PLOS ONE: cuantificación de los niveles de ARNm de quitinasa en los tejidos humanos y de ratón por PCR en tiempo real: Expresión específica de la especie de mamífero ácida en el estómago quitinasa Tissues

Extracto

La quitinasa hidroliza la quitina, que es un N
polímero acetil-D-glucosamina que está presente en una amplia gama de organismos, incluyendo insectos, parásitos y hongos. Aunque los mamíferos no contienen quitina endógeno, seres humanos y ratones expresan dos quitinasas activas, chitotriosidasa (Chit1) y quitinasa de mamífero ácido (AMCase). Debido a que el nivel de expresión de estas quitinasas se incrementa en muchas condiciones inflamatorias, incluyendo modelos de enfermedad de Gaucher y de ratón de asma, los dos quitinasas pueden desempeñar papeles importantes en la fisiopatología de estas y otras enfermedades. Hemos establecido recientemente un sistema de PCR cuantitativa utilizando un único estándar de ADN y demostraron que AMCase ARNm se sintetiza a niveles extraordinariamente altos en los tejidos del estómago del ratón. En este estudio, se aplicó esta metodología para la cuantificación de ARNm de quitinasa en los tejidos humanos y se encontró que ambos mRNAs de quitinasa se expresan ampliamente en tejidos humanos normales. Chit1 mRNA fue altamente expresado en el pulmón humano, mientras que AMCase mRNA no se sobreexpresa en tejidos normales de estómago humanos. Los niveles de estos ARNm en tejidos humanos fueron significativamente más bajos que los niveles de los genes de limpieza. Debido a que los niveles de expresión AMCase eran muy diferentes entre los tejidos humanos y de ratón de estómago, hemos desarrollado un sistema de PCR cuantitativa para comparar los niveles de mRNA entre los tejidos humanos y de ratón utilizando un estándar de ADN híbrido humano-ratón. Nuestro análisis mostró que Chit1 ARNm se expresa en niveles similares en el pulmón humano y de ratón normal. Por el contrario, el nivel de expresión AMCase en el estómago humano fue significativamente más bajo que el nivel de expresión observado en el estómago de ratón. Estas diferencias de ARNm entre los tejidos del estómago humano y el ratón estaban reflejando diferencias en las actividades quitinolíticas y los niveles de expresión de la proteína. Por lo tanto, el nivel de expresión de la AMCase en el estómago es específico de la especie

Visto:. Ohno M, Y Togashi, Tsuda K, K Okawa, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) La cuantificación de los niveles de ARNm de quitinasa en los tejidos humanos y de ratón mediante PCR en tiempo real: Expresión específica de la especie ácida de mamíferos quitinasa en los tejidos del estómago. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10.1371 /journal.pone.0067399

Editor: Emiko Mizoguchi, el Hospital General de Massachusetts, Estados Unidos de América

Recibido: 5 de Enero, 2013; Aceptado: 15-may de 2013; Publicado: 27 Junio ​​2013

Derechos de Autor © 2013 Ohno et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Investigación de subvención del Instituto de Investigación de Ciencia y Tecnología de la Universidad Kogakuin. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

la quitina, que es un polímero de N
acetil-D-glucosamina, es el segundo polisacárido más abundante en la naturaleza [1]. Es un componente integral de los exoesqueletos de los crustáceos e insectos, las vainas microfilarial de nematodos parásitos y las paredes celulares de los hongos [1], [2].

Las quitinasas son enzimas que digieren el polímero de quitina. Aunque los mamíferos no producen quitina, seres humanos y ratones tienen dos genes que codifican quitinasas activas, chitotriosidasa (Chit1) y quitinasa de mamífero ácido (AMCase) [2], [3]. Chit1 fue la primera quitinasa de mamífero a ser purificado y clonado [4], [5]. AMCase, que es el segundo más activo quitinasa en los mamíferos, fue identificada como una enzima compensatoria para Chit1 y nombrado para su actividad óptima en condiciones ácidas [6].

Ambas enzimas exhiben una homología de secuencia de quitinasas bacterianas y pertenecen a familia 18 de glicosil hidrolasas, que también incluye las proteínas quitinasa-como que son estructuralmente relacionado con quitinasas, pero carecen de actividad quitinolıtica [2], [3]. El AMCase murino muestra homología de secuencia con Chit1, con una identidad de 52% y una similitud de 60% [6]. El locus del gen Chit1 humano se encuentra en el cromosoma 1q32 [7], mientras que el gen AMCase humano está localizado en el cromosoma 1p13 [6]. Ambos genes están compuestos de 12 exones y codifican diferentes isoformas de empalme [6] - [9]. La homología de secuencia y la conservación de los límites exón-intrón entre los genes y Chit1 AMCase sugieren que estos genes se presentan a partir de una duplicación de un gen ancestral [3], [6].

Estudios recientes han demostrado asociaciones entre la expresión de las quitinasas de mamíferos y afecciones inflamatorias. Por ejemplo, los niveles de Chit1 son elevados en el plasma de pacientes con la enfermedad de Gaucher, el fluido de lavado broncoalveolar de los fumadores y pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el líquido cefalorraquídeo de pacientes con la enfermedad de Alzheimer [9] - [12] . expresión y la actividad AMCase también están regulados por incremento durante las respuestas de las vías respiratorias alérgicas en modelos de ratón de asma [13]. quitina polimérica induce la expresión AMCase y el reclutamiento de células inmunes que están asociados con la alergia y el asma [14]. Además, varias variantes genéticas de AMCase están asociados con el asma bronquial en los seres humanos [15], [16]. Estos resultados sugieren fuertemente que las enzimas quitinolíticas juegan un papel importante en la respuesta a la enfermedad. Sin embargo, sus funciones fisiopatológicas siguen siendo poco conocidos.

La cuantificación de Chit1 y los niveles de ARNm AMCase es un paso importante hacia la comprensión de la in vivo
regulación de quitinasas en los mamíferos. Hemos establecido recientemente un sistema de PCR cuantitativa usando un ADN estándar para cuantificar y comparar los niveles de expresión de los genes de quitinasa y de referencia en la misma escala [17]. En nuestro trabajo anterior, hemos demostrado que AMCase es una transcripción importante en el estómago del ratón y se expresa en niveles comparables a los de pepsinógeno C [17].

A continuación, aplicamos nuestra metodología para la cuantificación de los niveles de mRNA de las quitinasas de mamíferos en los tejidos humanos normales, lo cual es un requisito previo para la comprensión de sus papeles patológicos en los tejidos enfermos. Además, hemos establecido un sistema de cuantificación para comparar los niveles de mRNA de múltiples genes entre una serie de tejidos humanos y de ratón utilizando un estándar de ADN híbrido humano-ratón. Nuestro estudio muestra cuantitativamente que Chit1 ARNm se expresa en niveles elevados similares en los pulmones humanos y de ratón normales. Por el contrario, se AMCase predominantemente sobreexpresa en el ratón, pero no el estómago humano.

Resultados

Establecimiento y validación de un sistema de PCR en tiempo real para la detección de quitinasas en los tejidos humanos

Hemos establecido previamente un sistema de PCR en tiempo real que es capaz de determinar los niveles de mRNA de los dos quitinasas de mamíferos en tejidos de ratón y de la comparación de estos niveles con los de los genes de referencia usando la misma escala [17]. En este estudio, hemos querido comparar los niveles de expresión génica de los genes Chit1 y AMCase través de los tejidos humanos normales (Figura 1A). Como en tejidos de ratón [17], se utilizó la deshidrogenasa genes de mantenimiento gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) y β-actina como genes de referencia, ya que se expresan constitutivamente a niveles altos en la mayoría de las células [18]. Además, elegimos pepsinógeno C (también conocido como progastricsin) como un gen de referencia en el estómago debido a que el nivel de AMCase mRNA en el estómago de ratón era comparable al nivel de ARNm de pepsinógeno C, que constituye un componente importante de la mucosa gástrica [ ,,,0],19]. El uso de estos tres genes de referencia, se evaluaron los niveles de expresión génica de Chit1 y AMCase en tejidos humanos normales (Figura 1A).

Hemos diseñado varios conjuntos de cebadores para la PCR cuantitativa y evaluamos su idoneidad en función de si presentaban una solo temperatura de fusión (Tm) y una única banda en un gel de poliacrilamida al 10% [17]. Como se muestra en la Figura S1A-E, las curvas de disociación de los cinco ADNc exhiben sólo un pico cada uno. La electroforesis en gel mostró claramente bandas individuales en los tamaños esperados para Chit1 (55 pb), AMCase (62 pb), GAPDH (57 pb), β-actina (57 pb) y pepsinógeno C (61 pb) (Figura S1F). Por lo tanto, se confirmó que los productos de PCR correctos fueron amplificados de la mezcla de ADNc de tejido humano.

A continuación construyó un ADN plantilla estándar para PCR en tiempo real mediante la ligación de los cinco fragmentos de destino en una relación uno-a-uno (Figura 1B y la Figura S2). El ADN molde estándar de 1.396 nucleótidos de longitud consistió en cinco fragmentos de ADNc que cubrían la región diana de PCR y 60-143 bases de las regiones de acompañamiento y contenía Bgl II
, Sal
I, Xho I y
No
sitios de restricción I (Figura 1B y Figura S2).

La cuantificación tanto de las quitinasas y los ARNm de referencia se basa en las curvas de calibración. Se utilizaron las curvas estándar para comparar y evaluar las estrategias de cuantificación de PCR en tiempo real. Cada curva estándar se generó utilizando 10 veces diluciones en serie del ADN estándar humano y los cinco pares de cebadores diferentes (Figura S3A-E, rojo círculos cerrados). Mediante el uso de la plantilla de ADN estándar que contiene los cinco fragmentos de ADNc humanos, la igualdad de cantidades se pueden asignar a los cinco genes en cada uso dilución para construir las curvas de calibración (Figura S3A-E, rojo círculos cerrados).

Para probar la igualdad de las curvas, una concentración conocida del ADNc de codificación entera humana se amplificó y posteriormente se analizó como una muestra desconocida. Este ensayo se realizó para verificar que cada dilución probada dio como resultado la cantidad esperada. Como se muestra en la Figura S3A-E, rombos cerrados azules, se observaron cantidades iguales para cada dilución probado; estos fueron utilizados para construir la curva estándar.

La cuantificación de los transcritos de baja abundancia y abundantes transcripciones nos permite validar la sensibilidad y fiabilidad de PCR en tiempo real, lo que indica que nuestro método de PCR en tiempo real ofrece una gran rango dinámico de cuantificación, de alta precisión, y alta sensibilidad (Figura S3A-e). Por lo tanto, nuestro método de PCR en tiempo real proporciona valores fiables para los dos genes de quitinasa humanos y los tres genes de referencia humanos en la misma escala.

Expresión de Chit1 y AMCase en tejidos normales humanos

Para el estudio de la in vivo
regulación de la expresión de los genes Chit1 y AMCase humanos, el ARN total de diversos tejidos humanos normales se analizó mediante un ensayo de PCR cuantitativa a tiempo real con el ADN estándar diseñado específicamente (Figura 1). Los valores resultantes se expresaron como moléculas por 10 ng de ARN total en el eje Y (Figura 2 y Figura 3).

Tanto Chit1 y AMCase mRNAs se expresan ampliamente en tejidos normales humanos (Figura 2A y 2B). Se detectaron los niveles más altos de ARNm en Chit1 de pulmón humano, seguido por el bazo, el hígado fetal y timo (Figura 2A). Se detectaron los niveles más altos de AMCase mRNA en el pulmón, seguido de cerebro fetal, el hígado, la glándula tiroides y el corazón (Figura 2B). Aunque AMCase mRNA se expresó en niveles extraordinariamente altos en el estómago de ratón [17], su nivel de expresión en el estómago humano fue mucho menor que los de pulmón, cerebro fetal, hígado fetal, la glándula tiroides y el corazón (Figura 2B). En otros tejidos, tanto el Chit1 y AMCase mRNAs se expresaron a baja, pero los niveles fácilmente detectables por encima del fondo (Figura 2A y la Figura 2B).

Cuando se compara con los niveles de ARNm de AMCase, Chit1 mRNA se expresó en niveles relativamente más altos en el bazo y el hígado fetal. Por el contrario, el cerebro fetal, próstata e hígado expresaron una mayor cantidad de ARNm de AMCase Chit1 ARNm (Figura 2).

Análisis de los niveles de expresión de Chit1, AMCase, GAPDH, β-actina y pepsinógeno C en los ARNm los tejidos normales de pulmón humano y el estómago

Debido a que muchos estudios sobre la fisiopatología de las quitinasas de mamíferos se han realizado utilizando los pulmones y el estómago [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], se compararon los niveles de expresión de las quitinasas y los genes de referencia en estos dos tejidos humanos. Los datos cuantitativos se muestran en la Figura 3. La normalización del nivel Chit1 a 1,0, los niveles relativos de expresión de AMCase, GADPH, y mRNAs beta-actina en el tejido pulmonar humano fueron 0,8, 39 y 343, respectivamente (Figura 3A). Los genes GAPDH y ß-actina son bien conocidos los genes de limpieza y se expresan constitutivamente a niveles altos en la mayoría de los tejidos [18]. Nuestros resultados indican que Chit1 y AMCase mRNAs se expresan a niveles similares en tejido pulmonar humano normal, aunque el nivel de expresión Chit1 era mucho menor que las de los dos genes de limpieza (comparar parcela no logarítmica con parcela de registro en la Figura 3).

al normalizar el nivel Chit1 a 1,0, los niveles relativos de expresión de la AMCase, GAPDH, β-actina y pepsinógeno C en el tejido del estómago humano normal fueron de 1,5, 323, 1.736 y 3.962, respectivamente (Figura 3B). Aquí, los niveles de expresión de ambos Chit1 y AMCase eran mucho más bajos que los de GAPDH y β-actina. Aunque pepsinógeno C mRNA fue altamente expresado en las muestras de estómago humano, AMCase mRNA fue comparable a Chit1. Estos resultados indican que los niveles de expresión y Chit1 AMCase son relativamente bajos en los tejidos humanos examinados y que el nivel de expresión AMCase en el estómago difiere significativamente entre humanos y de ratón.

Establecimiento y validación de un sistema de cuantificación para el ser humano y la quitinasa ratón ARNm utilizando un ADN híbrido humano-ratón

a continuación trató de comparar los niveles de expresión de los dos quitinasas entre los humanos y los ratones en la misma escala utilizando un sistema de PCR en tiempo real (Figura 4A). por lo tanto, se construyó un ADN patrón híbrido de ratón-humano para la PCR en tiempo real mediante la ligación de los ADN plantilla estándar humanas y de ratón (Figura 4B). La plantilla de 2.305 nucleótidos de longitud resultante de ADN contenía diez fragmentos de ADNc que cubrían la región diana de PCR y 9-143 bases de las regiones flanqueantes de los genes humanos y de ratón (ver detalles en la figura S4).

Las validaciones de la curva estándar y el sistema de PCR cuantitativa en tiempo real se realizaron como se muestra en la Figura S5, S6 Figura y la Figura S7. Las diluciones en serie del ADN estándar híbrido humano-ratón se utilizaron para construir una curva estándar. Cada curva estándar se ha generado utilizando 10 veces diluciones seriadas de ADN estándar y los cinco pares de cebadores diferentes (Figura S5A-E, círculos rojos cerrados). Mediante el uso de la plantilla de ADN estándar que contiene los cinco fragmentos de ADNc, la igualdad de cantidades se pueden asignar a todos los cinco genes humanos utilizando pares de cebadores específicos de los humanos en cada dilución que se utilizó para construir las curvas de calibración (Figura S5A-E, rojo cerró círculos ). Del mismo modo, la igualdad de cantidades se pueden asignar a todos los cinco genes murinos (Figura S6A-E, triángulos cerrados púrpura).

Para probar la igualdad de las curvas, una concentración conocida de la totalidad del ADNc que codifica y se amplificó posteriormente se analizó como una muestra desconocida. Las cantidades iguales de los ADNc que codifican enteras humanos fueron observados para cada dilución de la prueba; estas cantidades se utilizaron para construir la curva estándar (Figura S5A-E, azul rombos cerrados). Del mismo modo, cantidades iguales de los ADNc que codifican la totalidad de ratón también se observaron (Figura S6A-E, cruces verdes). La cuantificación de las transcripciones de baja abundancia y abundantes transcripciones nos permite validar la sensibilidad y fiabilidad de PCR en tiempo real, lo que indica que nuestro método de PCR en tiempo real ofrece un gran rango dinámico de cuantificación, de alta precisión y alta sensibilidad (Figura S5A- e y la Figura 6A-e).

Además, las cuatro líneas (dos curvas estándar y dos curvas de dilución de las concentraciones conocidas de los ADNc que codifican la totalidad de humanos y de ratón, respectivamente) se superponen (Figura S7A-e). Por lo tanto, nuestro método de PCR en tiempo real proporciona valores relativos fiables para los cuatro genes de quitinasa y los seis genes de referencia (Figura 4B).

Comparación de Chit1 mRNA y los niveles AMCase entre los tejidos normales humanos y de ratón

Se utilizó el ARN total humano Maestro Grupo II y del Grupo ratón ARN total Master (Clontech Laboratories) como fuentes de ARN total para este estudio. Existen cuatro tejidos (pulmón, hígado, bazo y riñón) que se superponen entre los paneles humanas y de ratón y relacionados con el asma y la enfermedad de Gaucher. Puesto que no había diferencias importantes en la expresión de quitinasa en los tejidos del estómago, también hemos buscado en los niveles de expresión de estos quitinasas en otros órganos del sistema digestivo, las glándulas salivares, estómago, intestino delgado y grueso entre humanos y de ratón. Hemos cuantificado y comparado con los niveles de expresión en estos tejidos que utilizan el estándar híbrido humano-ratón de ADN (Figura 4B); los datos cuantitativos se muestran en la Figura 5.

Encontramos el nivel de expresión más alto de Chit1 mRNA en el ratón (pero no humana) estómago, seguido de los tejidos pulmonares humanos. En general, Chit 1 mRNA se expresó en niveles altos en los tejidos humanos que en los tejidos de ratón excepto para el estómago (Figura 5A). El alto nivel de expresión de ARNm AMCase estaba en el estómago de ratón, seguido de la glándula salival del ratón. En los otros tejidos humanos y de ratón, los niveles de mRNA fueron AMCase baja en los tejidos humanos (Figura 5B). Ambos niveles de ARNm y Chit1 AMCase en intestino delgado y grueso eran muy bajos en ambos tejidos humanos y de ratón (Figura 5), ​​que fueron consistentes con los datos previos obtenidos por transferencia Northern [6], [21].

encontró que AMCase mRNA se expresó en niveles bajos en el estómago humano normal pero fue altamente expresado en los tejidos del estómago de ratón (Figura 5B). Por lo tanto, también se compararon los niveles de expresión de las quitinasas y los genes de referencia utilizando los ADNc que se prepararon a partir de los tejidos de los pulmones y el estómago.

normalizar el nivel Chit1 humano en el tejido pulmonar a 1,0, los niveles relativos de expresión del ratón Chit1, AMCase humano y de ratón AMCase mRNAs fueron 0,3, 0,3 y 7, respectivamente (Figura 6A). Murino AMCase fue altamente expresado en el pulmón de ratón. El nivel de Chit1 mRNA en el pulmón humano era aproximadamente 3 veces mayor que en pulmón de ratón. Los niveles de mRNA Chit1 y AMCase fueron significativamente más bajos que los niveles de expresión de los genes GAPDH y ß-actina (Figura 6A)
.

Al normalizar el nivel humano en Chit1 a 1,0 estómago, los niveles de expresión relativa del ratón Chit1, el AMCase humana y el ratón AMCase ARNm fueron 10, 0,7 y 1,978, respectivamente (Figura 6B). Pepsinógeno C es una enzima digestiva importante en el estómago. El nivel de expresión de AMCase en ratones era mucho más alto que los de GAPDH y β-actina y era comparable al nivel de pepsinógeno C, mientras que el estómago humano exhibe un nivel muy bajo de expresión AMCase mRNA. Los niveles relativos de expresión de ARNm en el estómago humano y el ratón fueron 1,0 y 2,826, respectivamente.

Con el fin de comprobar si las diferencias de nivel de ARNm entre el ratón y humano se reflejan a nivel de proteínas, A continuación analizaron la actividad enzimática de estos quitinasas en los tejidos del estómago. En primer lugar, analizamos la actividad AMCase en el ratón y tejidos del estómago humano. El AMCase ratón muestra un óptimo de pH dual con un importante óptimo alrededor de pH 2 y un óptimo de pH secundaria alrededor de 5 [6], mientras que AMCase humano muestra amplio pH óptimo a pH 2~pH 5 [16], [24]. Por lo tanto, se midió la actividad quitinolítica a pH 2,0 y pH 5,0 usando el sustrato sintético de 4-metilumbeliferil β-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-quitobiosa) [6], [21]. Se detectó actividad quitinolıtica robusta en el extracto de estómago de ratón a un pH de 2,0 y una fuerte actividad a pH 5,0. Por el contrario, no se detectó actividad en el de humano a pH 2,0 y se observó muy baja actividad a pH 5,0 (Figura 7A, izquierda).

El ensayo enzimático estándar Chit1 se ha realizado utilizando 4-metilumbeliferil β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-quitotriosa) a pH 5,2 [6], [10], [21], [25]. Para controlar el efecto de la actividad AMCase Chit1, analizamos la actividad quitinasa usando 4MU-quitotriosa a pH 2,0. Se detectó relativamente fuerte actividad quitinasa contra 4MU-quitotriosa en el extracto de estómago de ratón a pH 2,0 (Figura 7A derecha), y también detecta actividad quitinasa débil a pH 5,2 (Figura 7A derecha). Desde AMCase tiene un segundo óptimo a alrededor de pH 5, estos resultados indican que la mayor parte de la actividad quitinolítica a pH 5,2 puede ser debido a AMCase en lugar de Chit1 y que el ratón AMCase podría hidrolizar 4MU-quitotriosa como sustrato a pH 2.0. En conjunto, la mayoría de la actividad quitinasa en el estómago de ratón dio como resultado de la actividad AMCase. En el extracto de estómago humano también observamos niveles muy débiles pero detectables de actividad quitinolıtica a pH 2,0 y pH 5,2 (Figura 7A, la derecha, panel inferior). actividad quitinasa a pH 5,2 fue comparable a la que a pH 2,0, lo que indica la expresión Chit1 en el estómago humano.

Por último, se analizaron los niveles de expresión de la proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos contra AMCase. Los anticuerpos anti-AMCase fueron generados contra el péptido ya se ha informado de ratón [14] y su homólogo humano. AMCase anticuerpo anti-ratón reconoció una robusta banda de proteína única en el extracto de estómago de ratón, pero no de humano (Figura 7B, izquierda). Del mismo modo AMCase anticuerpo anti-humano también reconoció una banda única en el extracto de ratón (Figura 7B, derecha). En el extracto humana había bandas tenues de peso molecular ligeramente superior que fueron reconocidos por ambos anticuerpos humanos y de ratón (Figura 7B). Puesto que no había actividad quitinasa significativa a pH 2,0 o pH 5,0 monitoreado mediante el uso de 4MU-quitobiosa en el extracto de estómago humano, estas bandas no podrían estar relacionados con la AMCase humano. En consecuencia, las actividades quitinolíticas y los niveles relativos de expresión de proteínas entre el ratón y tejidos del estómago humanos fueron consistentes con nuestros datos obtenidos en el ARNm.

Discusión

Los estudios previos sobre el in vivo
regulación de Chit1 y AMCase en humanos y de ratón se llevaron a cabo utilizando transferencia Northern, PCR semi-cuantitativa y PCR en tiempo real [6], [8], [9], [13], [14], [22] , [23]. Aunque estos métodos tienen varias ventajas sobre el examen de patrones de expresión génica, no pudieron comparar los niveles de las diferentes transcripciones de genes en la misma escala. En el presente estudio, hemos aplicado nuestra metodología [17] para investigar los niveles de expresión de estos quitinasas en los tejidos humanos. Por otra parte, para evaluar los niveles de expresión de quitinasas en los tejidos humanos y de ratón, hemos desarrollado un sistema de cuantificación utilizando un único estándar de ADN híbrido humano y de ratón. Demostramos tejidos y la expresión específica de la especie de los dos quitinasas activas de mamíferos, Chit1 y AMCase. Nuestros datos en general apoya estudios previos reportados por Boot et al [6], [21]. Sin embargo, nuestro análisis es lo suficientemente sensible para detectar ARNm y ofrece un estudio exhaustivo de los patrones de expresión génica de las quitinasas en los tejidos humanos y de ratón en la misma escala.

Una característica notable de la expresión de los mamíferos es quitinasas la expresión conservada de Chit1 entre los tejidos pulmonares humanos y de ratón. Se encontró que Chit1 se expresó en niveles relativamente altos en los tejidos del pulmón humano y de ratón que eran casi comparables entre sí, lo que indica que el nivel de expresión del ARNm Chit1 se conserva. En los pulmones, Chit1 puede actuar como parte del sistema de defensa del huésped que protege contra los patógenos que contiene quitina, tales como hongos y ácaros [25]. La conservación de la expresión génica Chit1 en humanos y ratones sugiere la importancia fisiológica de Chit1 en el pulmón.

La expresión de las quitinasas en el estómago es de particular interés. AMCase ARNm se sintetiza a niveles extraordinariamente altos en el estómago de ratón pero no en el estómago humano (Figura 6B). La comparación de estos niveles de expresión mostró que el nivel AMCase mRNA en el estómago humano fue de aproximadamente 1 /2.800 de que en el homólogo de ratón. Se confirmó que los niveles de expresión de ARNm de pepsinógeno C y los dos genes de limpieza eran muy altas en los tejidos humanos y de ratón de estómago (Figura 6B). Por lo tanto, la disminución del nivel de expresión de mRNA AMCase en el estómago humano no se debe a la degradación del ARN durante la preparación de ADNc. Por otra parte, se encontró que el estómago del ratón expresó gran cantidad de AMCase, mientras que la contraparte humana no lo hicieron (Figura 7). Estos resultados indican que el nivel de expresión de la AMCase en los tejidos del estómago difiere significativamente entre humanos y ratones.

El estómago es un órgano importante que desempeña un papel fundamental en la digestión de los alimentos y la protección contra organismos nocivos. El ácido clorhídrico es secretado en el estómago, creando condiciones ácidas (pH = ~ 2) apropiadas para la digestión de proteínas por la pepsina [19], [26]. Murino AMCase muestra la estabilidad del ácido profundo y es más activa a un pH de aproximadamente 2 [6]. El estómago de ratón produce una enorme cantidad de AMCase ARNm [17] y su producto de traducción (Figura 7). En consecuencia, AMCase puede funcionar como una enzima digestiva que descompone los alimentos que contienen quitina en el estómago del ratón.

Por el contrario, el nivel de expresión de ARNm AMCase y su producto era relativamente bajo en el estómago humano (Figura 5, la Figura 6 y la Figura 7). Esto no es inesperado porque los humanos modernos no comen una gran cantidad de alimentos que contienen quitina. Estos resultados sugieren que la AMCase no puede jugar un papel en la defensa contra los microorganismos que contienen quitina en el estómago humano. Muchas enfermedades del estómago están asociados con la infección por organismos exógenos. La gravedad de las infecciones de la gastritis asociada, como Helicobacter pylori
puede correlacionarse con la actividad de las enzimas endógenas [23]. Por lo tanto, sigue siendo una cuestión de debate si el bajo nivel de AMCase en el estómago humano participa en la respuesta a los trastornos gástricos
.

Un alto nivel de actividades quitinolíticas se han detectado en extractos de estómago y el intestino del ratón [6] . Puesto que hay diferencias importantes en los niveles de expresión de quitinasa en el estómago entre humanos y de ratón, se examinaron los niveles de expresión de estos quitinasas en otros órganos digestivos, incluyendo la glándula salival y intestinos delgado y grueso. Nuestros resultados indican que tanto Chit1 mRNA y los niveles en AMCase intestinos delgado y grueso eran muy bajos en ambos tejidos humanos y de ratón, a pesar de la glándula salival del ratón y el estómago producen altos niveles de ambos quitinasas ARNm (Figura 5). Estos resultados sugieren que las proteínas quitinasa de mamífero en el intestino del ratón se deriva probablemente de las partes superiores del tracto gastrointestinal, tales como las glándulas salivales y el estómago, lo que es consistente con la noción previa de Boot et al [6], [21].

los niveles de expresión del gen Chit1 en los tejidos del pulmón se conserva entre los humanos y los ratones. Por el contrario, el nivel de expresión de la AMCase en los tejidos del estómago es específico de la especie. Los resultados sugieren que la regulación de la expresión de ARNm Chiti1 en el pulmón se ha conservado durante la evolución, mientras que la disminución de expresión de AMCase en el estómago humano podría ser el resultado de silenciamiento génico. El examen de la regulación de la expresión de estas quitinasas de mamíferos podría dar una visión de los papeles fisiopatológicos de estas enzimas. Una caracterización detallada de las regiones promotoras de los genes Chit1 y AMCase y la identificación de la cis CD - y se requerirá trans-actuando factores
para la comprensión de la expresión génica selectiva de estos quitinasas en humanos y ratones.

La expresión de ARNm Chit1 y AMCase se induce en diversas condiciones patológicas. Utilizando el sistema cuantitativo descrito aquí, vamos a ser capaces de comparar los niveles de ARNm de quitinasa a través de los tejidos humanos y de ratón mediante PCR en tiempo real. Este análisis ayudará a la comprensión de la función biológica de estos quitinasas, especialmente en los estudios fisiopatológicos de la enfermedad humana usando modelos murinos. Nuestra metodología es aplicable a la cuantificación de los ARNm de múltiples genes entre las muestras humanas y de ratón utilizando la misma escala. Un uso práctico de esta cruzada de especies datos de expresión génica comparativa es la comparación de las enfermedades humanas con modelos de ratones y cultivos celulares.

Materiales y Métodos

ARN y ADNc Preparación

el ARN total humano Maestro Panel II y el Grupo de ratón total RNA Master (Clontech Laboratories) se utilizaron para examinar la distribución de las transcripciones en diferentes tejidos. Intestino delgado humano ARN total se adquirió de Clontech Laboratories. Además, el ARN fue aislado de las glándulas salivales y intestinos delgado y grueso de ratones machos de 3 meses de edad. C57BL /6J (borrar Japón) fueron criados en el Centro RIKEN Brain Science Institute Animal. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal del Instituto de Ciencias del Cerebro RIKEN (Aprobación Nº H19-2B013). Toda la cirugía se realizó con éter dietílico como anestésico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los tejidos para preparación de ARNm fueron proporcionados por los Dres. Miyazaki y Nukina en RIKEN Brain Science Institute. El ARN total se preparó a partir de la glándula salival y intestinos delgado y grueso utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se analizaron 21 tejidos humanos diferentes y ocho tejidos de ratón adulto. Para eliminar cantidades traza de ADN genómico contaminante, muestras de ARN total se trataron con RQ1 RNasa libre de DNasa (Promega) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Cada una de las muestras de ARN total fue sometido a transcripción inversa usando hexámeros aleatorios como cebadores, como se informó anteriormente [17].

-PCR en tiempo real

La creación y validación del tiempo real se realizaron sistema de PCR de tejidos humanos como se describe [17]; La única excepción fue el uso de cebadores humanos. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores que fueron seleccionados para la PCR en tiempo real para el sistema humano se muestran en la Tabla S1. Cada muestra se amplificó por triplicado, y cada experimento se repitió al menos dos veces.

Construcción del ADN humano estándar y preparación de los Cinco ADNc humanos que cubren toda la región que codifica

La construcción de la ADN plantilla estándar para los genes humanos y de la preparación de los cinco ADNc humanos que cubrían toda la región de codificación se realizaron esencialmente como se describe [17]; La única excepción fue el uso de cebadores humanos. Los cebadores directos e inversos se enumeran en la Tabla S2. Los productos de PCR fueron digeridos con las enzimas de restricción apropiadas y se ligaron utilizando ADN ligasa de T4. Los fragmentos ligados se amplificaron usando el cebador directo 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'y el cebador inverso 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' y se clonó en el vector pGEM-T Easy (Promega). Las secuencias verificadas de los ADNc se muestran en la Figura S2. no.

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