PLoS One: számszerűsítése kitináz mRNS szintek a humán és egér szövetek Real-Time PCR: fajspecifikus kifejezése savas emlős kitináz gyomor Tissues

absztrakt katalógusa

A kitináz hidrolizál kitin, ami egy N
-acetil-D-glükózamin polimer, hogy jelen van egy az organizmusok széles köre, beleértve a rovarokat, paraziták és gombák. Bár az emlősök nem tartalmaznak endogén kitin, emberben és egérben kifejezni két aktív kitinázok, kitotriozidáz enzim szintjét (Chit1) és savas emlős kitináz (AMCase). Mivel a kifejeződésének szintje ezek kitinázok fokozott számos gyulladásos állapotok, beleértve a Gaucher-kór és az egér modell asztma, mindkét kitinázok lehet fontos szerepet játszanak a kórélettanának ezen és más betegségek. Nemrég létrehozott egy kvantitatív PCR rendszer segítségével egy szabványos DNS-t és azt mutatta, hogy AMCase mRNS szintetizálódik a rendkívül magas egér gyomor. Ebben a vizsgálatban alkalmaztunk ezt a módszert, hogy a mennyiségi meghatározás kitináz mRNS-ek a humán szövetekben, és megállapította, hogy mindkét kitináz mRNS széles körben kifejezett normális emberi szövetekben. Chit1 mRNS-t erősen expresszálódik a humán tüdő, míg AMCase mRNS-t nem expresszálódik normál humán gyomorban szövetekben. Az ezeknek a mRNS-ek a humán szövetekben szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a szintek háztartási gének. Mivel a AMCase expressziós szinteket egészen más között a humán és az egér gyomor szövetek, kifejlesztettünk egy kvantitatív PCR System, hogy összehasonlítsa a mRNS szinteket között emberi és egér szövetek alkalmazásával egy humán-egér hibrid standard DNS. A vizsgálatok azt mutatták, hogy a Chit1 mRNS kifejeződik hasonló szinten a normál emberi és egér tüdőben. Ezzel szemben a AMCase expressziós szintje az emberi gyomorban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az expresszió megfigyelt szintet egér gyomorban. Ezek az mRNS közötti különbségek az emberi és az egér gyomor szöveteket tükröző különbségek a chitinolytic tevékenységek és a fehérje expresszió. Így expressziós szintjének a AMCase a gyomorban fajspecifikus.

bevezető hivatkozás: Ohno M, Togashi Y, Tsuda K, Okawa K, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) számszerűsítése kitináz mRNS szintek a humán és egér szövetek Real-Time PCR: fajspecifikus kifejezése savas emlős kitináz a gyomor. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10,1371 /journal.pone.0067399 katalógusa

Szerkesztő: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, az Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: január 5, 2013; Elfogadva: május 15, 2013; Megjelent: június 27, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Ohno et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a projekt kutatási támogatásával a Kutatási Institute of Science and Technology, Kogakuin Egyetemen. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

kitin, amely olyan polimer, N
-acetil-D-glükózamin, a második leggyakoribb poliszacharid a természetben [1]. Ez egy szerves része a külső vázának rákból és rovarok, a microfilarial burkát élősködő fonálférgek és gombás sejtfalak [1], [2]. Katalógusa

kitinázoknak olyan enzimek, amelyek megemésztik a kitin polimer. Bár emlősök nem termelnek kitin, emberben és egérben két kódoló gének aktív kitinázok, kitotriozidáz enzim szintjét (Chit1) és savas emlős kitináz (AMCase) [2], [3]. Chit1 volt az első emlős kitináz tisztítandó és klónozták [4], [5]. AMCase, amely a második legaktívabb kitináz emlősökben, azonosítottuk egy kompenzációs enzimet Chit1 és elemzi annak optimális aktivitást savas körülmények között [6].

mindkét enzim mutat szekvencia homológiát mutat a bakteriális fehérjéket, és tartoznak család 18 glikozil hidrolázok, amely magában foglalja a kitináz-szerű fehérjék, amelyek szerkezetileg rokon a kitinázok de hiányzik chitinolytic tevékenység [2], [3]. Az egér AMCase mutat szekvencia homológiát Chit1, egy azonossága 52% és a hasonlóság 60% [6]. A pályája az emberi Chit1 gén található kromoszóma 1q32 [7], mivel az emberi AMCase gén kromoszómán található 1p13 [6]. Mindkét gént álló 12 exont és kódolnak különböző splice izoformák [6] - [9]. A szekvencia homológia és megőrzését az intron-exon határokat az Chit1 és AMCase gének arra utalnak, hogy ezek a gének adódott egy párhuzamos ősi gén [3], [6]. Katalógusa

A legújabb vizsgálatok kimutatták közötti összefüggéseket a kifejezés az emlős kitinázok és gyulladásos körülmények között. Például, a szintek Chit1 emelkedett a plazmában betegek Gaucher-betegség, a bronchoalveoláris mosófolyadékban a dohányzók és krónikus obstruktív légúti betegség (COPD) és az agy-gerincvelői folyadékban betegek Alzheimer-kór [9] - [12] . AMCase expressziója és aktivitása is fokozódik során allergiás légúti reakciók egér modellekben az asztma [13]. Polimer kitin indukál AMCase kifejezés és az immunsejtek, amelyek kapcsolatban vannak az allergia és az asztma [14]. Emellett számos genetikai variánsai AMCase társított asthma bronchiale emberben [15], [16]. Ezek az eredmények határozottan arra utalnak, hogy a chitinolytic enzimek fontos szerepet játszanak a választ, hogy a betegség. Azonban a kórélettani funkciók változatlanul kevéssé értjük. Katalógusa

számszerűsítése Chit1 és AMCase mRNS szintek fontos lépés a megértés a in vivo katalógusa szabályozásában kitinázok emlősöknél. Nemrég létrehozott egy kvantitatív PCR rendszer segítségével egy szabványos DNS számszerűsíteni, és hasonlítsa össze az expressziós szintjének kitináz és a referencia gén ugyanazon a skálán. [17] Korábbi munkánkban azt mutatta, hogy AMCase jelentős átirat az egér gyomor és olyan szinten expresszálódik, amelyek hasonlóak a pepszinogén C [17]. Katalógusa

Itt alkalmaztuk a módszert, hogy a mennyiségi meghatározás mRNS-szintje az emlős kitinázok normál emberi szövetekben, ami előfeltétele a megértés patológiai szerepük beteg szövetekben. Továbbá, mi létre számszerűsítését rendszer, hogy összehasonlítsa a mRNS szinteket több gén között számos emberi és egér szövetek alkalmazásával egy humán-egér hibrid standard DNS. A tanulmány azt mutatja, hogy mennyiségileg Chit1 mRNS adjuk meg hasonlóan magas szinten a normál emberi és egér tüdőben. Ezzel szemben a AMCase túlnyomórészt túltermelõdik egér, de nem emberi gyomorban. Katalógusa

Eredmények katalógusa

létrehozása és érvényesítése a Real-time PCR rendszer kimutatása kitinázok humán szövetekben katalógusa

Mi korábban létrehozott egy valós idejű PCR-rendszer, amely képes a meghatározására mRNS-szintje a két emlős kitinázok egér szövetek és összehasonlítjuk ezeket szinten azon referencia gének ig terjedő skála segítségével [17]. Ebben a tanulmányban azt akartuk összehasonlítani a génexpresszió szintjén a Chit1 és AMCase gének egész normális emberi szövetekben (1A). Ahogy az egér a szövetekben [17], használtuk a háztartási gének gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) és β-aktin referencia gének mert konstitutívan magas szinten expresszálódnak a legtöbb sejtben [18]. Ezen kívül, úgy döntöttünk, pepszinogén C (más néven progastricsin), mint a referencia gén a gyomorban, mert a szint AMCase mRNS az egér gyomorban hasonló volt az mRNS szintje a pepszinogén C, ami az egyik fő összetevője a gyomornyálkahártya [ ,,,0],19]. Ezekkel a három referencia gén, értékeltük a gén expressziós szintjét Chit1 és AMCase normál humán szövetekben (1A).

tervezett több készlet primerek kvantitatív PCR és értékelték azok alkalmasságát alapul, hogy azok mutattak egyetlen olvadási hőmérséklet (Tm), és egyetlen csíkot egy 10% -os poliakrilamid gélen [17]. Amint az ábrán S1A-E, a disszociációs görbék az öt cDNS mutatnak csak egy csúcsot minden. Gél-elektroforézis egyértelműen azt mutatták, az egyes csíkok a várt méretű Chit1 (55 bp), AMCase (62 bp), GAPDH (57 bp), β-aktin (57 bp) és a pepszinogén C (61 bp) (ábra S1F). Így azt megerősítette, hogy a helyes PCR termékeket amplifikáltuk a humán szöveti cDNS keveréket.

következő épített egy szabványos templát DNS valós idejű PCR-rel történő ligálásával az öt cél fragmensek az egy-az-egyhez arányt (1B ábra és S2). A 1396-nukleotid hosszú szabványos templát DNS állt öt cDNS fragmentumokat, amelyek kiterjedtek a PCR-célterület és 60-143 bázisok a szegélyező régiók és amely Bgl katalógusa II Sal katalógusa I Xho katalógusa I és Nem
I restrikciós helyeket (1B ábra és S2). katalógusa

a számszerűsítése mind a fehérjéket, és a referencia-mRNS támaszkodik standard görbék. Használtuk a standard görbék összehasonlítani és értékelni a valós idejű PCR technika stratégiákat. Minden standard görbét generáltunk, 10-szeres hígítási sorát a humán standard DNS-t és az öt különböző primer párt (ábra S3A-E, piros zárt körök). Segítségével a szabványos sablon tartalmazó DNS-t az öt emberi cDNS-fragmentumokat, az egyenlő mennyiségeket lehet rendelni minden öt gén mindegyik hígítás használat megépíteni a standard görbék (ábra S3A-E, piros zárt körök).

Annak tesztelésére az egyenlőség a görbék, ismert koncentrációjú humán teljes kódoló cDNS-t amplifikáltunk, és ezt követően analizáltuk, mint egy ismeretlen mintában. Ezt a vizsgálatot azért végeztük, hogy ellenőrizze, hogy minden egyes vizsgált hígítás eredményezte a várt mennyiségben. Amint az ábrán S3A-E, kék zárt rombuszok, egyenlő mennyiségű észleltek minden vizsgált hígítás; ezeket használtuk fel a standard görbe. katalógusa

A számszerűsítését alacsony bőség átiratok és bőséges átiratok lehetővé teszi számunkra, hogy érvényesítse az érzékenységét és megbízhatóságát real-time PCR, jelezve, hogy a real-time PCR módszerrel egy nagy dinamikus tartomány a mennyiségi, nagy pontosságú, és nagy érzékenység (ábra S3A-E). Így a valós idejű PCR-módszer megbízható értékeket a két emberi kitináz gén és a három humán referencia gén azonos skálán. Katalógusa

kifejezése Chit1 és AMCase normál emberi szövetek katalógusa

tanulmányozza a in vivo
szabályozásában a kifejezés az emberi Chit1 és AMCase gének, a teljes RNS különböző normál humán szövetek alkalmazásával analizáltuk kvantitatív valós idejű PCR-assay a kifejezetten szabványos DNS-t (1. ábra). Az így kapott értékeket adtuk meg molekulák per 10 ng teljes RNS-ben y tengelyen (2. ábra és 3. ábra).

Mind Chit1 és AMCase mRNS széles körben kifejezett normál humán szövetekben (2A, 2B). A legmagasabb szintű Chit1 mRNS volt kimutatható humán tüdő, majd a lépben, a magzati máj és a csecsemőmirigy (2A ábra). A legmagasabb szintű AMCase mRNS-t találtunk a tüdőben, majd a magzati agy, máj, pajzsmirigy és a szív (2b ábra). Bár AMCase mRNS expresszálódott rendkívül magas szintje a egér gyomorban [17], annak expressziós szintje az emberi gyomorban sokkal alacsonyabb volt, mint a tüdő, a magzati agyban, a magzati májban, a pajzsmirigy és a szív (2b ábra). Az egyéb szövetekben, mind a Chit1 és AMCase mRNS expresszálódott alacsony, de könnyen kimutatható szint feletti háttér (2A ábra és 2.b ábra),.

Amikor összehasonlítva AMCase mRNS-szinteket, Chit1 mRNS expresszálódott viszonylag magasabb szinteken a lépben és magzati májban. Ezzel ellentétben, a magzati agy, prosztata és a máj kifejezett nagyobb mennyiségű AMCase mRNS mint Chit1 mRNS (2. ábra). Katalógusa

elemzése Expression szintek Chit1, AMCase, GAPDH, β-aktin és Pepszinogén C mRNS normál humán tüdő és gyomor

Mivel számos tanulmány kórélettanáért emlős kitinázok végeztek, melyek során a tüdő és a gyomor [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], összehasonlítottuk az expressziós szintek a kitinázok és a referencia gén e két emberi szövetekben. A kvantitatív adatokat a 3. ábrán mutatjuk be normalizálása A Chit1 szint 1,0, a relatív expressziós szintjének AMCase, GADPH, és β-aktin mRNS-ek a humán tüdőszövet volt 0,8, 39 és 343, illetve (3A). A GAPDH és β-aktin gén jól ismert háztartási gének és konstitutívan magas szinten expresszálódnak a legtöbb szövetben [18]. Eredményeink azt mutatják, hogy Chit1 és AMCase mRNS-ek expresszálódnak hasonló szinten a normál humán tüdőszövet, bár a Chit1 expressziós szintje sokkal alacsonyabb volt, mint a két háztartási gének (hasonlítsuk össze a nem-log diagramja log plot a 3. ábrán).

normalizálása a Chit1 szint 1,0, a relatív expressziós szint a AMCase, GAPDH, β-aktin és pepszinogén C normál humán gyomorban szövetet 1.5, 323, 1736 és 3962, illetve (3b) ábrát. Itt, az expressziós szintje egyaránt Chit1 és AMCase sokkal alacsonyabbak voltak, mint a GAPDH és β-aktin. Bár a pepszinogén C mRNS-t erősen expresszálódik a humán gyomor mintákat, AMCase mRNS hasonló volt Chit1. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Chit1 és AMCase expressziós szintek viszonylag alacsonyak az emberi szövetek vizsgálni, és hogy a AMCase expressziós szintje a gyomorban jelentősen eltér az emberi és egér. Katalógusa

létrehozása és érvényesítése a számszerűsítése rendszer az emberi és egér kitináz mRNS használata egy ember-egér hibrid DNS katalógusa

a következőkben kívánta összehasonlítani expressziós szintjét két kitinázok között emberben és egérben az azonos méretű egy real-time PCR-rendszer (4A). Mi ezért létrehozott egy ember-egér hibrid standard DNS valós idejű PCR-rel történő ligálásával a humán és egér szabványos sablon DNS-ek (4b ábra). A kapott 2305-nukleotid hosszúságú DNS templát szereplő tíz cDNS fragmentumokat, amelyek kiterjedtek a PCR-célterület és 9-143 alapjai határoló régióinak az emberi és egér gének (a részleteket lásd ábra S4). Katalógusa

A hitelesítések a standard görbe és a kvantitatív valós idejű PCR System végeztük ábra S5, ábra S6 és ábra S7. Sorozathígításait a humán-egér hibrid szabványos DNS-t használtuk fel a standard görbe. Minden standard görbét generáltunk, 10-szeres hígítási sorát a standard DNS-t és az öt különböző primer párt (ábra S5A-E, piros zárt körök). Segítségével a szabványos sablon tartalmazó DNS-t az öt cDNS-fragmentumokat, az egyenlő mennyiségeket lehet rendelni mind az öt emberi gének humán-specifikus primer párok minden egyes hígítási hogy használták megépíteni a standard görbék (ábra S5A-E, piros zárt körök ). Hasonlóképpen, az egyenlő mennyiségben lehet rendelni mind az öt egér gén (ábra S6A-E, lila zárt háromszögek). Katalógusa

A teszt egyenlőség a görbék, ismert koncentrációjú teljes kódoló cDNS-t és követően elemezték, mint egy ismeretlen minta. Egyenlő mennyiségű humán teljes kódoló cDNS-eket meg az egyes vizsgált hígítás; ezek a mennyiségek ezután használtuk fel a standard görbe (ábra S5A-E, kék zárt rombusz). Hasonlóképpen, egyenlő mennyiségben az egér teljes kódoló cDNS-eket is megfigyelhető (ábra S6A-E, zöld keresztek). Számszerűsítésére alacsony bőség átiratok és bőséges átiratok lehetővé teszi számunkra, hogy érvényesítse a érzékenységét és megbízhatóságát real-time PCR, jelezve, hogy a real-time PCR módszerrel egy nagy dinamikatartományt számszerűsítés, nagy pontosságú és nagy érzékenységű (ábra S5A- E és ábra a 6A-E).

Továbbá, a négy sort (két standard görbék és két hígítási görbéit az ismert koncentrációjú a humán és az egér teljes kódoló cDNS-ek, sorrendben) fedésben (ábra S7A-E). Így a valós idejű PCR-módszer megbízható relatív értékek a négy kitináz gén és a hat referencia gén (4B ábra). Katalógusa

összehasonlítása Chit1 és AMCase mRNS szintek között normális emberi és egér szövetek katalógusa

használtuk a Humán teljes RNS-mester Panel II és a Mouse teljes RNS mester panel (Clontech Laboratories) forrásként teljes RNS ebben a vizsgálatban. Jelenleg négy szövetek (tüdő, máj, lép és vese), amely átfedésben között a humán és az egér panelek és kapcsolódó asztma és Gaucher-kór. Mivel nem volt kiemelkedő különbség a kitináz kifejezés a gyomorban szövetekben, azt is nézett szintű expresszióját ezekben kitinázok más emésztőszervek, a nyálmirigy, a gyomrot, a vékony- és vastagbél ember és egér között. Meghatároztuk, és összehasonlítottuk az expressziós szinteket ezekben a szövetekben a humán-egér hibrid standard DNS (4b ábra); A kvantitatív adatokat az 5. ábrán látható

Azt találtuk a legmagasabb expressziós szintet Chit1 mRNS egér (de nem humán) gyomor-, majd a humán tüdő szöveteiben. Összességében, Chit 1 mRNS-t magasabb szinten expresszálódott az emberi szövetek, mint az egér szövetekben, kivéve a gyomor (5A ábra). A legmagasabb expressziós szintje AMCase mRNS volt egér gyomorban, majd egérnyálmirigyben. A többi humán és egér szövetekben, a AMCase mRNS szintje alacsony volt humán szövetekben (5B, ábra). Mindkét Chit1 és AMCase mRNS szinteket a vékony- és vastagbél nagyon alacsony volt mind humán, mind az egér szövetek (5. ábra), amelyek összhangban vannak a korábbi adatokat Northern blot [6], [21]. Katalógusa

találta, hogy AMCase mRNS expresszálódott alacsony szinten a normál humán gyomorban de erősen expresszálódik egér gyomor szövetekben (5B, ábra). Így is összehasonlítottuk az expressziós szintek a kitinázok és a referencia gén felhasználásával a cDNS-eket, hogy állítjuk elő a tüdő és a gyomor szöveteiben.

normalizálása az emberi Chit1 szintet a tüdőszövetben 1,0, a relatív expressziós szintek az egér Chit1, emberi AMCase és egér AMCase mRNS volt 0,3, 0,3, illetve 7 (6a ábra). Rágcsáló AMCase ben erősen expresszálódik az egér tüdőben. A szint Chit1 mRNS az emberi tüdő volt körülbelül 3-szor nagyobb, mint az egér tüdő. A Chit1 és AMCase mRNS szintek szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint az expressziós szintek a GAPDH és β-aktin gén (6a ábra).

normalizálása az emberi Chit1 szinten gyomor to1.0, a relatív expressziós szint a egér Chit1, az emberi AMCase és az egér AMCase mRNS-ben 10, 0,7 és 1978 volt (6B). Pepszinogén C egy nagy emésztő enzim a gyomorban. Az expressziós szintjének AMCase egerekben sokkal nagyobb volt, mint a GAPDH és β-aktin és hasonló volt a szint pepszinogén C, mivel az emberi gyomor mutatott igen alacsony AMCase mRNS-expresszió. A relatív expressziós szintjének mRNS az emberi és egér gyomor 1,0 volt, és 2826, ill. Katalógusa

Annak ellenőrzésére, hogy az mRNS szint közötti különbség az egér és humán tükröződtek fehérje szinten, akkor a következő elemeztük enzimaktivitás ezeknek a kitinázok a gyomorban szövetekben. Először elemezzük AMCase aktivitást egér és emberi gyomor. Az egér AMCase mutat kettős pH-optimum a súlyos optimális pH = 2 körül és egy másodlagos optimális pH-érték körüli 5 [6], mivel az emberi AMCase mutatja széles optimális pH pH = 2~pH 5 [16], [24]. Így mértünk chitinolytic aktivitás pH = 2,0 és pH = 5,0 használva a szintetikus szubsztrátja 4-metil β-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Azt észleltük, robusztus chitinolytic aktivitást egér gyomor kivonat pH = 2,0 és erős aktivitása pH 5,0. Ezzel ellentétben, semmilyen aktivitást nem volt kimutatható, hogy az emberi pH = 2,0, és nagyon alacsony aktivitás volt megfigyelhető pH = 5,0 (7a ábra, balra).

A szabványos Chit1 enzimatikus vizsgálatot már lépésben 4-Methylumbelliferyl β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) pH = 5,2 [6], [10], [21], [25]. Ahhoz, hogy nyomon követi a AMCase a Chit1 tevékenység, elemeztük a kitináz aktivitás mérése 4MU-chitotriose pH = 2,0. Viszonylag erős kitináz aktivitást 4MU-chitotriose kimutatható volt az egér gyomorban extraktumot pH = 2,0 (7a ábra jobbra), és mi is kimutatható gyenge kitináz aktivitás pH = 5,2 (7a ábra jobbra). Mivel AMCase van egy második optimális körül pH = 5, ezek az eredmények azt mutatták, hogy a legtöbb chitinolytic aktivitása pH 5,2 oka lehet, hogy AMCase helyett Chit1, és hogy az egér AMCase lehetett hidrolizálja 4MU-chitotriose szubsztrátként, pH = 2,0. Mindent összevetve, a többség a kitináz aktivitás az egér gyomorban eredt AMCase aktivitást. Az emberi gyomor-kivonat is megfigyelhető nagyon gyenge, de kimutatható szintű chitinolytic aktivitása pH 2,0 és pH 5,2 (7A ábra, jobbra, alsó panel). Kitináz aktivitás pH = 5,2 összehasonlítható volt pH = 2,0, jelezve Chit1 expresszió emberi gyomorban.

Végül elemeztük a szintek fehérje expresszióját Western-blottal elleni antitestek AMCase. Az anti-AMCase antitesteket generáltunk ellen a korábban bejelentett egér peptid [14] és a humán megfelelője. Anti-egér AMCase antitest felismerte egy robusztus egyetlen fehérje sávot kivonatot egér gyomor, de nem humán (7B ábra, balra). Hasonlóképpen anti-humán AMCase antitest is elismert egyetlen sáv az egér kivonat (7B ábra, jobbra). Az emberi kivonat voltak halvány sávok valamivel nagyobb molekulatömegű által is elismert mind a humán és egér ellenanyagok (7B ábra). Mivel nem volt szignifikáns kitináz aktivitás akár pH = 2,0 vagy pH = 5,0 nyomon segítségével 4MU-chitobiose humán gyomor-kivonat, ezeket a sávokat nem lehet kapcsolatban a humán AMCase. Következésképpen chitinolytic tevékenységek és a relatív fehérje expressziós szintjét az egér és emberi gyomor szövetek összhangban voltak a kapott adatok az mRNS szintjén. Katalógusa

Vita katalógusa

A korábbi tanulmányok a in vivo
szabályozása Chit1 és AMCase humán és egér végeztük Northern blot, fél-kvantitatív PCR és valós idejű PCR [6], [8], [9], [13], [14], [22] [23]. Bár ezek az eljárások számos előnye van a vizsgálata génexpressziós mintázatok, nem sikerült, hogy összehasonlítsa a szinteket a különböző gén-transzkriptumok ugyanazon a skálán. A jelenlegi tanulmányban alkalmazott módszerünk [17], hogy vizsgálja meg a kifejezés ezeknek a kitinázok az emberi szövetekben. Továbbá, hogy értékelje expressziós szintjét kitinázok humán és egér szövetek, kifejlesztettünk számszerűsítését rendszer segítségével egyetlen emberi és egér hibrid standard DNS. Megmutattuk szövet- és fajspecifikus kifejezés a két emlős aktív kitinázoknak, Chit1 és AMCase. Adataink általában támogatja a korábbi vizsgálatok által jelentett Booth és munkatársai [6], [21]. Elemzésünk azonban a megfelelően érzékeny mRNS és átfogó felmérést a génexpressziós mintázatát a kitinázok humán és egér szövetekben az azonos méretű. Katalógusa

Egy észrevehető jellemző kifejezése emlős kitinázok van konzervált expresszióját Chit1 között emberi és egér tüdő szöveteiben. Azt találtuk, hogy Chit1 expresszálódott viszonylag magas szinten a humán és egér tüdő szöveteiben, amelyek majdnem összehasonlítható egymással, jelezve, hogy az expressziós szintet a Chit1 mRNS konzerváltak. A tüdőben, a Chit1 működhet része a gazda védelmi rendszer, amely véd a kitin-kórokozókat tartalmazó, mint például a gombák és atkák [25]. A megőrzése Chit1 génexpresszió emberekben és egerekben azt sugallja, fiziológiai jelentőségét Chit1 a tüdőben.

expresszióját kitinázok a gyomorban különösen érdekes. AMCase mRNS szintetizálódik a rendkívül magas az egér gyomorban, de nem az emberi gyomorban (6B). Az összehasonlítás ilyen expressziós szintek mutatta, hogy a AMCase mRNS szintje az emberi gyomorban körülbelül 1/2800 hogy az egér megfelelője. Igazoltuk, hogy az expressziós szintek a pepszinogén C mRNS és a két háztartási gének nagyon magasak voltak az emberi és egér gyomor szövetekben (6b). Így a csökkent expressziós szintjének AMCase mRNS az emberi gyomor nem miatt az RNS lebomlását a cDNS preparálása során. Továbbá azt találtuk, hogy az egér gyomor kifejezve nagy mennyiségű AMCase, mivel az emberi megfelelője nem (7. ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az expressziós szintet a AMCase a gyomorban szövetekben jelentősen különbözik az ember és egerekben.

A gyomrot egy fontos szerv, amely játszik alapvető szerepet a emésztés élelmiszerek és védelmet káros szervezetek ellen. Sósav kiválasztódik a gyomorban, ami savas körülmények között (pH = ~ 2) megfelelő a fehérjék emésztését a pepszin [19], [26]. Rágcsáló AMCase mutatja mély sav stabilitás és a legaktívabb pH = 2 körül [6]. Az egér gyomorban termelődő hatalmas mennyiségű AMCase mRNS [17] és annak fordítását termék (7. ábra). Következésképpen AMCase működhet, mint egy emésztő enzim, amely lebontja kitin-tartalmú élelmiszerek az egér gyomorban.

Ezzel szemben, az expressziós szintjének AMCase mRNS és a termék viszonylag alacsony volt az emberi gyomorban (5. ábra, ábra a 6. és 7. ábra). Ez nem meglepő, mert a modern ember nem eszik jelentős mennyiségű kitin tartalmú ételek. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy AMCase nem játszhat szerepet a védelem ellen kitin tartalmú szervezetek az emberi gyomorban. Sok gyomor betegségek által okozott fertőzést kísérő exogén organizmusok. A súlyossága gyomorhurut összefüggő fertőzések, mint a Helicobacter pylori katalógusa korrelálhatnak aktivitását endogén enzimek [23]. Így továbbra is vita tárgya, hogy az alacsony szintű AMCase az emberi gyomorban részt vesz a válasz gyomor betegségei. Katalógusa

A magas szintű chitinolytic tevékenységek fedeztek kivonatok egér gyomor és a belek [6] . Mivel vannak olyan kiemelkedő különbség a szintek kitináz kifejezés a gyomorban között emberi és egér, megvizsgáltuk a szintű expresszióját ezekben kitinázok más emésztőszervekben, beleértve a nyálmirigy és a kis és a nagy belek. Eredményeink azt mutatják, hogy mind a Chit1 és AMCase mRNS szintek a vékony- és vastagbél nagyon alacsony volt mind humán, mind az egér szövetekben, bár egér nyálmirigy és a gyomor előállított magas szintje egyaránt kitinázok mRNS (5. ábra). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az emlős kitináz fehérjék egér belek valószínűleg származik a felső része a gyomor-bél traktus, például a nyálmirigy és a gyomor, ami összhangban van a korábbi fogalom által a Boot és munkatársai [6], [21].

a expressziós szintjei a Chit1 gén tüdő szöveteiben konzervált között emberekben és egerekben. Ezzel szemben, az expressziós szintjének a AMCase a gyomorban szövetekben fajspecifikus. Az eredmények arra utalnak, hogy a szabályozás a expressziójának Chiti1 mRNS a tüdőben sikerült megőrizni az evolúció során, míg a csökkent expressziója AMCase az emberi gyomorban lehet az eredménye géncsendesítéssel. A vizsgálat az expressziójának szabályozásában ezen emlős kitinázok adhatna betekintést kórélettani szerepe ezen enzimek. A részletes jellemzése a promóter régióiban a Chit1 és AMCase gének és az azonosító az cisz katalógusa - és trans katalógusa -SZABÁLYOZÓ tényező lesz szükséges a megértéséhez szelektív génexpresszió ilyen kitinázok az emberekben és egerekben.

A kifejezés a Chit1 és AMCase mRNS-ek indukálják alapján különböző patológiás körülmények között. A kvantitatív rendszer itt leírt, akkor képes lesz összehasonlítani a kitináz mRNS szintek közötti emberi és egér szövetek real-time PCR. Ez az elemzés segíteni fogja a megértése a biológiai funkciója a kitinázok, különösen a kórélettani tanulmányok az emberi betegségek segítségével rágcsáló modellek. A módszer alkalmazható a számszerűsítésére mRNS több gén ember és egér között példányok ig terjedő skála segítségével. A gyakorlati használat ennek összehasonlító fajok közötti génexpressziós adatok összehasonlítását humán betegségek egér és sejttenyészet modellek.

Anyagok és módszerek

RNS és cDNS előállítása

az emberi teljes RNS-mester Panel II és az egér teljes RNS-mester Panel (Clontech Laboratories) használtunk, hogy vizsgálja meg a forgalmazási átiratát a különböző szövetekben. Emberi vékonybél teljes RNS-t forgalmazza a Clontech Laboratories. Ezen túlmenően, RNS-t izoláltunk nyálmirigy és a kis és a nagy belek 3 hónapos hím egerekben. C57BL /6J egerek (CLEAR Japán) tenyésztették a RIKEN Brain Science Institute Animal Facility. A kísérleteket végeztünk megfelel az intézményi előírásoknak. A protokoll hagyta jóvá a Bizottság Etikai Állatkísérletek a RIKEN Brain Science Institute (Jóváhagyás száma H19-2B013). Minden műtét segítségével végeztük dietil-étert érzéstelenítő, és minden erőfeszítést tettek arra, hogy minimálisra csökkentsék a szenvedést. Szövetek mRNS készítéséhez biztosította dr. Miyazaki és Nukina a RIKEN Brain Science Institute. Teljes RNS-t készítünk nyálmirigy és a vékony- és vastagbél TRIzol reagens (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Elemeztük 21 különböző emberi szövetek és nyolc felnőtt egér szövetekben. Eltávolításához nyomokban szennyező genomiális DNS-t, a teljes RNS-mintákat kezeltünk RQ1 RNáz-mentes DNáz (Promega), a gyártó ajánlásainak megfelelően. Mind a teljes RNS mintákat vetettük alá a reverz transzkripció random hexamerek primerekkel, amint arról korábban [17]. Katalógusa

Real-time PCR katalógusa

A létrehozása és érvényesítése a valós idejű PCR System emberi szövetek leírtak szerint végeztük [17]; Az egyetlen kivételt a humán primer. A nukleotid szekvenciákat a primerek hogy választottak ki a valós idejű PCR az emberi rendszer táblázatban mutatjuk be az S1. Minden mintát erősített három példányban, és minden kísérletet megismételjük legalább két alkalommal. Katalógusa

Építőipari az Emberi standard DNS előállítása Öt Emberi cDNS, amely a teljes kódoló régió katalógusa

Az építőiparban a szabványos DNS-templátként a humán géneket és a készítmény a öt emberi cDNS-eket, amelyek kiterjedtek a teljes kódoló régió végeztünk lényegében a leírtak szerint [17]; Az egyetlen kivételt a humán primer. Az előre és hátra primerek táblázatban vannak felsorolva az S2. A PCR-termékeket emésztjük, a megfelelő restrikciós enzimekkel, és ligáljuk T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligált-fragmenst amplifikáltunk a forward primer 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'és a reverz primer 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' és pGEM-T Easy vektorba (Promega). Az igazolt szekvenciákat a cDNS-eket ábrán látható S2.

• PLoS One: Gyomor Hőmérsékleti rekord Reveal Nursing viselkedése és átmeneti Solid élelmiszer-fogyasztás egy szopós emlős, a Harbour Seal Pup (Phoca vitulina)
• PLoS One: A szérum apolipoprotein C-I és C-III csökkennek az gyomorrák Betegek: Eredmények a MALDI-alapú peptidkészlet és Immuno alapuló klinikai esszék