PLoS ONE: kvantifiointi kitinaasiaktiivisuuden mRNA tasot ihmisen ja hiiren kudokset Real-Time PCR: lajikohtaiset ilmentäminen Happamia Nisäkkäiden kitinaasiaktiivisuuden vatsassa Tissues

tiivistelmä

kitinaasiaktiivisuuden hydrolysoituu kitiini, joka on N
-asetyyli-D-glukosamiini polymeeri, joka on läsnä erilaisia ​​organismeja, mukaan lukien hyönteiset, loiset ja sienet. Vaikka nisäkkäät eivät sisällä endogeenisen kitiini, ihmisillä ja hiirillä ilmaista kaksi aktiivista kitinaaseja, chitotriosidase (Chit1) ja happamien nisäkkäiden kitinaasiaktiivisuuden (AMCase). Koska ilmentymisen taso näiden kitinaaseja on lisääntynyt monissa tulehdustilojen, mukaan lukien Gaucherin taudin ja hiiren malleja astman, sekä kitinaaseja voi olla tärkeä rooleja patofysiologioiden näiden ja muita sairauksia. Olemme hiljattain perustanut kvantitatiivinen PCR, jossa käytetään yhtä standardia DNA ja osoitti, että AMCase mRNA syntetisoitiin erittäin korkealla tasolla hiiren vatsassa kudoksissa. Tässä tutkimuksessa käytimme tätä menetelmää kvantifiointia kitinaasiaktiivisuuden mRNA: iden ihmisen kudoksissa ja totesi, että molemmat kitinaasiaktiivisuuden mRNA: t olivat laajalti ilmentyy normaaleissa ihmisen kudoksissa. Chit1 mRNA ilmentyy voimakkaasti ihmisen keuhkoissa, kun taas AMCase mRNA: ta ei ole yli-ilmentyy normaaleissa ihmisen mahan kudoksissa. Määriä Näiden mRNA: iden ihmisen kudoksissa olivat huomattavasti alhaisemmat kuin taloudenhoito geenejä. Koska AMCase ekspressiotasot olivat aivan erilaisia ​​ihmisen ja hiiren mahan kudoksissa, kehitimme kvantitatiivinen PCR järjestelmä vertailla mRNA-tasoja ihmisen ja hiiren kudoksissa käyttäen ihmisen ja hiiren hybridi standardia DNA. Meidän analyysi osoitti, että Chit1 mRNA ilmentyy samalla tasolla normaaleissa ihmisen ja hiiren keuhkoissa. Sen sijaan AMCase ilmentymistaso ihmisen vatsa oli merkitsevästi pienempi kuin ekspressiotaso havaittiin hiiren vatsassa. Nämä mRNA-erot ihmisen ja hiiren vatsan kudokset heijastavat eroja kitiiniä toimet ja proteiinin ilmentymisen. Siten ilmentymistason AMCase mahassa on lajispesifinen.

Citation: Ohno M, Togashi Y, Tsuda K, Okawa K, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) kvantifiointi kitinaasiaktiivisuuden mRNA tasot ihmisen ja hiiren kudokset Real-Time PCR: lajikohtaiset ilmentäminen Happamia Nisäkkäiden kitinaasiaktiivisuuden vatsassa kudoksia. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10,1371 /journal.pone.0067399

Editor: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 tammikuu 2013; Hyväksytty: 15 toukokuu 2013; Julkaistu: 27 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Ohno et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat projektin Research Grant päässä Research Institute of Science and Technology, Kogakuin yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kitiini, joka on polymeeri, N
-asetyyli-D-glukosamiini, on toiseksi yleisin polysakkaridi luonnossa [1]. Se on olennainen osa exoskeletons äyriäisten ja hyönteiset, The microfilarial vaipat sukkulamatoja ja sienten soluseinien [1], [2].

kitinaaseja ovat entsyymejä, jotka sulattaa kitiini polymeeri. Vaikka nisäkkäät eivät tuota kitiini, ihmisillä ja hiirillä on kaksi geeniä, jotka koodaavat aktiivista kitinaaseja, chitotriosidase (Chit1) ja happamien nisäkkään kitinaasi (AMCase) [2], [3]. Chit1 oli ensimmäinen nisäkkään kitinaasia voidaan puhdistaa ja kloonata [4], [5]. AMCase, joka on toiseksi aktiivisin kitinaasiaktiivisuuden nisäkkäillä, tunnistettiin korvaavia entsyymi Chit1 ja nimetty sen optimaalinen aktiivisuus happamissa olosuhteissa [6].

Molemmat entsyymeillä sekvenssihomologia bakteerien kitinaaseja ja kuuluvat perheen 18 glykosyylihydrolaasien, joka sisältää myös kitinaasi kaltaisia ​​proteiineja, jotka ovat rakenteellisesti sukua kitinaasit, mutta ei ole kitiiniä aktiivisuus [2], [3]. Hiiren AMCase osoittaa sekvenssihomologia Chit1, joiden identiteetti on 52% ja samanlaisuus oli 60% [6]. Lokukseen ihmisen Chit1 geeni löytyy kromosomissa 1q32 [7], kun taas ihmisen AMCase geeni sijaitsee kromosomissa 1p13 [6]. Molemmat geenit koostuvat 12 eksonia ja koodata eri liitos isoformien [6] - [9]. Sekvenssihomologia ja säilyttämiseen introni-eksoni väliset rajat Chit1 ja AMCase geenit viittaavat siihen, että nämä geenit syntyi päällekkäisyyteen esi-geenin [3], [6].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet assosiaatioita ilmentymisen nisäkkään kitinaaseja ja tulehdustiloja. Esimerkiksi, tasot Chit1 ovat kohonneet plasman potilailla, joilla on Gaucherin tauti, bronkoalveolaarisen huuhtelunesteen tupakoitsijoita ja potilailla, joilla on krooninen keuhkoahtaumatauti (COPD) ja aivo-selkäydinnesteessä potilailla, joilla on Alzheimerin tauti [9] - [12] . AMCase ilme ja toiminta ovat myös upregulated aikana allergisia hengitystiereaktioita hiirimalleissa astman [13]. Polymeeriset kitiini indusoi AMCase ilmaisun ja immuunisolujen, jotka liittyvät allergia ja astma [14]. Lisäksi useat geneettisiä variantteja AMCase liittyvät astma ihmisillä [15], [16]. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että kitiiniä entsyymit tärkeä rooli vastauksessa tauti. Kuitenkin niiden patofysiologisia toiminnot pysyvät huonosti.

kvantifiointi Chit1 ja AMCase mRNA-tasot on tärkeä askel kohti ymmärrystä in vivo
sääntelyn kitinaaseja nisäkkäillä. Olemme hiljattain perustanut kvantitatiivinen PCR, jossa käytetään yhtä standardia DNA määrällisesti ja verrata ilmentymisen tasot kitinaasia ja viite geenit samassa mittakaavassa [17]. Aiemmissa osoitimme, että AMCase on suuri kopio hiiren vatsassa ja ilmaistaan ​​tasoilla, jotka ovat verrattavissa pepsinogeeni C [17].

Täällä haimme meidän menetelmää kvantifiointia mRNA-tasot nisäkkäiden kitinaaseja normaaleissa ihmisen kudoksissa, mikä on edellytys ymmärtää patologisten roolit sairaissa kudoksissa. Lisäksi olemme perustaneet määrällinen järjestelmä verrata mRNA-tasoja useiden geenien välillä useiden ihmisen ja hiiren kudoksissa käyttäen ihmisen ja hiiren hybridi standardia DNA. Tutkimuksemme kvantitatiivisesti osoittaa, että Chit1 mRNA ekspressoituu samalla tasoina normaaleissa ihmisen ja hiiren keuhkoissa. Sen sijaan AMCase on pääasiassa yli-ilmennetään hiiren, mutta ei ihmisen mahaan.

Tulokset

perustaminen ja validointi Real-time PCR System havaitseminen kitinaaseja ihmisen kudoksissa

Olemme aiemmin perustettu reaaliaikainen PCR-järjestelmä, joka pystyy määrittämään mRNA: n tasoja kahden nisäkkään kitinaaseja hiiren kudoksissa ja vertaamalla näitä tasoja kuin viite geenien samalla asteikolla [17]. Tässä tutkimuksessa, halusimme verrata geenin ilmentymisen tasot Chit1 ja AMCase geenien yli normaalin ihmisen kudoksissa (kuvio 1A). Kuten hiiren kudoksissa [17], käytettiin housekeeping-geenejä glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ja β-aktiini viitteenä geenejä, koska ne ovat konstitutiivisesti suurina määrinä useimmissa soluissa [18]. Lisäksi, päätimme pepsinogeeni C (tunnetaan myös nimellä progastricsin), kuten viite-geenin mahassa, koska taso AMCase mRNA: n hiiren vatsa oli verrattavissa mRNA-tasolla pepsinogeeni C, joka on merkittävä osa mahalaukun limakalvon [ ,,,0],19]. Käyttämällä näitä kolmea viittaus geeneistä, arvioimme geenin ilmentymisen tasoa Chit1 ja AMCase normaaleissa ihmisen kudoksissa (kuvio 1A).

Olemme suunnitelleet useita eri alukkeiden kvantitatiivinen PCR ja arvioitiin niiden soveltuvuutta sen mukaan, onko ne ilmensivät yksi sulamislämpötila (Tm) ja yhden juovan 10% polyakryyliamidigeelillä [17]. Kuten kuviossa S1A-E, dissosiaatio käyrät viiden cDNA esiintyy vain yksi huippu kutakin. Geelielektroforeesi osoitti selvästi single bändejä odotetun koot Chit1 (55 emäsparia), AMCase (62 emäsparia), GAPDH (57 emäsparia), β-aktiini (57 emäsparia) ja pepsinogeeni C (61 bp) (kuvio S1F). Niinpä vahvisti, että oikean PCR-tuotteet amplifioitiin ihmisen cDNA-seosta.

seuraavan rakennettu standardin templaatti-DNA reaaliaikainen PCR-ligoimalla viiden tavoite fragmenttien yksi-yhteen-suhde (kuvio 1 B ja kuviossa S2). 1396-nukleotidin mittainen Oletustyylitaulukon DNA koostui viidestä cDNA-fragmentteja, jotka kattoivat PCR kohdealueen ja 60-143 emästä reunustavat alueet ja sisälsi Bgl
II, Sal
I, Xho
I ja Ei
I restriktiokohdat (kuvio 1 B ja kuviossa S2).

kvantifiointi sekä kitinaaseja ja viittaus mRNA: t nojaa standardin käyriä. Käytimme Standardikäyrien vertailla ja arvioida reaaliaikainen PCR kvantifioinnin strategioita. Kukin Standardikäyrä muodostettiin käyttäen 10-kertainen laimennussarja ihmisen standardin DNA ja viisi erilaista alukeparia (kuvio S3A-E, punainen suljetut ympyrät). Käyttämällä Oletustyylitaulukon DNA, joka sisältää viisi ihmisen cDNA-fragmentit, yhtä suuret määrät voidaan määrittää kaikki viisi geeniä jokaiseen laimennettuna rakentaa standardin käyriä (kuva S3A-E, punainen umpinaiset ympyrät).

Voit testata tasa käyrien, on tunnettu pitoisuus ihmisen koko koodaava cDNA monistettiin ja sitten analysoidaan tuntematon näyte. Tämä määritys suoritettiin sen varmistamiseksi, että jokainen testattu laimennus johti odotettu määrä. Kuten kuviossa S3A-E, sininen suljettu rhombuses, yhtä suuret määrät havaittiin kutakin testattua laimennus; näitä oli käytetty standardikäyrä.

Kun määritellään matalan runsaus selostukset ja runsas selostukset voimme vahvistaa herkkyys ja luotettavuus reaaliaikaisen PCR, mikä osoittaa, että meidän reaaliaikainen PCR-menetelmällä on suuri dynamiikan kvantifiointiin, korkea tarkkuus ja suuri herkkyys (kuva S3A-E). Siten meidän reaaliaikainen PCR menetelmä antaa luotettavia arvoja kahden ihmisen kitinaasia geenejä ja kolme ihmisen viittaus geenit samassa mittakaavassa.

ilmentäminen Chit1 ja AMCase Normal Ihmiskudokset

tutkia in vivo
ekspression säätelyn ihmisen Chit1 ja AMCase geenit, kokonais-RNA eri normaalista ihmisen kudoksissa analysoitiin käyttämällä kvantitatiivista tosiaikaista PCR-määritystä kanssa erityisesti suunniteltu standardi DNA (kuvio 1). Saatu arvot ilmaistaan ​​molekyylejä, per 10 ng kokonais-RNA: ta y-akselilla (kuvio 2 ja kuvio 3).

Sekä Chit1 ja AMCase mRNA: t ilmennetään laajasti normaaleissa ihmisen kudoksissa (kuvio 2A ja 2B). Korkeimman Chit1 mRNA havaittiin ihmisen keuhkoissa, jonka jälkeen perna, sikiön maksan ja kateenkorvan (kuvio 2A). Korkeimman AMCase mRNA havaittiin keuhkoissa, jonka jälkeen sikiön aivojen, maksan, kilpirauhasen ja sydämen (kuvio 2B). Vaikka AMCase mRNA ilmentyi erittäin korkealla tasolla hiiren vatsassa [17], sen ilmentymistaso ihmisen vatsa oli paljon pienempi kuin keuhko-, sikiön aivot, sikiön maksassa, kilpirauhanen ja sydämen (kuvio 2B). Muissa kudoksissa, sekä Chit1 ja AMCase mRNA: t ilmaistiin alhaisilla, mutta helposti havaittavissa taustan yläpuolella (kuvio 2A ja kuvio 2B).

Kun verrataan AMCase mRNA, Chit1 mRNA ilmentyi suhteellisesti korkeammalla tasolla pernassa ja sikiön maksassa. Sen sijaan, sikiön aivojen, eturauhasen ja maksan ilmaisi suuremman määrän AMCase mRNA kuin Chit1 mRNA: ta (kuvio 2).

Analyysi Expression tasot Chit1, AMCase, GAPDH, β-aktiini ja pepsinogeeni C mRNA normaali Human Lung ja Maha kudokset

Koska monet tutkimukset patofysiologian nisäkkäiden kitinaaseja on suoritettu käyttämällä keuhkojen ja vatsa [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], vertasimme ilmentymistasojen kitinaaseja ja viite geenien näiden kahden ihmisen kudoksissa. Määrälliset tulokset on esitetty kuviossa 3. normalisointi Chit1 tasolla 1,0, suhteellinen ekspressiotasot AMCase, GADPH, ja β-aktiini-mRNA: t ihmisen keuhkokudoksen olivat 0,8, 39 ja 343, vastaavasti (kuvio 3A). GAPDH ja β-aktiini-geenit ovat hyvin tunnettuja siivous geenit ja konstitutiivisesti korkeilla tasoilla useimmissa kudoksissa [18]. Tuloksemme osoittavat, että Chit1 ja AMCase mRNA: t ilmentyvät samalla tasolla normaaleissa ihmisen keuhkokudoksessa, vaikka Chit1 ilmentymistaso oli paljon pienempi kuin kaksi taloudenhoito geenejä (vertaa ei-käyrästä log tontti kuvassa 3).

normalisointi Chit1 tasolla 1,0, suhteellisen ilmentymisen tasot AMCase, GAPDH, β-aktiini ja pepsinogeeni C normaaleissa ihmisen mahalaukun kudosta oli 1,5, 323, 1736 ja 3962, vastaavasti (kuvio 3B). Tässä ilmauksen tasot sekä Chit1 ja AMCase oli paljon alhaisempi kuin GAPDH ja β-aktiini. Vaikka pepsinogeeni C-mRNA ilmentyy voimakkaasti ihmisen mahalaukussa näytteet, AMCase mRNA oli verrattavissa Chit1. Nämä tulokset osoittavat, että Chit1 ja AMCase ekspressiotasot ovat suhteellisen alhaiset ihmiskudosten tarkastellaan ja että AMCase ilmentymistaso vatsassa eroaa merkittävästi ihmisen ja hiiren välillä.

perustaminen ja validointi määrällinen System for Human ja hiiren kitinaasia mRNA: iden käyttäminen Human-hiiri-hybridi-DNA-

vieressä vertasi ekspressiotasoja kahden kitinaaseja ihmisen ja hiiriä samassa mittakaavassa käyttäen reaaliaikaista PCR-järjestelmän (kuvio 4A). Siksi rakennettu ihmisen ja hiiren hybridi standardia DNA reaaliaikaista PCR ligoimalla ihmisen ja hiiren Oletustyylitaulukon DNA: ita (kuvio 4B). Tuloksena 2305-nukleotidin mittainen templaatti-DNA sisälsi kymmenen cDNA-fragmentteja, jotka kattoivat PCR kohdealueen ja 9-143 emästä reunustavat alueet ihmisen ja hiiren geeneistä (katso yksityiskohdat kuviosta S4).

Validoinnit standardikäyrän ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR järjestelmä suoritettiin, kuten on esitetty kuviossa S5, Kuva S6 ja Kuva S7. Sarjalaimennoksia ihmisen ja hiiren hybridi standardi DNA: ta käytettiin konstruoimaan standardikäyrän. Kukin Standardikäyrä muodostettiin käyttäen 10-kertainen laimennussarja standardin DNA ja viisi erilaista alukeparia (kuvio S5a-E, punainen umpinaiset ympyrät). Käyttämällä standardin templaatti-DNA, joka sisältää viisi cDNA-fragmentit, yhtä suuret määrät voidaan määrittää kaikkien viiden ihmisen geenien käyttämällä ihmisen spesifistä aluketta parit kutakin laimennosta, jota käytettiin rakentaa standardin käyrät (kuvio S5a-E, punainen umpinaiset ympyrät ). Vastaavasti yhtä suuret määrät voidaan määrittää kaikkien viiden hiiren geeneistä (kuvio S6A-E, violetti suljetut kolmiot).

testaamiseksi tasa käyrien, tunnettu pitoisuus koko koodaava cDNA monistettiin ja myöhemmin analysoidaan tuntematon näyte. Yhtä suuret määrät ihmisen koko koodaava cDNA havaittiin kutakin testattua laimennus; nämä määrät on sitten käytetään muodostamaan standardikäyrä (kuvio S5a-E, sininen suljettu rhombuses). Samoin yhtä suuret määrät hiiren koko koodaava cDNA havaittiin myös (Kuva S6A-E, vihreä ristit). Kvantifiointia alhaisen runsaus selostukset ja runsas selostukset voimme vahvistaa herkkyys ja luotettavuus reaaliaikaisen PCR, mikä osoittaa, että meidän reaaliaikainen PCR-menetelmällä tarjoaa laajan dynamiikan määritysrajan, korkea tarkkuus ja suuri herkkyys (kuva S5A- E ja kuvio 6A-E).

Lisäksi neljä riviä (kaksi tavallista käyrät ja kaksi laimennus käyrät tunnettujen pitoisuuksien ihmisen ja hiiren koko koodaavan cDNA, vastaavasti) päällekkäin (Kuva S7A-E). Siten meidän reaaliaikainen PCR-menetelmällä tarjoaa luotettavan suhteelliset arvot neljälle kitinaasia geenit ja kuuden viite geeneistä (kuvio 4B).

vertailu Chit1 ja AMCase mRNA-tasojen välillä normaalin ihmisen ja hiiren kudokset

Käytimme ihmisen Yhteensä RNA Master Panel II ja hiiri Total RNA Master Panel (Clontech Laboratories) lähteinä kokonais-RNA tätä tutkimusta varten. On neljä kudokset (keuhkot, maksa, perna ja munuaiset), että päällekkäin välillä ihmisen ja hiiren paneelit ja liittyvät astman ja Gaucherin tauti. Koska oli näkyvästi eroja kitinaasiaktiivisuuden ilmentyminen mahassa kudoksissa, me tarkasteltiin myös ekspressiotasot näiden kitinaaseja muissa ruoansulatuskanavan elimissä, sylkirauhasen, vatsa, ohutsuoli, paksusuoli ihmisen ja hiiren välillä. Me määrällisesti ja verrataan ilmaisun näissä kudoksissa käyttämällä ihmisen ja hiiren hybridi standardia DNA (kuva 4B); määrälliset tulokset on esitetty kuviossa 5.

Olemme löytäneet korkeimman ekspressiotason Chit1 mRNA hiiren (mutta ei ihmisen) vatsaan, mitä seurasi ihmisen keuhkojen kudoksiin. Kaiken Chit 1 mRNA ilmentyi korkeammalla tasolla ihmisen kudoksissa kuin hiiren kudoksissa paitsi mahaan (kuvio 5A). Korkein ekspressiotaso AMCase mRNA oli hiiren vatsassa, jonka jälkeen hiiren sylkirauhasesta. Muissa ihmisen ja hiiren kudoksissa AMCase mRNA-tasot olivat matalia ihmisen kudoksissa (kuvio 5B). Sekä Chit1 ja AMCase mRNA tasot pienten ja suurten suolet olivat hyvin pieni sekä ihmisen ja hiiren kudoksissa (kuvio 5), jotka olivat yhdenmukaisia ​​aiempien tietojen saatu blottauksella [6], [21].

havaitsivat, että AMCase mRNA: ta ilmennettiin alhaisilla tasoilla normaaleissa ihmisen mahalaukussa, mutta se ilmentyy suuresti hiiren mahan kudoksissa (kuvio 5B). Näin ollen, myös verrattuna ilmentymisen tasot kitinaaseja ja viite-geenit käyttäen cDNA: t valmistettiin keuhkojen ja mahan kudoksissa.

normalisointi ihmisen Chit1 tasolla keuhkokudoksen 1,0, suhteellinen ekspressiotasot hiiren Chit1, ihmisen AMCase ja hiiren AMCase mRNA: t olivat 0,3, 0,3 ja 7, vastaavasti (kuva 6A). Hiiren AMCase oli ilmentyy suuresti hiiren keuhkoissa. Taso Chit1 mRNA: n ihmisen keuhkoissa oli noin 3-kertainen hiiren keuhkoissa. Chit1 ja AMCase mRNA-tasot olivat merkittävästi alhaisemmat kuin ekspressiotasot GAPDH ja β-aktiini geeneistä (kuvio 6A).

normalisointi ihmisen Chit1 tasolla vatsassa to1.0 suhteellinen ekspressiotasot hiiren Chit1, ihmisen AMCase ja hiiren AMCase mRNA: t olivat 10, 0,7 ja 1978 (kuvio 6B). Pepsinogeeni C on suuri ruoansulatusentsyymien vatsaan. Ilmentymisen taso AMCase hiirillä oli paljon suurempi kuin GAPDH ja β-aktiini ja oli verrattavissa tasoon pepsinogeeni C, kun taas ihmisen mahalaukussa osoitti hyvin vähäistä AMCase mRNA: n ekspression. Suhteellinen ilmentyminen mRNA ihmisen ja hiiren vatsa oli 1,0 ja 2,826, tässä järjestyksessä.

Jotta onko mRNA välisiä tasoeroja hiiren ja ihmisen heijastuivat proteiinitasolla, me seuraavaksi analysoidaan entsyymiaktiivisuus näiden kitinaaseja vatsassa kudoksissa. Ensin analysoidaan AMCase aktiivisuus hiiren ja ihmisen mahan kudoksissa. Hiiri AMCase esittää kaksi pH-optimi, jolla on merkittävä optimi noin pH 2 ja toissijainen optimi noin pH 5 [6], kun taas ihmisen AMCase osoittaa laaja optimaalinen pH pH 2~pH 5 [16], [24]. Näin ollen mittasimme kitiiniä aktiivisuus pH: ssa 2,0 ja pH: ssa 5,0 käyttämällä synteettistä substraattia 4-metyylium- β-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Olemme havainneet vankka kitiiniä aktiivisuus hiiren mahauutteesta pH 2,0 ja voimakas aktiivisuus pH: ssa 5,0. Sitä vastoin mitään aktiivisuutta ei havaittu, että ihmisen pH 2,0 ja erittäin alhainen aktiivisuus havaittiin pH: ssa 5,0 (kuvio 7A, vasen).

standardi Chit1 entsymaattinen määritys on suoritettu käyttäen 4-metyyliumbelliferyyli β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) pH: ssa 5,2 [6], [10], [21], [25]. Voit seurata vaikutuksen AMCase on Chit1 toimintaa, olemme analysoineet kitinaasiaktiivisuuden käyttäen 4MU-chitotriose pH 2,0. Suhteellisen vahva kitinaasiaktiivisuuden vastaan ​​4MU-chitotriose havaittiin hiiren mahauutteesta pH 2,0 (kuvio 7A oikealla), ja meillä on myös havaittu heikkoa kitinaasiaktiivisuuden pH 5,2 (kuvio 7A oikealla). Koska AMCase on toinen optimi noin pH: ssa 5, nämä tulokset osoittivat, että useimmat kitiiniä aktiivisuus pH: ssa 5,2 voi johtua AMCase sijaan Chit1 ja että hiiren AMCase voi hydrolysoida 4MU-chitotriose substraattina pH: ssa 2,0. Yhdessä valtaosa kitinaasiaktiivisuuden hiiren vatsassa johtui AMCase aktiivisuutta. Ihmisen mahalaukun uutteesta myös havaittu hyvin heikko, mutta havaittavissa olevia kitiiniä aktiivisuus pH: ssa 2,0 ja pH 5,2 (kuvio 7A, oikea, alempi paneeli). Kitinaasi aktiivisuus pH: ssa 5,2 oli verrattavissa pH: ssa 2,0, mikä osoittaa, Chit1 ilmentyminen ihmisen vatsassa.

Lopuksi analysoidaan tasot proteiinin ekspression Western-blottauksella käyttämällä vasta-aineita vastaan ​​AMCase. Anti-AMCase vasta-aineita vastaan ​​tuotettuja aiemmin raportoitu hiiren peptidi [14] ja ihmisen vastine. Anti-hiiri AMCase vasta-aine tunnisti vankka yhden proteiinin kaistan ote hiiren vatsa mutta ei ihmisen (kuvio 7B, vasemmalla). Samoin anti-ihmisen AMCase-vasta tunnustetaan myös yhden kaistan hiiren uute (kuvio 7B, oikealla). Ihmisen ote oli heikkoa vyöhykettä hieman suurempi molekyylipaino, joka tunnisti sekä ihmisen ja hiiren vasta-aineita (kuvio 7B). Koska ei ollut merkittävää kitinaasiaktiivisuuden joko pH 2,0 tai pH 5,0 seurattiin käyttämällä 4MU-chitobiose ihmisen mahalaukun uutteesta nämä bändit ei liittyä ihmisen AMCase. Näin ollen kitiiniä toimintaa ja suhteellinen proteiinin ekspressiotasot hiiren ja ihmisen välillä mahan kudoksissa olivat yhdenmukaisia ​​meidän saadut mRNA-tasolla.

Keskustelu

Aikaisemmat tutkimukset in vivo
sääntely Chit1 ja AMCase ihmisen ja hiiren suoritettiin käyttäen northern blotting, semikvantitatiivinen PCR ja reaaliaikainen PCR [6], [8], [9], [13], [14], [22] , [23]. Vaikka nämä menetelmät on useita etuja tutkittaessa geeniekspression malleja, ne eivät verrata tasoa eri geenin transkriptien samassa mittakaavassa. Nykyisessä tutkimuksessa olemme soveltaa myös menetelmää [17] tutkimaan ekspressiotasot näiden kitinaaseja ihmisen kudoksissa. Lisäksi arvioida ekspressiotasoja kitinaaseja ihmisen ja hiiren kudoksissa, kehitimme kvantifiointiin järjestelmä käyttämällä yhtä ihmisen ja hiiren hybridi standardi DNA. Osoitimme kudos- ja lajikohtaisia ​​ilmentymä kaksi nisäkkäiden aktiivinen kitinaaseja, Chit1 ja AMCase. Tuloksemme tukee yleisesti aiemmat tutkimukset raportoineet Boot et al [6], [21]. Kuitenkin meidän analyysi on riittävän herkkä havaitsemaan mRNA ja tarjoaa kattavan selvityksen geenin ilmentymisen kuviot kitinaaseja ihmisen ja hiiren kudoksissa samassa mittakaavassa.

Yksi huomattava piirre ilmentymisen nisäkkään kitinaaseja on konservoituneet ilmaus Chit1 ihmisen ja hiiren välillä keuhkojen kudoksiin. Olemme havainneet, että Chit1 ilmaistiin suhteellisen suurina määrinä ihmisen ja hiiren keuhkojen kudoksiin, jotka olivat lähes keskenään vertailukelpoisia, mikä osoittaa, että ilmentymisen taso Chit1 mRNA säilyy. Keuhkoissa, Chit1 voi toimia osana isännän puolustusjärjestelmän, joka suojaa kitiini-taudinaiheuttajia sisältäviä, kuten sienet ja punkit [25]. Säilyttäminen Chit1 geeniekspression ihmisillä ja hiirillä ehdottaa fysiologinen merkitys Chit1 keuhkoissa.

ilmentyminen kitinaaseja vatsassa, on erityisen kiinnostava. AMCase mRNA syntetisoidaan on erittäin korkealla tasolla hiiren vatsan, mutta ei ihmisen mahalaukussa (kuvio 6B). Vertailu Näiden ekspressiotasoja osoitti AMCase mRNA tasolla ihmisen vatsa oli noin 1/2800 on, että hiiren vastine. Olemme vahvistaneet, että ekspressiotasot pepsinogeeni C mRNA ja kaksi taloudenhoito geenit olivat hyvin korkeita ihmisen ja hiiren mahan kudoksissa (kuvio 6B). Siten vähentynyt ekspressiotaso AMCase mRNA ihmisen mahalaukussa ei johdu RNA: n hajoamisen aikana cDNA-valmisteen. Lisäksi olemme havainneet, että hiiren vatsan ilmaistuna suuri määrä AMCase, kun taas ihmisen vastapuoli ei (kuvio 7). Nämä tulokset osoittavat, että ilmentymistason AMCase vatsassa kudoksissa eroaa huomattavasti ihmisen ja hiirten.

Vatsa on tärkeä elin, joka soittaa olennainen rooli ruoansulatus elintarvikkeiden ja suojan haitallisia organismeja. Suolahappoa erittyy vatsassa, luoda happamissa olosuhteissa (pH = ~ 2), jotka soveltuvat proteiinien sulatuksessa pepsiinillä [19], [26]. Hiiren AMCase esittää syvän happostabiilius ja on aktiivisin noin pH 2 [6]. Hiiren vatsan tuottaa valtavasti AMCase mRNA [17] ja sen translaatiotuotteen (kuvio 7). Näin ollen, AMCase voi toimia ruoansulatuskanavan entsyymiä, joka hajottaa kitiiniä sisältävien elintarvikkeiden hiiren vatsassa.

Sen sijaan, ilmentymistason AMCase mRNA: ta ja sen tuote oli suhteellisen alhainen ihmisen mahalaukussa (kuvio 5, Kuvio 6 ja kuvio 7). Tämä ei ole odottamatonta, koska nykyaikaiset ihmiset eivät syö huomattavan määrän kitiinin sisältäviä ruokia. Nämä tulokset viittaavat siihen, että AMCase ei saa olla merkitystä puolustuksen vastaan ​​kitiini sisältäviä organismeja ihmisen mahalaukussa. Monet vatsa sairaudet liittyvät infektioon eksogeeniset organismeja. Vakavuus gastriitti liittyvien infektioiden kuten Helicobacter pylori
voi korreloi aktiivisuuden endogeeniset entsyymit [23]. On vielä Kiistanalaista, onko alhainen AMCase ihmisen mahalaukussa osallistuu vastauksena mahalaukun sairaudet.

korkeatasoinen kitiiniä toiminta on havaittu otteita hiiren vatsan ja suoliston [6] . Koska on olemassa merkittävä eroja tasojen kitinaasiaktiivisuuden ilmaisun vatsassa ihmisen ja hiiren välillä, tutkimme ekspressiotasot näiden kitinaaseja muissa ruoansulatuskanavan elimissä, kuten sylkirauhasten ja pienten ja suurten suolet. Tuloksemme osoittavat, että sekä Chit1 ja AMCase mRNA tasot pienten ja suurten suolet olivat hyvin pieni sekä ihmisen ja hiiren kudoksissa, vaikka hiiri sylkirauhasten ja vatsa tuotti suuria molempien kitinaaseja mRNA: iden (kuva 5). Nämä tulokset viittaavat siihen, että nisäkkään kitinaasia proteiinit hiiren suoliston todennäköisesti peräisin yläosat maha-suolikanavan, kuten sylkirauhasen ja vatsa, joka on yhdenmukainen tunnetun käsite Boot et ai [6], [21].

ilmentymisen tasot Chit1 geenin keuhkojen kudoksiin on konservoitunut ihmisen ja hiirillä. Sitä vastoin ilmaus taso AMCase mahan kudoksissa on lajispesifinen. Tulokset viittaavat siihen, että asetus ilmentymisen Chiti1 mRNA keuhkoissa on säilynyt evoluution aikana, kun taas vähentynyt ilmentyminen AMCase ihmisen mahalaukussa saattaa johtua geenien. Tutkittaessa ekspression säätelyn näiden nisäkkäiden kitinaaseja voisi antaa oivalluksia patofysiologisia rooleja näiden entsyymien. Yksityiskohtainen luonnehdinta promoottorin alueiden Chit1 ja AMCase geenejä ja tunnistaminen cis
- ja trans
faktorilla tarvitaan ymmärtämiseksi selektiivisen geenin ilmentymistä näiden kitinaaseja ihmisillä ja hiirillä.

ilmentyminen Chit1 ja AMCase mRNA: t indusoidaan erilaisissa patologisissa olosuhteissa. Käyttäen määrällinen kuvatussa täällä, voimme verrata kitinaasiaktiivisuuden mRNA tasoilla koko ihmisen ja hiiren kudoksissa reaaliaikaisella PCR: llä. Analyysissä ymmärtämisen helpottamiseksi biologisen toiminnan näiden kitinaaseja erityisesti patofysiologisia tutkimuksissa ihmisten sairauksien käyttäen hiiren malleja. Menetelmämme on sovellettavissa kvantifiointiin mRNA useiden geenien välillä ihmisen ja hiiren yksilöiden samalla asteikolla. Käytännön käyttää tätä vertailevaa rajat lajien geenien ilmentyminen tietoja on vertailu ihmisen sairauksien hiirellä ja soluviljelymalleissa.

Materiaalit ja menetelmät

RNA ja cDNA valmistelu

Ihmisen kokonais-RNA Master Panel II ja hiiren kokonais-RNA Master Panel (Clontech Laboratories) käytettiin tutkimaan jakelua transkriptien eri kudoksissa. Ihmisen ohutsuolessa Yhteensä RNA hankittiin yhtiöltä Clontech Laboratories. Lisäksi RNA eristettiin sylkirauhasten ja pienten ja suurten suolet 3-kuukautta vanhan uroshiirillä. C57BL /6J-hiirten (CLEAR Japani) oli kasvatettu klo RIKEN Brain Science Institute Animal Facility. Kaikki eläinkokeet suoritettiin noudattaen vakiintuneiden ohjeiden. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden RIKEN Brain Science Institute (hyväksynnän nro H19-2B013). Kaikki Leikkaus suoritettiin käyttäen dietyylieetteriä anestesia, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Kudosten mRNA valmistelua toimitti Drs. Miyazaki ja Nukina at RIKEN Brain Science Institute. Kokonais-RNA valmistettiin sylkirauhasesta ja ohut- ja paksusuolen käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Analysoimme 21 eri ihmisen kudoksista ja kahdeksan aikuisen hiiren kudoksissa. Poistaa pieniä määriä kontaminoivaa genomista DNA: ta, kokonais-RNA-näytteet käsiteltiin RQ1 RNaasi-vapaata DNaasia (Promega) mukaisesti valmistajan suositusten mukaisesti. Kukin koko RNA-näytteet saatettiin käänteistranskriptiolle käyttämällä satunnaisia ​​heksameerejä alukkeina, kuten on raportoitu aiemmin [17].

Reaaliaikainen PCR

perustaminen ja validointi reaaliaikaisen PCR järjestelmä ihmiskudosten tehtiin kuvatulla [17]; Ainoa poikkeus oli käyttää ihmisen alukkeita. Nukleotidisekvenssit, että alukkeita, jotka valittiin reaaliaikainen PCR-ihmisen järjestelmä on esitetty taulukossa S1. Jokainen näyte monistettiin kolmena kappaleena, ja jokainen koe toistettiin ainakin kaksi kertaa.

rakentaminen Ihmisen Standard DNA ja valmistaminen Viisi Ihmisen cDNA peittävät koko koodausalueen

Rakentaminen standardin templaatti-DNA: na ihmisen geenit ja valmistelu viiden ihmisen cDNA, joka kattoi koko koodaavan alueen suoritettiin oleellisesti, kuten on kuvattu [17]; Ainoa poikkeus oli käyttää ihmisen alukkeita. Eteenpäin ja käänteinen alukkeet on lueteltu taulukossa S2. PCR-tuotteet digestoitiin sopivilla restriktioentsyymeillä ja ligoitiin käyttämällä T4 DNA-ligaasia. Ligatoidut fragmentit monistettiin käyttäen eteenpäin-aluketta 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'ja reverse-aluketta 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' ja kloonattiin pGEM-T-Easy -vektoriin (Promega). Todennettujen sekvenssit cDNA: iden on esitetty kuvassa S2.

• PLoS ONE: Vatsa Lämpötila Records Paljasta Nursing Käyttäytyminen ja kiinteään ruokaan siirtymisen kulutus käytettäessä Vieroittamattomien nisäkäs, Kirjohylje Pup (Phoca vitulina)
• PLoS ONE: Seerumin Apolipoproteiinit C-I ja C-III pelkistetään Mahasyöpä Potilaat: Tulokset MALDI-Based peptidomin ja Immuno-Based Kliiniset määritykset