PLoS ONE: Quantifizierung von Chitinase-mRNA-Spiegel in Mensch und Maus Gewebe durch Real-Time PCR: Spezies-spezifischen Expression von Saure Mammalian Chitinase in Magen Tissues

Abstrakt

Chitinase hydrolisiert Chitin, das ist ein N
acetyl-D-Glucosamin-Polymer, das in einem breiten Spektrum von Organismen vorhanden ist, einschließlich Insekten, Parasiten und Pilze. Obwohl Säugetiere jede endogene Chitin enthalten keine, Menschen und Mäuse exprimieren zwei aktive Chitinasen, Chitotriosidase (Chit1) und saure Säugetier Chitinase (AMCase). Da der Pegel der Expression dieser Chitinasen in vielen Entzündungszuständen erhöht wird, einschließlich der Gaucher-Krankheit und Mausmodellen von Asthma können beide Chitinasen wichtige Rollen in den Pathophysiologien dieser und anderer Erkrankungen spielen. Wir stellten kürzlich eine quantitative PCR-System mit einem einzigen Standard-DNA mit und zeigte, dass AMCase mRNA bei außerordentlich hohen Niveaus in der Maus Magen Gewebe synthetisiert wird. In dieser Studie verwendeten wir diese Methode zur Quantifizierung von Chitinase-mRNAs in menschlichen Geweben und festgestellt, dass beide Chitinase mRNAs wurden in normalen menschlichen Geweben weit verbreitet exprimiert wird. Chit1 mRNA wurde in der menschlichen Lunge stark exprimiert, während AMCase mRNA nicht in normalen menschlichen Magengewebe überexprimiert war. Die Pegel dieser mRNAs in menschlichen Geweben waren deutlich niedriger als die Konzentrationen von Housekeeping-Genen. Da die AMCase Expressionsniveaus zwischen den humanen und Maus-Magen Gewebe ziemlich verschieden waren, entwickelten wir eine quantitative PCR System die mRNA-Spiegel zwischen menschlichen und Maus-Geweben unter Verwendung einer Mensch-Maus-Hybrid-DNA-Standard zu vergleichen. Unsere Analyse zeigte, dass Chit1 mRNA in ähnlichen Mengen in normalen menschlichen und Maus-Lunge exprimiert wird. Im Gegensatz dazu war der AMCase Expressionsniveau im menschlichen Magen signifikant niedriger als die Expressionsniveau in der Maus Magen beobachtet. Diese mRNA Unterschiede zwischen Mensch und Maus Magen Gewebe wurden auf Unterschiede in den chitinolytisches Aktivitäten und Ebenen der Proteinexpression. Somit ist das Expressionsniveau des AMCase im Magen artspezifischen

Citation. Ohno M, Togashi Y, Tsuda K, Okawa K, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) Quantifizierung der Chitinase-mRNA-Spiegel in Mensch und Maus Gewebe durch Real-Time PCR: Spezies-spezifischen Expression von Saure Mammalian Chitinase in Magen-Gewebe. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10.1371 /journal.pone.0067399

Editor: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 5. Januar 2013; Akzeptiert: 15. Mai 2013; Veröffentlicht: 27. Juni 2013

Copyright: © 2013 Ohno et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der Projekt Research Grant vom Forschungsinstitut für Wissenschaft und Technologie, Kogakuin Universität unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Chitin, das ein Polymer von N
acetyl-D-Glucosamin, ist das zweithäufigste Polysaccharid, das in der Natur [1]. Es ist ein integraler Bestandteil der Exoskelett von Krustentieren und Insekten, die Mikrofilarien Scheiden von parasitären Nematoden und Pilzzellwände [1], [2].

Chitinasen sind Enzyme, die die Chitinpolymer verdauen. Obwohl Säugetiere produzieren nicht Chitin, Menschen und Mäusen haben zwei Gene, die aktive Chitinasen, Chitotriosidase (Chit1) und saure Säugetier Chitinase (AMCase) [2], [3] kodieren. Chit1 war die erste Säugetier Chitinase gereinigt und kloniert werden [4], [5]. AMCase, die die zweite aktivste Chitinase bei Säugetieren ist, wurde als Ausgleichs Enzym für Chit1 identifiziert und für seine optimale Aktivität unter sauren Bedingungen genannt [6].

Beide Enzyme weisen Sequenzhomologie zu bakteriellen Chitinasen und gehören zu Familie 18 von Glycosylhydrolasen, die auch Chitinase-ähnliche Proteine, die Chitinasen strukturell verwandt sind, schließt aber nicht über chitinolytisches Aktivität [2], [3]. Die murine AMCase zeigt Sequenzhomologie zu Chit1, mit einer Identität von 52% und eine Ähnlichkeit von 60% [6]. Der Locus des menschlichen Chit1 Gen ist auf Chromosom 1q32 [7] gefunden, während das menschliche AMCase Gen auf Chromosom 1p13 [6] befindet. Beide Gene bestehen aus 12 Exons und codieren verschiedene Spleiß-Isoformen [6] - [9]. Die Sequenzhomologie und die Erhaltung der Intron-Exon-Grenzen zwischen den Chit1 und AMCase Gene deuten darauf hin, dass diese Gene aus einer Duplikation eines Ur-Gen entstanden ist [3], [6].

Jüngste Studien haben gezeigt, Vereinigungen zwischen die Expression der Säugetier Chitinasen und Entzündungszuständen. Zum Beispiel [9] die Konzentrationen von Chit1 sind im Plasma von Patienten mit Gaucher-Krankheit, der bronchoalveolären Lavage von Rauchern und Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) und Liquor von Patienten mit Alzheimer-Krankheit erhöht - [12] . AMCase Expression und Aktivität sind auch bei allergischen Reaktionen der Atemwege in Maus-Modellen von Asthma [13] nach oben reguliert. Polymere Chitin induziert AMCase Ausdruck und die Rekrutierung von Immunzellen, die mit Allergien und Asthma assoziiert sind [14]. Darüber hinaus wurden mehrere genetische Varianten von AMCase sind mit Asthma bronchiale in Menschen [15] verbunden sind, [16]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die chitinolytisches Enzyme eine wichtige Rolle bei der Reaktion auf Krankheit spielen. Allerdings bleiben ihre pathophysiologische Funktionen schlecht verstanden.

Die Quantifizierung von Chit1 und AMCase mRNA-Spiegel ist ein wichtiger Schritt in Richtung auf das Verständnis der in vivo
Regulierung von Chitinasen in Säugetieren. Wir stellten kürzlich eine quantitative PCR-System mit einem einzigen Standard-DNA unter Verwendung von zu quantifizieren und die Expressionsniveaus der Chitinase und Referenzgene auf derselben Skala [17] vergleichen. In unserer früheren Arbeit haben wir gezeigt, dass AMCase ein Haupttranskript in der Maus Magen und wird auf Niveaus exprimiert, die mit denen von Pepsinogen C vergleichbar sind [17].

Hier wandten wir unsere Methodik zur Quantifizierung von mRNA-Spiegel der Säuger Chitinasen in normalen menschlichen Geweben, die für das Verständnis ihrer pathologischen Rollen in erkrankten Geweben eine Voraussetzung ist. Darüber hinaus haben wir ein Quantifizierungssystem die mRNA-Konzentrationen von mehreren Genen zwischen einer Anzahl von menschlichen und Maus-Geweben unter Verwendung einer Mensch-Maus-Hybrid-DNA-Standard zu vergleichen. Unsere Studie zeigt, dass quantitativ Chit1 mRNA bei ähnlich hohen Niveau in normalen Menschen und der Maus Lunge exprimiert wird. Im Gegensatz dazu wird AMCase überwiegend in der Maus überexprimiert, aber nicht menschlichen Magen.

Ergebnisse |

Etablierung und Validierung eines Real-time PCR-System zum Nachweis von Chitinasen in menschlichen Geweben

wir haben festgestellt zuvor eine Echtzeit-PCR-System, das zur Bestimmung der mRNA-Konzentrationen der beiden Säugetier Chitinasen in Geweben der Maus und des Vergleichens diese Ebenen mit denen von Referenzgenen unter Verwendung der gleichen Skala fähig ist [17]. In dieser Studie wollten wir die Genexpressionsniveaus der Chit1 und AMCase Genen in normalen menschlichen Geweben (1A) zu vergleichen. Wie in Mausgeweben [17] verwendeten wir das Housekeeping-Gene Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und β-Actin als Referenzgene, da sie konstitutiv in hohen Konzentrationen in den meisten Zellen exprimiert werden [18]. Außerdem wählten wir Pepsinogen C als Referenzgens in den Magen (auch als progastricsin bekannt ist), da die Höhe der AMCase mRNA in der Maus Magen in den mRNA Pegel von Pepsinogen C vergleichbar war, die eine Hauptkomponente der Magenschleimhaut bildet [ ,,,0],19]. Unter Verwendung dieser drei Referenz Gene werteten wir die Genexpressionsniveaus Chit1 und AMCase in normalen menschlichen Geweben (1A).

Wir haben mehrere Sätze von Primern für die quantitative PCR und bewertet, um ihre Eignung basiert, ob sie zeigten eine Einzelschmelztemperatur (Tm) und eine einzelne Bande auf einem 10% Polyacrylamidgel [17]. Wie in Figur S1A-E gezeigt ist, weisen die Dissoziationskurven der fünf cDNAs nur einen Peak jeweils. Die Gel-Elektrophorese zeigte deutlich, einzelne Banden zu den erwarteten Größen für Chit1 (55 bp), AMCase (62 bp), GAPDH (57 bp), β-Aktin (57 bp) und Pepsinogen C (61 bp) (Abbildung S1F). Somit haben wir bestätigt, dass die korrekten PCR-Produkte aus dem menschlichen Gewebe-cDNA-Gemisch amplifiziert.

wir als nächstes eine Standard-Template-DNA für die Echtzeit PCR durch Ligieren der fünf Zielfragmente in einer Eins-zu-Eins-Verhältnis konstruiert (Abbildung 1B und Abbildung S2). Die 1396-Nukleotid langen Standard-Template-DNA bestand aus fünf cDNA-Fragmente, die das PCR-Zielregion und 60-143 Basen der flankierenden Regionen abgedeckt und enthielt Bgl
II, Sal
I, Xho
I und nicht
I-Restriktionsstellen (Abbildung 1B und Abbildung S2).

Die Quantifizierung sowohl der Chitinasen und den Referenz mRNAs beruht auf Standardkurven. Wir haben die Standardkurven, die real-time PCR Quantifizierung Strategien zu vergleichen und zu bewerten. Jede Standardkurve erzeugt wurde unter Verwendung von 10-fache Reihenverdünnungen des menschlichen Standard-DNA und die fünf verschiedenen Primerpaaren (Abbildung S3A-E, rote Kreise). Durch die Verwendung der Standard-Template-DNA, die die fünf menschlichen cDNA-Fragmente, die gleiche Menge an allen fünf Gene in jeder Verdünnung Verwendung zugewiesen werden, um die Standardkurven (Abbildung S3A-E, rot geschlossene Kreise).

zu konstruieren, zu testen die Gleichheit der Kurven wurde eine bekannte Konzentration des menschlichen gesamte codierende cDNA amplifiziert und anschließend als eine unbekannte Probe analysiert. Dieser Test wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass jede getestete Verdünnung in der erwarteten Menge geführt. Wie in Abbildung S3A-E gezeigt, blau geschlossene Rauten wurden gleiche Mengen für jede getestete Verdünnung beobachtet; Diese wurden verwendet, um die Standardkurve zu konstruieren.

Die Quantifizierung von Low-Fülle-Transkripte und reichlich Transkripte uns erlaubt, die Empfindlichkeit und die Zuverlässigkeit der Echtzeit-PCR, was darauf hinweist, dass unsere Echtzeit-PCR-Methode bietet eine große zu validieren Dynamikbereich der Quantifizierung, hohe Genauigkeit und eine hohe Empfindlichkeit (Abbildung S3A-E). So sind unsere Echtzeit-PCR-Methode liefert zuverlässige Werte für die beiden menschlichen Chitinase-Gene und die drei menschlichen Referenzgene in der gleichen Größenordnung.

Die Expression von Chit1 und AMCase in normalen menschlichen Geweben

studieren Sie die in vivo
Regulation der Expression der humanen Chit1 und AMCase Gene wurde gesamt-RNA aus verschiedenen normalen menschlichen Geweben unter Verwendung einer quantitativen Echtzeit-PCR-Assays mit dem speziell Standard-DNA (Abbildung 1) analysiert. Die resultierenden Werte wurden in y-Achse (Abbildung 2 und Abbildung 3) pro 10 ng Gesamt-RNA als Moleküle exprimiert.

Sowohl Chit1 und AMCase mRNAs wurden in normalen menschlichen Geweben (2A und 2B) allgemein ausgedrückt. Die höchsten Chit1 mRNA wurden in menschlichen Lungen-, gefolgt von Milz, fötaler Leber und Thymus (2A) festgestellt. Die höchsten AMCase mRNA wurden in der Lunge, gefolgt von fötalem Gehirn, Leber, Schilddrüse und Herz (2B) detektiert. Obwohl AMCase mRNA bei außerordentlich hohen Niveaus in der Maus Magen exprimiert wurde [17], war ihr Expressionsniveau im menschlichen Magen viel niedriger als die in der Lunge, fötalen Gehirn, fötale Leber, Schilddrüse und Herz (2B). In anderen Geweben, sowohl die Chit1 und AMCase mRNAs wurden bei niedrigen ausgedrückt, aber leicht nachweisbaren Mengen gegenüber dem Hintergrund (2A und 2B).

Beim Vergleich mit AMCase mRNA-Spiegel wurde bei relativ höheren Ebenen Chit1 mRNA exprimierten in Milz und fötaler Leber. Im Gegensatz dazu ausgedrückt fetalen Gehirns, der Prostata und der Leber eine höhere Menge an AMCase mRNA als Chit1 mRNA (Abbildung 2).

Die Analyse der Expressionsniveaus von Chit1, AMCase, GAPDH, β-Aktin und Pepsinogen C mRNAs in Normale Menschliche Lunge und Magen-Gewebe

Da viele Studien über die Pathophysiologie von Säugetier Chitinasen wurden mit Lunge und Magen durchgeführt [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], verglichen wir die Expressionsniveaus der Chitinasen und der Referenz Gene in diesen beiden menschlichen Geweben. Die quantitativen Daten sind in Abbildung 3 Normalisieren des Chit1 Ebene bis 1,0, die relativen Expressionsniveaus von AMCase, GADPH und β-Actin-mRNAs in menschlichen Lungengewebe waren 0,8, 39 und 343, bzw. (3A) gezeigt. Die GAPDH und β-Actin-Gene sind bekannt Housekeeping Gene und konstitutiv in hohen Konzentrationen in den meisten Geweben exprimiert [18]. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Chit1 und AMCase mRNAs werden in ähnlichen Mengen in normalen menschlichen Lungengewebe exprimiert wird, obwohl die Chit1 Expressionsniveau viel niedriger als die der beiden Housekeeping-Genen war (vergleiche nicht-log Plot mit logarithmischen Darstellung in Abbildung 3).

Normalisieren des Chit1 Ebene auf 1,0 wurden die relativen Expressionsniveaus der AMCase, GAPDH, β-Aktin und Pepsinogen C in normalen menschlichen Magengewebe 1,5, 323, 1.736 und 3.962, bzw. (3B). Hier werden die Expressionsniveaus von sowohl Chit1 und AMCase waren viel niedriger als die von GAPDH und β-Actin. Obwohl Pepsinogen C mRNA stark in den menschlichen Magen Proben exprimiert wurde, war AMCase mRNA vergleichbar Chit1. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Chit1 und AMCase Expressionsniveaus in den menschlichen Geweben relativ niedrig sind, untersucht und dass die AMCase Expressionsniveau im Magen unterscheidet sich deutlich zwischen Mensch und Maus.

Etablierung und Validierung eines Quantifizierungssystem für Menschen- und Maus Chitinase mRNAs eine Mensch-Maus-Hybrid-DNA unter Verwendung

Wir nächstes versucht, die Expressionsniveaus der beiden Chitinasen zwischen Menschen und Mäusen im gleichen Maßstab zu vergleichen mit einer Echtzeit-PCR-System (4A). Wir konstruierten daher eine Mensch-Maus-Hybrid-Standard-DNA für Echtzeit-PCR durch die menschlichen und Maus Standard-Template-DNAs Ligatur (4B). Das resultierende 2305 Nukleotide langen DNA-Vorlage enthalten zehn cDNA-Fragmente, die das PCR-Zielregion und 9-143 Basen der flankierenden Regionen der humanen und murinen Gene (siehe Details in Abbildung S4) abgedeckt.

Die Validierungen der Standardkurve und der quantitativen PCR-System in Echtzeit wurden in Abbildung S5 Abbildung S6 und S7 Abbildung wie gezeigt durchgeführt. Reihenverdünnungen des Mensch-Maus-Hybrid-Standard-DNA wurden verwendet, um eine Standardkurve zu konstruieren. Jede Standardkurve wurde unter Verwendung von 10-fache serielle Verdünnungen der Standard-DNA und die fünf verschiedenen Primerpaaren (Abbildung S5A-E, rote Kreise) erzeugt. Durch die Verwendung der Standard-Template-DNA enthält, die fünf cDNA-Fragmente können gleiche Mengen an alle der fünf menschlichen Genen einzusetzendes human-spezifischen Primerpaare in jeder Verdünnung, die verwendet wurde, um die Standardkurven (Abbildung S5A-E, geschlossen rote Kreise zu konstruieren ). In ähnlicher Weise können gleiche Mengen an alle der fünf murine Gene (Abbildung S6A-E, lila geschlossene Dreiecke) zugeordnet werden.

, um die Gleichheit der Kurven zu testen, die eine bekannte Konzentration der gesamte codierende cDNA wurde amplifiziert und anschließend als eine unbekannte Probe analysiert. Gleiche Mengen der menschlichen gesamte codierende cDNAs für jede getestete Verdünnung beobachtet wurden; Diese Mengen wurden dann verwendet, um die Standardkurve (Abbildung S5A-E, blau geschlossen Rauten) zu konstruieren. In ähnlicher Weise wurden gleiche Mengen der Maus gesamte codierende cDNAs auch beobachtet (S6A-E, grüne Kreuze). Die Quantifizierung von Low-Fülle-Transkripte und reichlich Transkripten ermöglicht es uns, die Empfindlichkeit und die Zuverlässigkeit der Echtzeit-PCR zu bestätigen, was darauf hinweist, dass unsere Echtzeit-PCR-Methode einen großen Dynamikbereich von Quantifizierung bietet, hohe Genauigkeit und eine hohe Empfindlichkeit (Abbildung S5A- E und 6A-E).

Weiterhin sind die vier Linien (zwei Standardkurven und zwei Verdünnungskurven der bekannten Konzentrationen der humanen und murinen gesamte codierende cDNAs, respectively) überlappt (Fig S7A-E). So sind unsere Echtzeit-PCR-Verfahren liefert zuverlässige relative Werte für die vier Chitinase-Gene und die sechs Referenzgene (4B).

Vergleich von Chit1 und AMCase mRNA-Niveaus zwischen normalen humanen und Mausgeweben

Wir haben das menschliche Gesamt-RNA Master Panel II und die Maus Gesamt-RNA Master Panel (Clontech Laboratories) als Quellen der Gesamt-RNA für diese Studie. Es gibt vier Geweben (Lunge, Leber, Milz und Niere), die zwischen den humanen und Maus-Panels und in Bezug auf Asthma und Gaucher-Krankheit überlappen. Da es in der Chitinase-Expression in den Magen Gewebe prominente Unterschiede waren, haben wir uns auch auf den Ebenen der Expression dieser Chitinasen in anderen Verdauungsorgane, der Speicheldrüsen, Magen, Dünn- und Dickdarm zwischen Mensch und Maus. Wir quantifiziert und die Expressionsspiegel in diesen Geweben im Vergleich mit der Mensch-Maus-Hybrid-DNA-Standard (4B); die quantitativen Daten sind in Abbildung 5

Wir gezeigt, um die höchste Expressionsniveau von Chit1 mRNA in der Maus (aber nicht menschlich) Magen, durch menschliche Lungengewebe gefolgt gefunden. Insgesamt wurde Chit 1 mRNA in höheren Mengen in den menschlichen Geweben exprimiert als in den Mausgeweben mit Ausnahme von Magen (5A). Die höchste Expressionsniveau von AMCase mRNA war in der Maus Magen, gefolgt von Maus Speicheldrüse. In den anderen menschlichen und Mausgeweben wurden die AMCase mRNA-Spiegel niedrig in menschlichen Geweben (5B). Beide Chit1 und AMCase mRNA-Spiegel in Dünn- und Dickdarm waren sehr gering in menschlichen und Mausgeweben (Abbildung 5), die mit früheren Daten, die durch Northern Blotting einstimmten [6], [21].

Wir festgestellt, dass AMCase mRNA in geringen Mengen in normalen menschlichen Magen exprimiert wurde, wurde aber in der Maus Magen Gewebe (5B) stark exprimiert. So haben wir im Vergleich auch die Expressionsniveaus der Chitinasen und den Referenz Gene, die die cDNAs verwenden, die aus der Lunge und Magen Gewebe hergestellt.

Normalisieren des menschlichen Chit1 Ebene im Lungengewebe bis 1,0, die relativen Expressionsniveaus der Maus Chit1 wurden humane und Maus AMCase AMCase mRNAs 0,3, 0,3 bzw. 7 (6A). Murine AMCase wurde in der Maus-Lunge stark exprimiert. Die Höhe der Chit1 mRNA in der menschlichen Lunge war etwa 3-fach höher als die in Mauslunge. Die Chit1 und AMCase mRNA-Spiegel waren signifikant niedriger als die Expressionsniveaus der GAPDH und β-Actin-Gene (6A).

Normalisieren des menschlichen Chit1 Ebene im Magen bis 1,0, die relativen Expressionsniveaus der Maus Chit1, der menschliche AMCase und die Maus AMCase mRNAs waren 10, 0,7 und 1,978 bzw. (6B). Pepsinogen C ist ein Hauptverdauungsenzym im Magen. Das Expressionsniveau von AMCase bei Mäusen war viel höher als die von GAPDH und β-Aktin und war vergleichbar mit dem Niveau von Pepsinogen C, während der menschliche Magen ein sehr niedriges Niveau von AMCase mRNA-Expression aufwiesen. Die relativen Expression von mRNA in der Menschen und der Maus Magen waren 1,0 und 2826, beziehungsweise.

Um herauszufinden, ob die mRNA-Ebene Unterschiede zwischen Maus zu überprüfen und Mensch auf Proteinebene reflektiert wurden, wir enzymatische Aktivität nächste analysiert dieser Chitinasen in den Magen Gewebe. Wir analysierten ersten AMCase Aktivität in Maus und Mensch Magen Gewebe. Die Maus AMCase zeigt ein duales pH-Optimum mit einem großen Optimum um pH 2 und einem sekundären Optimum um pH 5 [6], wohingegen menschliche AMCase zeigt breiten optimalen pH bei pH 5 2~pH [16], [24]. Somit wir chitinolytischen Aktivität bei pH 2,0 und pH 5,0 unter Verwendung des synthetischen Substrats 4-Methylumbelliferyl-β-D-N, N'-Diacetylchitobiose (4MU-Chitobiose) gemessen [6], [21]. Wir haben festgestellt robuste chitinolytisches Aktivität in der Maus Magen-Extrakt bei pH 2,0 und eine starke Aktivität bei pH 5,0. Im Gegensatz dazu wurde, dass der Mensch bei pH 2,0 und eine sehr geringe Aktivität wurde beobachtet, bei pH 5,0 (7A, links).

Der Standard Chit1 enzymatischen Test 4-Methylumbelliferyl keine Aktivität erkannt β- unter Verwendung wurde DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-Chitotriose) bei pH 5,2 [6], [10], [21], [25]. Um die Wirkung von AMCase auf Chit1 Aktivität überwachen, analysierten wir die Chitinaseaktivität mit 4 MU-chitotriose bei pH 2,0. Relativ starke Chitinase-Aktivität gegen 4MU-Chitotriose wurde bei pH-Wert im Magen der Maus Extrakt nachgewiesen 2,0 (7A rechts), und wir auch schwach Chitinase-Aktivität bei pH 5,2 (7A rechts) detektiert. Da AMCase ein zweites Optimum bei etwa pH 5, zeigen diese Ergebnisse, dass die meisten von chitinolytischen Aktivität bei pH 5,2 kann AMCase anstatt Chit1 und dass Maus AMCase zurückzuführen sein könnte 4MU-Chitotriose als Substrat bei pH 2,0 hydrolysiert. Insgesamt führte die Mehrheit der Chitinase-Aktivität in der Maus Magen aus AMCase Aktivität. Im menschlichen Magen-Extrakt wir auch sehr schwache, aber nachweisbare Mengen an chitinolytisches Aktivität bei pH 2,0 und pH 5,2 (7A, rechts, unteres Bild) beobachtet. Chitinase-Aktivität bei pH 5,2 war vergleichbar zu der bei pH 2,0, was darauf hinweist Chit1 Expression in menschlichen Magen.

Schließlich haben wir analysiert, um die Niveaus der Proteinexpression durch Western-Blotting unter Verwendung von Antikörpern gegen AMCase. Die anti-AMCase Antikörper wurden gegen die zuvor berichtet Maus Peptid [14] und menschliche Gegenstück. Anti-Maus-Antikörper erkannt AMCase eine robuste einzelne Proteinbande in Extrakt aus der Maus Magen, aber nicht von Mensch (7B, links). In ähnlicher anti-human Antikörper erkannt AMCase auch eine einzelne Bande in der Maus Extrakt (7B, rechts). Im menschlichen Extrakt gab es schwache Banden von etwas höheren Molekulargewicht, die sowohl von Human- und Maus-Antikörper (7B) erkannt wurden. Da gibt es entweder keine signifikante Chitinase Aktivität bei pH 2,0 oder 5,0 überwacht pH von 4 MU-chitobiose im menschlichen Magen-Extrakt verwenden, könnten diese Bänder nicht für den menschlichen AMCase bezogen werden. Folglich waren chitinolytisches Aktivitäten und die relative Proteinexpressionsniveaus zwischen Maus und menschlichen Magen Gewebe im Einklang mit unseren Daten auf mRNA-Ebene erhalten.

Diskussion

Frühere Studien über die in vivo
Regulierung der Chit1 und AMCase in Mensch und Maus wurden durchgeführt unter Verwendung von Northern-Blotting, semi-quantitative PCR und real-time PCR [6], [8], [9], [13], [14], [22] [23]. Obwohl diese Verfahren mehrere Vorteile gegenüber der Prüfung von Genexpressionsmustern haben, konnten sie die Pegel der verschiedenen Gentranskripten im gleichen Maßstab zu vergleichen. In der aktuellen Studie verwendeten wir unsere Methodik [17], um die Expressionsniveaus dieser Chitinasen in menschlichen Geweben zu untersuchen. Darüber hinaus ist die Expression von Chitinasen in der Human- und Mausgeweben zu bewerten, haben wir ein Quantifizierungssystem eine einzelne Mensch und Maus-Hybrid Standard-DNA verwendet wird. Wir haben gezeigt, Gewebe- und speziesspezifische Expression der beiden Säugetier aktiven Chitinasen, Chit1 und AMCase. Unsere Daten unterstützt generell früheren Studien von Boot-et al [6], [21]. Allerdings ist unsere Analyse ausreichend empfindlich mRNA zu erkennen und bietet einen umfassenden Überblick über die Genexpressionsmuster der Chitinasen in der Human- und Mausgeweben in der gleichen Größenordnung.

Eine spürbare charakteristisch für die Expression der Säugetier-Chitinasen ist die konservierte Expression von Chit1 zwischen Lungengewebe von Mensch und Maus. Wir fanden, dass Chit1 auf relativ hohem Niveau in Mensch und Maus Lungengewebe exprimiert wurde, die mit einander fast vergleichbar waren, was darauf hinweist, dass das Expressionsniveau der Chit1 mRNA konserviert ist. In der Lunge, Chitin enthaltenden Krankheitserreger wie Pilze und Milben [25] schützt vor Chit1 können als Teil des Abwehrsystems handeln, die. Die Erhaltung der Chit1 Genexpression bei Menschen und Mäusen schlägt vor, die physiologische Bedeutung von Chit1 in der Lunge.

Die Expression von Chitinasen im Magen ist von besonderem Interesse. AMCase mRNA wird bei außerordentlich hohen Mengen in den Mäusemagen synthetisiert, aber nicht im menschlichen Magen (6B). Der Vergleich dieser Expressionsniveaus zeigten, dass die AMCase mRNA-Ebene im menschlichen Magen etwa 1 /2.800 davon in der Maus Gegenstück war. Wir haben bestätigt, dass die Expression von Pepsinogen C mRNA und die beiden Housekeeping-Gene waren sehr hoch in den Menschen und der Maus Magen Gewebe (6B). Somit ist die verringerte Expression von AMCase mRNA im menschlichen Magen aufgrund RNA-Abbau während der cDNA-Präparation. Des Weiteren fanden wir, dass Maus Magen große Menge an AMCase ausgedrückt, wohingegen das menschliche Gegenstück nicht (Abbildung 7). Diese Ergebnisse zeigen, dass das Expressionsniveau des AMCase in den Magen Gewebe unterscheidet sich deutlich zwischen Menschen und Mäusen.

Der Magen ist ein wichtiges Organ, das grundlegende Rolle bei der Verdauung von Nahrungsmitteln und Schutz gegen Schadorganismen spielt. Salzsäure wird in den Magen sezerniert wird, sauren Bedingungen zu schaffen (pH = ~ 2) geeignet für die Verdauung von Proteinen durch Pepsin [19], [26]. Murine AMCase zeigt tiefe Stabilität Säure und ist sehr aktiv bei etwa pH 2 [6]. Die Maus Magen produziert eine enorme Menge an AMCase mRNA [17] und sein Translationsprodukt (Abbildung 7). Folglich kann AMCase als Verdauungsenzym-Funktion, die Chitin-haltige Lebensmittel in der Maus Magen bricht.

Im Gegensatz dazu ist die Expression von AMCase mRNA und sein Produkt relativ niedrig waren im menschlichen Magen (Abbildung 5, Figur 6 und Figur 7). Dies ist nicht unerwartet, weil der moderne Mensch nicht essen eine erhebliche Menge an Chitin haltigen Lebensmitteln. Diese Ergebnisse legen nahe, dass AMCase keine Rolle bei der Abwehr von Chitin haltigen Organismen im menschlichen Magen spielen können. Viele Magen-Krankheiten sind mit einer Infektion durch exogene Organismen verbunden. Die Schwere der Gastritis-assoziierten Infektionen wie Helicobacter pylori
mit der Aktivität von endogenen Enzyme korrelieren kann [23]. Es bleibt also die Frage umstritten, ob das niedrige Niveau der AMCase im menschlichen Magen in der Antwort auf Magenerkrankungen beteiligt.

Ein hohes Maß an chitinolytisches Aktivitäten wurden in Extrakten von Maus Magen und Darm nachgewiesen [6] . Da es in den Ebenen der Chitinase-Expression in den Magen zwischen Mensch und Maus prominente Unterschiede sind, untersuchten wir die Expressionsniveaus dieser Chitinasen in anderen Verdauungsorganen, einschließlich Speicheldrüsen und Dünn- und Dickdarm. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl Chit1 und AMCase mRNA-Spiegel in Dünn- und Dickdarm in menschlichen und Mausgeweben sehr niedrig waren, obwohl Mausspeicheldrüse und Magen hohe beiden Chitinasen mRNAs hergestellt (Abbildung 5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Säuger-Chitinase Proteine ​​in den Maus-Darm wahrscheinlich von den oberen Teilen des Verdauungstraktes ableiten, wie Speicheldrüsen und des Magens, die mit dem Stand der Begriff durch Stiefel et al konsistent ist [6], [21].

die Expressionsniveaus des Chit1 Gens in Lungengewebe zwischen Mensch und Maus konserviert. Im Gegensatz dazu ist der Expressionsspiegel des AMCase in Magengewebe artspezifisch. Die Ergebnisse legen nahe, daß die Regulation der Expression von Chiti1 mRNA in der Lunge während der Evolution konserviert worden ist, während die verringerte Expression AMCase im menschlichen Magen könnte das Ergebnis von Gen-Silencing sein. Die Untersuchung der Regulation der Expression dieser Säugetier Chitinasen könnte Einblick in die pathophysiologische Rolle dieser Enzyme geben. Eine detaillierte Charakterisierung der Promotorregionen der Chit1 und AMCase Gene und die Identifizierung des cis
- und trans -wirkenden
Faktoren werden für das Verständnis der selektiven Genexpression von diesen erforderlich Chitinasen in Menschen und Mäusen.

Die Expression von Chit1 und AMCase mRNAs unter verschiedenen pathologischen Zuständen induziert. Mit Hilfe der quantitativen hier beschriebenen System, werden wir die Chitinase mRNA-Levels in humanen und murinen Geweben durch real-time PCR vergleichen können. Diese Analyse wird das Verständnis der biologischen Funktion dieser Chitinasen, insbesondere in den pathophysiologischen Untersuchungen der menschlichen Krankheit mit murine Modelle unterstützen. Unsere Methode ist für die Quantifizierung der mRNAs von mehreren Genen von Mensch und Maus-Proben der gleichen Skala. Eine praktische Anwendung dieser vergleichenden artübergreifende Genexpressionsdaten ist der Vergleich von menschlichen Krankheiten, die mit Maus und Zellkulturmodellen.

Materialien und Methoden

RNA und cDNA-Präparation

der menschliche Gesamt-RNA Master Panel II und die Maus Gesamt-RNA Master Panel (Clontech Laboratories) wurden verwendet, um die Verteilung von Transkripten in verschiedenen Geweben zu untersuchen. Menschlicher Dünndarm Gesamt-RNA wurde von Clontech Laboratories. Zusätzlich wurde RNA aus der Speicheldrüse und Dünn- und Dickdarm von 3 Monate alten männlichen Mäusen isoliert. C57BL /6J-Mäusen (CLEAR Japan) wurden am RIKEN Brain Science Institute Tierhaltung gezüchtet. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche des RIKEN Brain Science Institute (Zulassung Nr H19-2B013) zugelassen. Alle Operation wurde unter Verwendung von Diethylether als Betäubungsmittel durchgeführt, und alle Anstrengungen unternommen wurden, Leiden zu minimieren. Gewebe für die mRNA-Herstellung wurden von Drs. Miyazaki und Nukina am RIKEN Brain Science Institute. Verwendung von TRIzol Reagent (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers Gesamt-RNA wurde aus der Speicheldrüse und Dünn- und Dickdarm hergestellt. Wir analysierten 21 verschiedenen menschlichen Geweben und acht erwachsenen Mausgeweben. Um Spuren von verunreinigenden genomische DNA, Gesamt-RNA-Proben wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit RQ1 RNase-freie DNase (Promega) behandelt entfernen. Jede der Gesamt-RNA-Proben wurde einer reversen Transkription unter Verwendung von Zufallshexameren als Primer, wie bereits berichtet [17].

Real-time PCR

Die Einrichtung und Validierung der in Echtzeit PCR System für menschliche Gewebe wurden wie beschrieben durchgeführt [17]; Die einzige Ausnahme war die Verwendung von menschlichen Primern. Die Nucleotidsequenzen der Primer, die für die Echtzeit-PCR für den menschlichen System ausgewählt wurden, sind in Tabelle S1 gezeigt. Jede Probe wurde in dreifacher Ausfertigung verstärkt, und jeder Versuch wurde mindestens zweimal wiederholt.

Der Bau der Menschen Standard-DNA und Vorbereitung von fünf menschlichen cDNAs, die den gesamten kodierenden Region

Der Bau der Standard-Template-DNA für den menschlichen Genen und die Herstellung der fünf menschlichen cDNAs, die die gesamte codierende Region bedeckt wurden im wesentlichen wie beschrieben durchgeführt [17]; Die einzige Ausnahme war die Verwendung von menschlichen Primern. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind in Tabelle S2 aufgeführt. Die PCR-Produkte wurden mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert. Die ligierten Fragmente wurden unter Verwendung des Vorwärtsprimers 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 amplifiziert 'und der Umkehrprimer 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' und kloniert in den pGEM-T leicht Vektor (Promega). Die verifizierten Sequenzen der cDNAs sind in Abbildung S2 gezeigt. Nein.

• PLoS ONE: Magen Temperaturaufzeichnungen Reveal Pflegeverhalten und Übergang auf feste Nahrung Verbrauch in einem unweaned Säugetier, das Harbour Seal Pup (Phoca vitulina)
• PLoS ONE: Serum Apolipoproteins CI und C-III in Magen-Krebs-Patienten zu reduzieren: Ergebnisse von MALDI-Based Peptidoms und Immuno-Based Clinical Assays