spyttkjertel. I de andre humane og musevev, de AMCase mRNA-nivåene var lave i humant vev (Figur 5B). Begge Chit1 og AMCase mRNA nivåer i små og store tarmen var svært lav i både menneskelige og mus vev (figur 5), som var i samsvar med tidligere data innhentet ved Northern blotting [6], [21].

funnet at AMCase mRNA ble uttrykt ved lave nivåer i normale humane mage, men ble sterkt uttrykt i mus mage vev (Figur 5B). Således vi også sammenlignet uttrykket nivåer av kitinaser og referansegener ved hjelp av cDNA som ble fremstilt fra lunge- og magevevet.

å normalisere det menneskelige Chit1 nivå i lungevevet til 1,0, de relative ekspresjonsnivåer av musen Chit1, human og mus AMCase AMCase mRNA var 0,3, 0,3 og 7, henholdsvis (figur 6A). Murine AMCase ble sterkt uttrykt i mus lunge. Nivået av Chit1 mRNA i human lunge var omtrent 3 ganger høyere enn i mus lunge. De Chit1 og AMCase mRNA-nivåene var signifikant lavere enn uttrykket nivåer av GAPDH og p-aktin-genene (figur 6A).

Normalisering det menneskelige Chit1 nivå i mage to1.0, de relative ekspresjonsnivåer av mus Chit1, den menneskelige AMCase og mus AMCase mRNA var henholdsvis 10, 0,7 og 1978 (figur 6B). Pepsinogen C er en vesentlig digestive enzym i magen. Ekspresjonsnivået av AMCase i mus som var mye høyere enn de til GAPDH og β-aktin og var sammenlignbare med nivået av pepsinogen C, mens den humane mage oppviste et meget lavt nivå av AMCase mRNA-ekspresjon. De relative uttrykk nivåer av mRNA i human og mus mage var 1,0 og 2826, respektivt.

For å kunne kontrollere om mRNA nivåforskjeller mellom mus og menneske ble reflektert på proteinnivået, analyserte vi neste enzymatisk aktivitet av disse kitinaser i magen vev. Vi først analysert AMCase aktivitet i mus og menneskelige magen vev. Musen AMCase viser en dobbelt pH-optimum med en større optimal rundt pH 2 og en sekundær optimal rundt pH 5 [6], mens human AMCase viser bred optimal pH-verdi ved pH 2~pH 5 [16], [24]. Således har vi målt kitinolytiske aktivitet ved pH 2,0 og pH 5,0 ved bruk av det syntetiske substrat 4-metylumbelliferyl β-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-kitobiose) [6], [21]. Vi oppdaget robust kitinolytiske aktivitet i mus mage-ekstrakt ved pH 2,0 og sterk aktivitet ved pH 5,0. I motsetning til dette ble ingen aktivitet påvist i humant ved pH 2,0 og meget lav aktivitet ble observert ved pH 5,0 (figur 7A, til venstre).

standard Chit1 enzymatiske analyse er blitt utført ved bruk av 4-metylumbelliferyl β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-kitotriosen) ved pH 5,2 [6], [10], [21], [25]. For å overvåke effekten av AMCase på Chit1 aktivitet, analyserte vi chitinase aktivitet ved hjelp 4MU-kitotriosen ved pH 2,0. Forholdsvis sterk chitinase-aktivitet mot 4MU-kitotriosen ble detektert i mus magen ekstrakt ved pH 2,0 (figur 7A til høyre), og vi har oppdaget også svak chitinase-aktivitet ved pH 5,2 (figur 7A til høyre). Siden AMCase har en andre optimal rundt pH 5 Disse resultatene indikerte at det meste av kitinolytiske aktivitet ved pH 5,2 kan skyldes AMCase snarere enn Chit1 og at mus AMCase kunne hydrolyserer 4MU-kitotriosen som substrat ved pH 2,0. Tatt sammen, de fleste av chitinase-aktivitet i mus magen resulterte fra AMCase aktivitet. I menneskelige magen ekstrakt vi også observert svært svake, men påvisbare nivåer av kitinolytiske aktivitet ved pH 2,0 og pH 5,2 (Figur 7A, høyre, nedre panel). Chitinase-aktivitet ved pH 5,2 var sammenlignbar med den ved pH 2,0, noe som indikerer Chit1 ekspresjon i humane mage.

Til slutt, analyserte vi de nivåer av protein-ekspresjon ved Western blotting ved å bruke antistoffer mot AMCase. De anti-AMCase antistoffer ble samlet mot den tidligere rapporterte mus peptidet [14] og human motstykke. Anti-mus AMCase antistoff anerkjent en robust enkelt protein bandet i utdrag fra mus magen, men ikke fra menneske (figur 7B, venstre). Tilsvarende anti-human AMCase antistoff også anerkjent en eneste band i mus ekstrakt (figur 7B, høyre). I menneske ekstrakt var det svake bånd av litt høyere molekylvekt som ble anerkjent av både menneskelige og mus antistoffer (figur 7B). Siden det ikke var noen signifikant chitinase-aktivitet ved enten pH 2,0 eller pH 5,0 overvåket ved hjelp av 4MU-kitobiose i human mage ekstrakt, kan disse båndene ikke være knyttet til den menneskelige AMCase. Derfor kitinolytiske aktiviteter og de relative protein uttrykk nivåer mellom mus og menneskelige magen vev var i samsvar med data våre innhentet på mRNA-nivå.

Diskusjon

Tidligere studier på in vivo
regulering av Chit1 og AMCase i human og mus ble utført ved anvendelse av northern blotting, semi-kvantitativ PCR og real-time PCR [6], [8], [9], [13], [14], [22] [23]. Selv om disse fremgangsmåter har flere fordeler i forhold til undersøkelse av genuttrykksmønster, de ikke klarte å sammenligne nivåene av de forskjellige gentranskriptene i samme målestokk. I denne studien har vi brukt vår metodikk [17] for å undersøke uttrykket nivåer av disse kitinaser i menneskelig vev. Videre, for å evaluere uttrykket nivåer av kitinaser i humane og musevev, har vi utviklet et system kvantifisering ved hjelp av en enkel, human og mus hybrid standard DNA. Vi viste vevs- og artsspesifikke uttrykk for de to pattedyr aktive kitinaser, Chit1 og AMCase. Våre data generelt støtter tidligere studier rapportert av Boot et al [6], [21]. Men vår analyse tilstrekkelig følsom til å påvise mRNA og gir en omfattende undersøkelse av genuttrykk mønstre av kitinaser i mennesker og mus vev på samme skala.

En merkbar karakteristisk uttrykk for pattedyr kitinaser er den konserverte ekspresjon av Chit1 mellom menneske og mus lungevev. Vi fant at Chit1 ble uttrykt ved relativt høye nivåer i humane og muselungevevet som var nesten sammenlignbare med hverandre, noe som indikerer at ekspresjon nivået av Chit1 mRNA er bevart. I lungene, kan Chit1 fungere som en del av vertens forsvar som beskytter mot chitin-inneholdende patogener, slik som sopp og midd [25]. Bevaring av Chit1 genekspresjon hos mennesker og mus tyder den fysiologiske betydningen av Chit1 i lungen.

ekspresjon av kitinaser i magen er av spesiell interesse. AMCase mRNA syntetisert ved usedvanlig høye nivåer i mus magesekken, men ikke i magesekken hos mennesket (figur 6B). Sammenligningen av disse ekspresjonsnivåer viste at AMCase mRNA-nivå i magesekken hos mennesket var omtrent 1 /2.800 av det i muse motstykke. Vi har bekreftet at uttrykket nivåer av pepsinogen C mRNA og de to husholdningsgener var meget høy i human og mus mage vev (figur 6B). Således er det redusert ekspresjonsnivået av AMCase mRNA i magesekken hos mennesket ikke på grunn av RNA-degradering i løpet av cDNA-preparat. Videre har vi funnet at mus mage uttrykt stor mengde AMCase, mens det humane motstykke ikke (figur 7). Disse resultatene indikerer at ekspresjonsnivået av AMCase i magevevet skiller seg vesentlig mellom mennesker og mus.

magen er et viktig organ som spiller grunnleggende rolle i fordøyelsen av mat og beskyttelse mot skadelige organismer. Saltsyre utskilles i magen, noe som skaper sure betingelser (pH = ~ 2) som passer for fordøyelse av proteiner med pepsin [19], [26]. Murine AMCase viser dyp syre stabilitet og er mest aktive ved rundt pH 2 [6]. Musen mage frembringer en enorm mengde AMCase mRNA [17] og dens translasjonsprodukt (figur 7). Følgelig kan AMCase fungere som en digestive enzym som bryter ned chitin-inneholdende mat i magen mus.

I motsetning til dette, var relativt lav i magesekken hos mennesket (figur 5 ekspresjonsnivået av AMCase mRNA og dets produkt, Figur 6 og figur 7). Dette er ikke uventet fordi moderne mennesker ikke spiser en betydelig mengde kitin inneholder matvarer. Disse resultatene antyder at AMCase ikke kan spille en rolle i forsvaret mot chitin-inneholdende organismer i magesekken hos mennesket. Mange magen sykdommer er assosiert med infeksjon med eksogene organismer. Alvorlighetsgraden av gastritt assosierte infeksjoner som Helicobacter pylori
kan korrelere med aktiviteten av endogene enzymer [23]. Det gjenstår derfor en del debatt om det lave nivået av AMCase i den menneskelige magen deltar i responsen på mage lidelser.

Et høyt nivå av kitinolytiske aktiviteter har blitt påvist i ekstrakter av mus mage og tarm [6] . Siden det er fremtredende forskjeller i nivåene av kitinase uttrykk i magen mellom menneske og mus, vi undersøkte nivåer av uttrykk av disse kitinaser i andre fordøyelsesorganer, blant annet spyttkjertel og små og store tarmen. Våre resultater tyder på at både Chit1 og AMCase mRNA-nivåer i tynn- og tykktarmen var svært lave i både humane og muse vev, selv om mus spyttkjertel og mage produserte høye nivåer av begge kitinaser mRNA (figur 5). Disse resultatene tyder på at pattedyr kitinase proteiner i mus tarmen er sannsynligvis avledet fra de øvre deler av mage-tarmkanalen, slik som spyttkjertel og magesekken, noe som er konsistent med den kjente tanken ved Boot et al [6], [21].

uttrykket nivåer av Chit1 genet i lunge vev er konservert mellom mennesker og mus. I motsetning til ekspresjonen nivået av AMCase i magevevet er artsspesifikke. Resultatene tyder på at reguleringen av ekspresjonen av mRNA Chiti1 i lungen er bevart under evolusjonen, mens den reduserte ekspresjon av AMCase i magesekken hos mennesket kan være et resultat av genet demping. Undersøkelsen av reguleringen av uttrykket av disse pattedyr kitinaser kunne gi innsikt i patofysiologiske rollene til disse enzymene. En detaljert karakterisering av promotorområdene av Chit1 og AMCase gener og identifisering av cis
- og trans
-acting faktorer vil være nødvendig for forståelsen av selektiv genuttrykk av disse kitinaser hos mennesker og mus.

uttrykk for Chit1 og AMCase mRNA induseres under ulike patologiske tilstander. Ved hjelp av den kvantitative system er beskrevet her, vil vi være i stand til å sammenligne kitinase mRNA nivåer over mennesker og mus vev ved real-time PCR. Denne analysen vil hjelpe forståelsen av den biologiske funksjonen til disse kitinaser, spesielt i de patofysiologiske studier av human sykdom ved bruk av murine modeller. Vår metode er anvendelig til kvantifisering av mRNAer av multiple gener mellom menneske og mus prøver i overensstemmelse med den samme skala. En praktisk bruk av denne sammenlignende tverr arter genuttrykk data er sammenligningen av menneskelige sykdommer med mus og cellekultur modeller.

Materialer og metoder

RNA og cDNA Forberedelse

The human Total RNA Master Panel II og mus Total RNA Master Panel (Clontech Laboratories) ble brukt for å undersøke fordelingen av vitnemål i ulike vev. Menneskelig tynntarmen Total RNA ble kjøpt fra Clontech Laboratories. I tillegg ble RNA isolert fra spyttkjertel og små og store tarmen av tre måneder gamle hannmus. C57BL /6J mus (CLEAR Japan) ble avlet ved Riken Brain Science Institute Animal Facility. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjer. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Riken Brain Science Institute (Godkjenning nr H19-2B013). Alle operasjoner ble utført ved hjelp av dietyleter som en bedøvelse, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Vev for mRNA forberedelse ble gitt av legene. Miyazaki og Nukina ved Riken Brain Science Institute. Total RNA ble fremstilt fra spyttkjertel og små og store tarmen ved hjelp TRIzol Reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Vi analyserte 21 ulike menneskelige vev og åtte voksne mus vev. For å fjerne spormengder av kontaminerende genomisk DNA, ble totalt RNA prøver behandlet med RQ1 RNase-fritt DNase (Promega) i henhold til produsentens anbefalinger. Hver av de totale RNA prøver ble utsatt for revers transkripsjon ved hjelp av tilfeldige heksamer som primere, som rapportert tidligere [17].

Real-time PCR

Etablering og validering av real-time PCR system for humane vev ble utført som beskrevet [17]; det eneste unntaket var bruken av menneskelige primere. Nukleotid-sekvensene av primerne som ble valgt for real-time PCR for det menneskelige system er vist i tabell S1. Hver prøve ble forsterket i tre eksemplarer, og hver Forsøket ble gjentatt minst to ganger.

Bygging av Human Standard DNA og klargjøring av fem menneske cDNA dekker hele Coding omegn

Byggingen av standard templat DNA for de humane gener og fremstillingen av de fem humane cDNA som omfattet hele den kodende regionen ble utført i det vesentlige som beskrevet [17]; det eneste unntaket var bruken av menneskelige primere. De forover og revers primere er oppført i tabell S2. PCR-produktene ble spaltet med passende restriksjonsenzymer og ligeres ved å bruke T4 DNA-ligase. De ligerte fragmenter ble amplifisert ved hjelp av forover primer 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'og reversprimeren 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' og klonet inn i pGEM-T Easy vektor (Promega). De verifiserte sekvenser av cDNA er vist i figur S2.

• PLoS ONE: Mage Temperatur Records Avslør Nursing Atferd og overgang til Solid matforbruket i en Unweaned Mammal, Harbour Seal Pup (Phoca vitulina)
• PLoS ONE: Serum Apolipoproteiner C-I og C-III er redusert i magen kreftpasienter: Resultater fra MALDI-Based Peptidome og Immuno-Based Clinical Analyser