Ploche ONE: Kvantifikácia chitinasy mRNA hladiny u človeka a myši tkanív real-time PCR: Druhovo špecifická expresia kyslé cicavcov chitinázy v žalúdku Tissues

abstraktné

chitinasa hydrolyzuje chitín, ktorý je N
acetyl-D-glukosamín polymér, ktorý je prítomný v širokom spektre organizmov, vrátane hmyzu, húb a parazitov. Hoci cicavce neobsahujú endogénne chitín, ľudia a myši vyjadriť dva aktívne chitináz, chitotriosidázu (Chit1) a kyslá cicavčie chitinázy (AMCase). Vzhľadom k tomu, úroveň expresie týchto chitinas je v mnohých zápalových stavov, vrátane Gaucherovej choroby a myšiach modeloch astmy zvýšil, a to ako chitinázy môže hrať dôležitú úlohu v pathophysiologies týchto a ďalších chorôb. Nedávno sme založili kvantitatívny PCR systém pomocou jediného štandardného DNA a ukázal, že AMCase mRNA sa syntetizuje za mimoriadne vysokých hladinách v myšiach žalúdočných tkanivách. V tejto štúdii sme použili túto metodiku pre kvantifikáciu chitinázy mRNA v ľudských tkanivách, a zistilo sa, že obe chitinasy mRNA boli široko exprimovaný v normálnych ľudských tkanivách. Chit1 mRNA bol vysoko exprimovaný v ľudských pľúcach, zatiaľ čo AMCase mRNA nebola nadmerne exprimovaný v normálnych ľudských tkanivách žalúdka. Hladiny týchto mRNA v ľudských tkanív boli výrazne nižšie než hladiny domácnosti génov. Vzhľadom k tomu, hladiny AMCase expresie boli úplne odlišné medzi človekom a myšou žalúdočných tkanivách, sme vyvinuli systém, kvantitatívne PCR pre porovnávanie úrovní mRNA medzi ľudskými a myšími tkanivami s použitím ľudsko-myšia hybridná štandardné DNA. Naša analýza ukázala, že Chit1 mRNA je exprimovaný na podobnej úrovni v normálnej ľudskej a myší pľúc. Na rozdiel od toho AMCase hladina expresie v ľudskom žalúdku bola výrazne nižšia, než je úroveň expresie pozorované u myší žalúdka. Tieto rozdiely medzi mRNA ľudských a myších žalúdočných tkanivách boli odrážajú rozdiely v chitinolytických aktivít a úrovne expresie proteínu. To znamená, že hladina expresie AMCase v žalúdku je druhovo špecifický

Citácia :. Ohno M, Y Togashi, Tsuda K, K Okawa, kāmāya M, Sakaguchi M, et al. (2013) Kvantifikácia chitinasy mRNA hladiny u človeka a tkanivách myši pomocou real-time PCR: Druhovo špecifická expresia kyslé cicavcov chitinázy v žalúdku tkanivách. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10,1371 /journal.pone.0067399

Editor: Emiko Mizoguči, Massachusetts General Hospital, United States of America

prijatá: 05.01.2013; Prijaté: 15.května 2013; Uverejnené: 27. júna 2013

Copyright: © 2013 Ohno et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený projekt výskumný grant z výskumného ústavu vedy a techniky, Kogakuin univerzity. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Chitín, čo je polymér N
acetyl-D-glukosamín, je druhý najhojnejšia polysacharid v prírode [1]. Je neoddeliteľnou súčasťou exoskeletons kôrovcov a hmyzu, sa mikrofilariálními puzdier parazitických hlíst a hubové bunkové steny [1], [2].

chitinázy sú enzýmy, ktoré pomáhajú tráviť chitín polymér. Hoci cicavce neprodukujú chitín, ľudia a myši majú dva gény, ktoré kódujú aktívne chitináz, chitotriosidázu (Chit1) a kyslé cicavčie chitinázy (AMCase) [2], [3]. Chit1 bol prvý cicavčie chitinázy, ktoré majú byť čistené a klonované [4], [5]. AMCase, ktorá je druhou najaktívnejšou chitinasy u cicavcov, bol identifikovaný ako vyrovnávacia enzýmom Chit1 a pomenovaný pre jeho optimálne aktivity v kyslom prostredí [6].

Oba enzýmy vykazujú sekvenčné homológie s bakteriálnou chitinas a patrí rodina 18 glykozylované hydroláz, ktorý tiež zahŕňa chitinasy podobné proteíny, ktoré majú podobnú štruktúru, ale nemajú chitinas chitinolytických aktivitu [2], [3]. Myšou AMCase vykazuje sekvenčné homológie s Chit1, s identitou 52% a 60% podobnosť [6]. Geometrické miesto ľudského génu Chit1 sa nachádza na chromozóme 1q32 [7], zatiaľ čo ľudský gén AMCase je umiestnený na chromozóme 1p13 [6]. Oba gény sú zložené z 12 exónov a kóduje rôzne izoformy zostrihu [6] - [9]. Sekvencia homológie a zachovanie intronom-exon hranice medzi génmi Chit1 a AMCase naznačujú, že tieto gény vznikli z duplikácie rodového génu [3], [6].

Nedávne štúdie ukázali vzťahy medzi expresie cicavčích chitináz a zápalových stavov. Napríklad hladiny Chit1 sú zvýšené v plazme pacientov s Gaucherovou chorobou, v tekutine získané bronchoalveolárnej lavážou fajčiarov a u pacientov s chronickou obštrukčnou pľúcnou choroby (CHOCHP) a CSF u pacientov s Alzheimerovou chorobou [9] - [12] , AMCase expresie a aktivity sú up-regulované v priebehu alergických reakcií dýchacích ciest v myšiach modeloch astmy [13]. Polymérna chitín indukuje AMCase expresiu a získavanie imunitných buniek, ktoré sú spojené s alergiou a astmy [14]. Navyše, niekoľko genetických variantov AMCase sú spojené s bronchiálnou astmou u ľudí [15], [16]. Tieto výsledky jasne ukazujú, že chitinolytických enzýmy hrajú dôležitú úlohu v reakcii na ochorenia. Avšak, ich patofyziologické funkcie zostávajú zle pochopený.

Kvantifikácia Chit1 a hladiny mRNA AMCase je dôležitým krokom k pochopeniu in vivo
reguláciu chitinas u cicavcov. Nedávno sme založili kvantitatívny PCR systém pomocou jediného štandardného DNA kvantifikovať a porovnať úrovne expresie chitinasy a referenčných génov v rovnakom rozsahu [17]. V našom predchádzajúcom príspevku sme ukázali, že AMCase je hlavný prepis v žalúdku myšou a vyjadruje sa na úrovniach, ktoré sú porovnateľné s tými, pepsinogén C [17].

Tu sme aplikovali náš metodológiu pre kvantifikáciu hladiny mRNA cicavčích chitinas v normálnych ľudských tkanivách, čo je predpokladom pre pochopenie ich patologických úloha v chorých tkanivách. Ďalej sme založili kvantifikácie systém pre porovnávanie úrovní mRNA niekoľkých génov medzi niekoľkými ľudských a myších tkanív použitím humánnej-myšou hybridný štandardné DNA. Naša štúdia ukazuje, že kvantitatívne Chit1 mRNA je exprimovaný na podobne vysokej úrovni v normálnych ľudských a myších pľúc. Naproti tomu AMCase prevažne nadmerne vystavený u myší, ale nie ľudskom žalúdku.

Výsledky

Vznik a validácie real-time PCR systém pre detekciu chitinázy v ľudských tkanivách

sme predtým stanovené PCR systém v reálnom čase, ktorá je schopná určenie hladín mRNA dvoch cicavčích chitinas v myšiach tkanivách a porovnanie týchto hladín sa ti referenčných génov s použitím rovnakého mierky [17]. V tejto štúdii sme chceli porovnaní hladín génovej expresie génov Chit1 a AMCase cez normálnych ľudských tkanív (Obrázok 1A). Rovnako ako v myšiach tkanivách [17], sme použili dehydrogenázu housekeeping génov glyceraldehyd-3-fosfát (GAPDH) a beta-aktínu ako referenčné gény, pretože sú konštitutívne exprimované vo vysokých úrovniach vo väčšine buniek [18]. Okrem toho sme vybrali pepsinogénu C (tiež známy ako progastricsin) ako referenčný gén v žalúdku, pretože úroveň AMCase mRNA v myšiam žalúdku bola porovnateľná s úrovňou mRNA pepsinogén C, ktorý tvorí hlavnú zložku žalúdočnej sliznice [ ,,,0],19]. Pomocou týchto troch referenčných génov, sme hodnotili hladiny génovej expresie Chit1 a AMCase v normálnych ľudských tkanivách (obr 1A).

Navrhli sme niekoľko sád primérov pre kvantitatívne PCR a hodnotí ich vhodnosť na základe toho, či vykazovali single teplota topenia (Tm) a jeden pás na 10% polyakrylamidovom géle [17]. Ako je znázornené na obrázku S1A-E, disociačná krivky piatich cDNA vykazujú iba jeden pík každý. Gélová elektroforéza jasne ukázali, jednotlivé pásy pri očakávanej veľkosti pre Chit1 (55 bp), AMCase (62 bp), GAPDH (57 bp), β-aktínu (57 bp) a pepsinogén C (61 bp) (obr S1F). Preto sme potvrdili, že správne PCR produkty boli amplifikované z cDNA ľudské tkanivá zmesi.

Ďalej sme skonštruovali štandardné templátové DNA pre PCR v reálnom čase ligácia piatich cieľových fragmentov v one-to-one pomeru (Obrázok 1B a obr S2). 1396-nukleotidov dlhá štandardné šablóna DNA sa skladal z piatich cDNA fragmentov, ktoré sa vzťahovalo na PCR cieľový región a 60-143 základní sprievodných regiónov a obsahoval BGL
II, Sal
I Xho
aj a Nie
restrikčné aj stránky (obrázok 1B a obrázok S2).

kvantifikácie oboch chitináz a referenčných mRNA sa opiera o štandardné krivky. Použili sme štandardné krivky porovnávať a vyhodnocovať real-time stratégií PCR kvantifikácie. Každé štandardná krivka bola vytvorená za použitia 10-násobného sériového riedenia ľudského štandardného DNA a päť rôznych párov primérov (obr S3A-E, červená uzavreté kruhy). Pomocou štandardného templátové DNA, ktorý obsahuje päť ľudských cDNA fragmenty, rovné množstvo možno priradiť k všetkým piatim génov v každom použití riedenie ku konštrukcii štandardnej krivky (obr S3A-E, červená uzavreté kruhy).

Pre testovanie rovnosť kriviek, čo je známa koncentrácia ľudského celú kódujúci cDNA bola amplifikovaná a následne analyzovať neznámej vzorky. Tento test bol vykonaný za účelom overenia, že každý testovaný riedenie za následok očakávané množstvo. Ako je znázornené na obrázku S3A-E, modré uzavreté kosoštvorce, boli pozorované rovnaké množstvo, pre každú testovanú zriedení; boli použité ku konštrukcii štandardnej krivky.

Kvantifikácia nízku hojnosti transkriptov a bohaté prepisy nám umožňuje overiť citlivosť a spoľahlivosť real-time PCR, čo ukazuje, že náš real-time PCR metóda ponúka veľkú dynamický rozsah kvantifikácia, vysokou presnosťou a s vysokou citlivosťou (obr S3A-E). Preto náš real-time PCR metóda poskytuje spoľahlivé hodnoty pre dve ľudské chitinasových génov a troch referenčných ľudských génov na rovnakom meradle.

Vyjadrenie Chit1 a AMCase v normálnych ľudských tkanivách

študovať in vivo
reguláciu expresie ľudských génov Chit1 a AMCase, celková RNA z rôznych normálnych ľudských tkanív bola analyzovaná pomocou kvantitatívnej real-time PCR sa špeciálne navrhnutý štandardnou DNA (Obrázok 1). Výsledné hodnoty boli vyjadrené ako molekuly na 10 ng celkovej RNA na osi y (obrázok 2 a obrázok 3).

Obaja Chit1 a AMCase mRNA boli široko exprimovaný v normálnych ľudských tkanivách (obr 2A a 2B). boli detekované najvyššiu úroveň Chit1 mRNA v ľudských pľúcach, slezine, a následne fetálnej pečeň a týmusu (obrázok 2A). boli detekované najvyššiu úroveň AMCase mRNA v pľúcach, a následne mozgu plodu, pečene, štítnej žľazy a srdce (obrázok 2B). Aj keď AMCase mRNA bola exprimované v mimoriadne vysokých koncentráciách v žalúdku myší [17], jej úroveň expresie v ľudskom žalúdku, bol oveľa nižší ako v pľúcach, mozgu plodu, fetálny pečeň, štítnej žľazy a srdce (obrázok 2B). V iných tkanivách, ako Chit1 a AMCase mRNA boli vyjadrené v nízke, ale ľahko detekovateľné hladiny nad pozadia (obrázok 2A a 2B).

V porovnaní s úrovňami AMCase mRNA, Chit1 mRNA bola exprimované v relatívne vyšších úrovniach v slezine a fetálnych pečeni. Naproti tomu, fetálny mozgu, prostaty a pečene vyjadril vyššie množstvo AMCase mRNA než Chit1 mRNA (obrázok 2).

Analýza expresných Úrovne Chit1, AMCase, GAPDH, beta-aktínu a pepsinogénu C mRNA v normálne ľudské pľúca a žalúdok Tkanivá

Pretože mnoho štúdií o patofyziológie cicavcov chitinas boli vykonané pomocou pľúca a žalúdok [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], sme porovnali hladiny expresie chitinas a referenčných génov v týchto dvoch ľudských tkanív. Kvantitatívne údaje sú uvedené na obrázku 3. normalizácii hladiny Chit1 na 1,0, relatívna úrovne expresie AMCase, GADPH, a p-Aktinová mRNA v ľudskej pľúcneho tkaniva boli 0,8, 39 a 343, v uvedenom poradí (obrázok 3A). GAPDH a p-Aktinová gény sú dobre známe housekeeping génov a sú konštitutívne exprimované vo vysokých úrovniach vo väčšine tkanív [18]. Naše výsledky ukazujú, že Chit1 a AMCase mRNA sú vyjadrené na podobnej úrovni v normálnej ľudskej pľúcneho tkaniva, aj keď hladina expresie Chit1 bola oveľa nižšia, než sú z oboch domácnosti génov (porovnať non-log pozemok s log pozemku na obrázku 3).

normalizácii hladiny Chit1 na 1,0, relatívna úrovne expresie AMCase, GAPDH, p-aktínu a pepsinogén C v normálnom ľudskom žalúdku tkaniva boli 1,5, 323, 1736 a 3962, v danom poradí (obrázok 3B). Tu sú hladiny expresie oboch Chit1 a AMCase boli oveľa nižšie ako GAPDH a p-aktínu. Aj keď pepsinogén C mRNA bol vysoko exprimovaný vo vzorkách ľudského žalúdka, AMCase mRNA bolo porovnateľné s Chit1. Tieto výsledky ukazujú, že hladiny expresie Chit1 a AMCase sú relatívne nízke v ľudských tkanivách skúmaná a že úroveň AMCase expresie v žalúdku sa výrazne líši medzi človekom a myšou.

Vznik a validácia vyčíslenie systému na ľudskú spotrebu a myš chitinasa mRNA pomocou ľudsko-myšia hybridná DNA

Ďalej sme sa snažili porovnanie hladín expresie týchto dvoch chitináz medzi ľuďmi a myši v rovnakej mierke s využitím systému, real-time PCR (Obrázok 4A). Preto sme skonštruovali ľudsko-myšia hybridný štandardné DNA pre real-time PCR naviazaním štandardné vzor DNA človeka a myš (Obrázok 4B). Výsledný 2305-nukleotidov dlhá šablóna DNA obsahovala desať cDNA fragmenty, ktoré sa vzťahovalo na PCR cieľový región a 9-143 základy obklopujúcimi oblasťami génov ľudských a myších (podrobnosti pozri obr S4).

validácia štandardné krivky a kvantitatívne PCR systému v reálnom čase boli vykonávané, ako je znázornené na obrázku S5, S6 a obr obr S7. Sériová riedenie medzi človekom a myšou štandardného hybridný DNA boli použité ku konštrukcii štandardnej krivky. Každé štandardná krivka bola vytvorená za použitia 10-násobného sériového riedenia štandardnej DNA a päť rôznych párov primérov (obr S5A-E, červené uzavreté okruhy). Pomocou štandardného templátové DNA, ktorý obsahuje päť cDNA fragmenty, rovné množstvo možno priradiť k všetkým piatim ľudských génov boli použité ľudské špecifických párov primérov v každom riedení, ktoré sa používajú na konštrukciu štandardnej krivky (obr S5A-E, red uzavreté kruhy ). Rovnako tak rovnaké množstvo možno priradiť k všetkým piatim myších génov (Obr S6A-E, fialové plné trojuholníky).

Ak chcete otestovať rovnosť kriviek, známu koncentráciu celej kódovacie cDNA bol zosilnený a následne analyzuje ako neznámej vzorky. Rovnaké množstvo ľudských celú kódujúce cDNA boli pozorované u každého testovaného riedenia; Tieto veličiny potom boli použité na konštrukciu štandardnej krivky (obr S5A-E, modrá zatvorené kosoštvorcov). Podobne boli tiež pozorované rovnaké množstvo myších celú kódujúci cDNA (obr S6A-E, zelené kríža). Kvantifikácia nízku hojnosti transkriptov a bohaté prepisy nám umožňuje overiť citlivosť a spoľahlivosť real-time PCR, čo ukazuje, že náš real-time PCR metóda ponúka veľký dynamický rozsah kvantifikácie, vysokou presnosťou a s vysokou citlivosťou (obr S5A- E a Obrázok 6A-E).

Okrem toho štyri riadky (dve štandardné krivky a dve riedenie krivky známych koncentrácií celú kódujúce cDNA ľudských a myšiach, v uvedenom poradí) v krytí (obr S7A-E). Preto náš real-time PCR metóda poskytuje spoľahlivé relatívnej hodnoty pre štyri chitinasových génov a na šiestich referenčných génov (Obrázok 4B).

Porovnanie Chit1 a AMCase mRNA úrovne medzi normálnym ľudským a myši tkanív

sme použili ľudské celkovej RNA majster panel II a myš celkovej RNA hlavný panel (Clontech Laboratories) ako zdroja celkovej RNA pre túto štúdiu. Existujú štyri tkanivách (pľúca, pečeň, slezina a obličky), ktoré prekrývajú medzi ľudskými a myšími panelov a súvisiace s astmou a Gaucherovej choroby. Vzhľadom k tomu, tam boli významné rozdiely v expresiu chitinasy v žalúdku tkanivách, sme tiež pozrel na úrovni vyjadrenia týchto chitinas v iných tráviacich orgánov, slinné žľazy, žalúdka, tenkého a hrubého čreva medzi človekom a myšou. kvantifikované sme porovnali hladiny expresie v týchto tkanivách za použitia humánne-myšou hybridný štandardné DNA (obrázok 4B); kvantitatívne údaje sú uvedené na obrázku 5.

Zistili sme, že najvyššie úrovne expresie mRNA v Chit1 myší (ale nie človek) žalúdka, nasledovaný ľudskej pľúcnom tkanive. Celkovo možno povedať, Chit 1 mRNA bola exprimovaný vo vysokých úrovniach v ľudských tkanivách ako v tkanivách myší s výnimkou žalúdka (Obrázok 5A). Najvyššia úroveň expresie mRNA AMCase bola u myší žalúdka, nasledovaný myšou slinné žľazy. V ďalších ľudských a myších tkanív, hladina AMCase mRNA boli nízke v ľudských tkanivách (obr 5B). Obe úrovne Chit1 a AMCase mRNA tenkého a hrubého čreva boli v oboch ľudských a myších tkanív veľmi nízka (obrázok 5), ktoré sú v súlade s predchádzajúcimi údajmi získanými Northern blotting [6], [21].

zistené, že AMCase mRNA bol exprimovaný v nízkych hladinách v normálnom ľudskom žalúdku, ale bol vysoko exprimovaný v myší žalúdočnej tkanive (obr 5B). Preto sme tiež v porovnaní úrovne expresie chitináz a referenčných génov s použitím cDNA, ktoré boli pripravené z pľúc a žalúdka tkanív.

normalizáciu ľudskej úrovne Chit1 v pľúcnom tkanive na 1,0, relatívna úrovne expresie myšieho Chit1, ľudský AMCase a myš AMCase mRNA boli 0,3, 0,3 a 7, v uvedenom poradí (obrázok 6a). Myšou AMCase bol vysoko exprimovaný v myší pľúcach. Hladina Chit1 mRNA v ľudských pľúcach bol asi 3-krát vyššie ako u myší pľúc. Hladiny Chit1 a AMCase mRNA boli výrazne nižšie ako hladiny expresie GAPDH a beta-aktínu génov (obrázok 6A).

normalizáciu ľudskej úrovne Chit1 v žalúdočných to1.0, relatívna hladiny expresie myšou Chit1, ľudský AMCase a myš AMCase mRNA boli 10, 0,7 a 1978, resp (obrázok 6B). Pepsinogén C je hlavný tráviaci enzým v žalúdku. Hladina expresie AMCase u myší oveľa vyššie ako GAPDH a p-aktínu, a bola porovnateľná s úrovňou pepsinogénu C, zatiaľ čo ľudský žalúdok vykazoval veľmi nízku úroveň expresie mRNA AMCase. Relatívna hladiny expresie mRNA v ľudskom a myšiam žalúdka boli 1,0 a 2826, resp.

S cieľom overiť, či rozdiely v úrovni mRNA medzi myšou a človekom sa prejavuje na úrovni proteínu, sme analyzovali ďalšie enzymatická aktivita týchto chitinas v žalúdku tkanivách. Najprv sme analyzovali AMCase aktivitu na myšiach a ľudských žalúdočných tkanivách. AMCase myš ukazuje dvojaký optimálne pH s veľkou optimom okolo pH 2 a sekundárne optimom okolo pH 5 [6], zatiaľ čo ľudský AMCase ukazuje široký optimálne pH pri pH 2 ~ pH 5 [16], [24]. Takto sme merali chitinolytických aktivity pri pH 2,0 a pH 5,0 za použitia syntetického substrátu 4-Methylumbelliferyl p-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Zistili sme, robustný chitinolytických aktivitu v žalúdku myší extraktu pri pH 2,0 a silnú aktivitu pri pH 5,0. Na rozdiel od toho žiadna aktivita bola detekovaná v tom, že z človeka na pH 2,0 a veľmi nízka aktivita bola pozorovaná pri pH 5,0 (obrázok 7A, vľavo).

Štandardné enzymatický test Chit1 bola vykonaná za použitia 4-Methylumbelliferyl β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) pri pH 5,2 [6], [10], [21], [25]. Ak chcete sledovať vplyv AMCase na Chit1 aktivitu, analyzovali sme chitinasy aktivitu pomocou 4MU-chitotriose pri pH 2,0. Bola zistená pomerne silný účinok proti chitinasy 4MU-chitotriose v žalúdku extrakte myši pri pH 2,0 (obrázok 7A vpravo), a tiež detekovaný slabý chitinázovou aktivitu pri pH 5,2 (obrázok 7A vpravo). Vzhľadom k tomu, AMCase má druhú optimálne pri pH približne 5, tieto výsledky ukazujú, že väčšina z chitinolytických aktivity pri pH 5,2, môže byť vzhľadom k AMCase skôr než Chit1 a že myši AMCase mohol hydrolyzovať 4MU-chitotriose ako substrátu pri pH 2,0. Dohromady, väčšina chitinasy aktivity v myšiam žalúdku výsledkom AMCase činnosti. V ľudskom žalúdku extrakte tiež pozorované veľmi slabé, ale detekovateľné hladiny chitinolytických aktivity pri pH 2,0 a pH 5,2 (obrázok 7A, vpravo, spodný panel). Chitinasy aktivity pri pH 5,2 bola porovnateľná s pri pH 2,0, čo znamená, Chit1 expresiu v ľudskom žalúdku.

Nakoniec sme analyzovali hladiny expresie proteínu metódou Western blot za použitia protilátok proti AMCase. Anti-AMCase protilátky boli generované proti predtým vykazovaných myšieho peptidu [14] a ľudský náprotivok. Anti-myšou protilátka AMCase rozpoznaný robustný jediný proteínový pás v extrakte z myšieho žalúdka, ale nie z človeka (obrázok 7B, vľavo). Podobne AMCase protilátka anti-human tiež rozpoznaný jediný pás v extrakte myší (obrázok 7B, vpravo). V ľudskom extraktu boli slabé pásy mierne vyššou molekulovou hmotnosťou, ktoré boli uznané ako ľudských a myších protilátok (obrázok 7B). Vzhľadom na to, že žiadny významný chitinasy aktivita buď pH 2,0 alebo pH 5,0 monitorovaná pomocou 4MU-chitobiose v ľudskom žalúdku extrakte, tieto skupiny by nemali byť v súvislosti s ľudským AMCase. V dôsledku toho chitinolytických aktivity a relatívnej úrovne expresie proteínu medzi myšími a ľudskými tkanivami žalúdka boli v súlade s našimi údajmi získanými na úrovni mRNA.

Diskusia

Predchádzajúce štúdie na in vivo
regulácia Chit1 a AMCase u človeka a myši boli vykonávané s použitím Northern blotting, semi-kvantitatívne PCR a PCR v reálnom čase [6], [8], [9], [13], [14], [22] [23]. Aj keď tieto metódy majú niekoľko výhod oproti skúmaní génovej expresie vzory, sa im nepodarilo porovnaní hladín rôznych génových transkriptov v rovnakej mierke. V tejto štúdii sme aplikovali metodike [17] na sledovanie hladín expresie týchto chitinas v ľudských tkanivách. Navyše k vyhodnoteniu expresných hladín chitináz v ľudských a myšacích tkanivách, sme vyvinuli kvantifikácia systém využívajúci jediného človeka a hybridné myši štandardné DNA. Ukázali sme tkanivo a druhová špecifická expresia dvoch cicavčích aktívnych chitinas, Chit1 a AMCase. Naše dáta všeobecne podporuje predchádzajúce štúdie hlásené Boot et al [6], [21]. Avšak naša analýza je dostatočne citlivý na detekciu mRNA a poskytuje komplexný prehľad o génovej expresie vzoroch chitinas v ľudských a myšacích tkanív v rovnakej mierke.

Jedna viditeľné charakteristické pre expresiu cicavčích chitinas je konzervovanými vyjadrením Chit1 medzi ľudskými a myšími pľúcnom tkanive. Zistili sme, že Chit1 bolo vyjadrené v relatívne vysokých hladinách v ľudských a myšiach pľúcnom tkanive, ktoré boli takmer porovnateľné navzájom, čo ukazuje, že hladina expresie mRNA Chit1 je zachovaná. V pľúcach, Chit1 môže pôsobiť ako súčasť obranného systému hostiteľa, ktorý chráni proti patogénom chitínu obsahujúce, ako sú huby a roztoče [25]. Zachovanie génovej expresie Chit1 u ľudí a myší naznačujú, fyziologický význam Chit1 v pľúcach.

Expresia chitinas v žalúdku, je predmetom osobitného záujmu. AMCase mRNA sa syntetizuje za mimoriadne vysokých koncentráciách v žalúdku myší, ale nie v ľudskom žalúdku (obrázok 6B). Porovnania týchto expresných hladín ukázalo, že úroveň AMCase mRNA v ľudskom žalúdku, bol asi 1/2800 v ktorej u myší náprotivok. Potvrdilo sa, že hladiny expresie mRNA pepsinogénu C a dve housekeeping gény boli veľmi vysoké v ľudskej a myší žalúdočné tkaniva (obrázok 6B). To znamená, že sa znížila hladina expresie AMCase mRNA v ľudskom žalúdku, nie je v dôsledku degradácie RNA počas prípravy cDNA. Ďalej sme zistili, že žalúdok myší vyjadrené veľké množstvo AMCase, zatiaľ čo ľudský náprotivok nie (Obrázok 7). Tieto výsledky naznačujú, že hladina expresie AMCase v žalúdku tkanivách sa významne líšia medzi ľuďmi a myši.

Žalúdok je dôležitý orgán, ktorý hrá zásadnú úlohu pri trávení potravín a ochrany proti škodlivým organizmom. Kyselina chlorovodíková je vylučovaná v žalúdku, vytváranie kyslých podmienok (pH = ~ 2) vhodné pre trávenie bielkovín pepsínom [19] [26]. Myšou AMCase ukazuje stabilitu kyseliny hlboký a je veľmi aktívna pri pH okolo 2 [6]. Žalúdok myš produkuje obrovské množstvo AMCase mRNA [17] a jeho prekladu produktu (obrázok 7). V dôsledku toho, AMCase môže fungovať ako tráviaci enzým, ktorý štiepi potraviny chitínu obsahujúce v myši žalúdku.

V kontraste, úroveň expresie mRNA AMCase a jeho výrobku je pomerne nízky v ľudskom žalúdku (obrázok 5, obrázok 6 a obrázok 7). To nie je nečakané, pretože moderné ľudia neje významné množstvo potravín, chitín obsahujúci. Tieto výsledky naznačujú, že AMCase nemusí hrať úlohu v obrane proti organizmom chitín obsahujúci v ľudskom žalúdku. Mnoho ochorení žalúdka sú spojené s infekciou vonkajšími organizmami. Závažnosť infekcie spojené s gastritídou, ako je Helicobacter pylori
koreluje s aktivitou endogénnych enzýmov [23]. Je teda zostane vecou debaty či nízka úroveň AMCase v ľudskom žalúdku sa podieľa na reakciu na ochorenia žalúdka.

Vysoká úroveň chitinolytických činností boli zistené v výťažky z myšieho žalúdka a čriev [6] , Vzhľadom na to, že sú výrazné rozdiely v hladinách expresie chitinasy v žalúdku medzi človekom a myšou, sme sa zaoberali hladín expresie týchto chitinas v iných tráviacich orgánov, vrátane slinných žliaz a tenkého a hrubého čreva. Naše výsledky naznačujú, že ako Chit1 a AMCase mRNA hladiny v tenkom a hrubom čreve boli v oboch ľudských a myších tkanív veľmi nízke, aj keď myš slinné žľazy a žalúdka produkoval vysoké úrovne oboch chitinas mRNA (obrázok 5). Tieto výsledky naznačujú, že cicavčie chitinázy proteíny v črevách myší sú pravdepodobne odvodený z hornej časti gastrointestinálneho traktu, ako je slinné žľazy a žalúdka, ktorý je v súlade s predchádzajúcim predstavou o Boot et al [6], [21].

expresné hladiny génu Chit1 v pľúcnom tkanive je udržiavaná medzi ľuďmi a myši. Naproti tomu hladina expresie AMCase v žalúdku tkanivách je druhovo špecifický. Tieto výsledky naznačujú, že regulácia expresie mRNA Chiti1 v pľúcach bola zachovaná v priebehu evolúcie, zatiaľ čo znížená expresia AMCase v ľudskom žalúdku môže byť výsledkom umlčania génu. Skúmanie regulácie expresie týchto cicavčích chitinas mohol dať nahliadnuť do patofyziologických roliach týchto enzýmov. Podrobný charakterizácia promotorových oblastí génov Chit1 a AMCase a identifikácia cis
- a bude potrebný pre trans
-acting faktory pre pochopenie selektívne génovej expresie z nich chitinasy u ľudí a myší.

expresie Chit1 a AMCase mRNA je indukovaná za rôznych patologických stavov. Použitie kvantitatívny systém tu popísaný, budeme môcť porovnať hladiny chitinázy mRNA naprieč ľudských a myších tkanív real-time PCR. Táto analýza bude pomáhať porozumenie biologickej funkcie týchto chitinas, najmä v patofyziologických štúdiu ľudských ochorení s použitím myších modelov. Naša metodika je použiteľná pre kvantifikáciu mRNA z rôznych génov, medzi ľudskými a myšími vzoriek s použitím rovnakého mierky. Praktické využitie tohto porovnávacieho cross-druhy génovej expresie údajov je porovnanie ľudských ochorení s myšou a bunkových kultúr modelov.

materiáloch a metódach

RNA a cDNA Príprava

The Human Celková RNA majster panel II a myš Celková RNA Hlavný panel (Clontech Laboratories) boli použité k preskúma rozdelenie prepisov v rôznych tkanivách. Tenkom čreve ľudského Celková RNA bola zakúpená od Clontech Laboratories. Okrem toho, RNA bola izolovaná z slinné žľazy a tenkého a hrubého čreva o 3 mesiace starých myších samcov. C57BL /6J (číre Japan) boli chované v Zariadenie Riken Brain Science Institute zvierat. Všetky pokusy na zvieratách boli vykonané v súlade s inštitucionálnymi smernicami. Protokol bol schválený Výborom pre etiku pokusov na zvieratách v Riken Brain Science Institute (Schválenie č H19-2B013). Všetky operácie bola vykonaná za použitia dietyléteru ako anestetikum, a bolo vyvinuté všetko úsilie, aby sa minimalizovalo utrpenie. Tkanivá na prípravu mRNA boli poskytnuté Drs. Miyazaki a Nukina na Riken Brain Science Institute. Celková RNA bola pripravená z slinné žľazy a tenkého a hrubého čreva za použitia TRIzolu Reagent (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu. Analyzovali sme 21 rôznych ľudských tkanív a osem dospelých myší tkaniva. Za účelom odstránenia stopových kontaminujúce genómovej DNA, celková RNA vzorky boli ošetrené RQ1 prosté RNázy DNázy (Promega) podľa odporúčania výrobcu. Každý zo všetkých vzoriek RNA sa podrobí reverznej transkripcii s použitím náhodných hexamérov ako priméry, ako bola popísaná skôr [17].

Real-time PCR

Zriadenie a validácia v reálnom čase PCR systém ľudských tkanív sa uskutočnili podľa opisu [17]; jedinou výnimkou bolo použitie ľudských primérov. Nukleotidové sekvencie primérov, ktoré boli vybrané pre real-time PCR pre ľudského systému sú uvedené v tabuľke S1. Každá vzorka bol zosilnený trojmo a každý experiment bol opakovaný aspoň dvakrát.

Výstavba DNA ľudského štandardné a príprava piatich ľudských cDNA pokrývajúce celý kódujúci región

Stavba štandardné šablóny DNA pre ľudské gény a príprave piatich ľudských cDNA, ktoré pokrývali celú kódujúci oblasť bola vykonaná v podstate ako je opísané [17]; jedinou výnimkou bolo použitie ľudských primérov. V vpred a vzad primery sú uvedené v tabuľke S2. Produkty PCR boli štiepené príslušnými reštrikčnými enzýmami a ligovány s použitím T4 DNA LIGÁZA. Ligované fragmenty boli amplifikovanej za použitia dopredný primer 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'a reverzné primer 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' a klonovaný do pGEM-T Easy vektora (Promega). Overené Sekvencia cDNA sú uvedené na obrázku S2. č.

• Ploche ONE: Žalúdok Teplotný Records Reveal ošetrovateľská Správanie a prechod na solídnej úrovni spotreby potravín v neodstaveným cicavec, Harbour tuleních mláďat (Phoca vitulina)
• Ploche ONE: Sérum apolipoproteínu C-I a C-III sú redukované v žalúdku pacientok s karcinómom: Výsledky MALDI-Based peptidomu a immuno-Based klinickej Testy