PLoS ONE: quantificazione dei livelli di mRNA chitinasi nei tessuti umani e mouse Real-Time PCR: Espressione specie-specifico di acido Mammalian chitinase nei tessuti dello stomaco

Astratto

chitinasi idrolizza chitina, che è un N
acetil-D-glucosamina polimero che è presente in una vasta gamma di organismi, tra cui insetti, parassiti e funghi. Anche se i mammiferi non contengono la chitina endogeni, gli esseri umani e topi esprimono due chitinasi attivi, chitotriosidasi (Chit1) e chitinasi mammiferi acida (AMCase). Poiché il livello di espressione di questi chitinasi è aumentata in molte condizioni infiammatorie, tra cui la malattia di Gaucher e mouse modelli di asma, entrambe le chitinasi possono svolgere un ruolo importante nelle pathophysiologies di queste e di altre malattie. Recentemente abbiamo stabilito un sistema di PCR quantitativa utilizzando un unico standard di DNA e ha dimostrato che AMCase mRNA è sintetizzato a livelli straordinariamente elevati nei tessuti del mouse di stomaco. In questo studio, abbiamo applicato questa metodologia per la quantificazione di mRNA chitinasi in tessuti umani e abbiamo scoperto che entrambi i mRNA chitinasi sono stati ampiamente espressi nei tessuti umani normali. Chit1 mRNA era altamente espresso nel polmone umano, mentre AMCase mRNA non era sovraespresso in tessuti normali stomaco umano. I livelli di questi mRNA nei tessuti umani erano significativamente inferiori ai livelli di geni housekeeping. Poiché i livelli di espressione AMCase erano molto diverse tra i tessuti umani e il mouse di stomaco, abbiamo sviluppato un sistema di PCR quantitativa per confrontare i livelli di mRNA tra tessuti umani e topo utilizzando un DNA standard di ibrido umano-topo. La nostra analisi ha mostrato che Chit1 mRNA è espresso a livelli simili a normale polmone umano e il mouse. Al contrario, il livello di espressione AMCase nello stomaco umano era significativamente inferiore a quella osservata livello di espressione in topo stomaco. Queste differenze di mRNA tra i tessuti dello stomaco umano e topo riflettevano le differenze nelle attività chitinolytic e livelli di espressione della proteina. Pertanto, il livello di espressione del AMCase nello stomaco è specie-specifico

Visto:. Ohno M, Y Togashi, Tsuda K, K Okawa, Kamaya M, Sakaguchi M, et al. (2013) quantificazione dei livelli di mRNA chitinase in umana e tessuti di topo da Real-Time PCR: Espressione specie-specifico di acido Mammalian chitinase nei tessuti dello stomaco. PLoS ONE 8 (6): e67399. doi: 10.1371 /journal.pone.0067399

Editor: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 5 Gennaio 2013; Accettato: May 15, 2013; Pubblicato: 27 giugno 2013

Copyright: © 2013 Ohno et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto di ricerca sovvenzione da parte del Research Institute of Science and Technology, Kogakuin University. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

chitina, che è un polimero di N
acetil-D-glucosamina, è il secondo polisaccaride più abbondante in natura [1]. Si tratta di un componente integrale delle esoscheletri di crostacei e insetti, le guaine microfilarial di nematodi parassiti e le pareti delle cellule fungine [1], [2].

chitinasi sono enzimi che digeriscono il polimero chitina. Anche se i mammiferi non producono chitina, gli esseri umani e topi hanno due geni che codificano chitinasi attivi, chitotriosidasi (Chit1) e chitinasi mammiferi acide (AMCase) [2], [3]. Chit1 stata la prima chitinasi mammiferi da purificare e clonato [4], [5]. AMCase, che è il secondo chitinase più attivo nei mammiferi, è stato identificato come un enzima compensativa per Chit1 e chiamato per la sua attività ottimale in condizioni acide [6].

entrambi gli enzimi sequenza mostra omologia di chitinasi batteriche e appartengono a famiglia 18 di idrolasi glicosil, che comprende anche le proteine ​​chitinasi-like che sono strutturalmente correlati al chitinasi ma mancano attività chitinolytic [2], [3]. Il AMCase murino mostra omologia di sequenza per Chit1, con una identità di 52% e una somiglianza del 60% [6]. Il locus del gene Chit1 umana è situato sul cromosoma 1q32 [7], mentre il gene AMCase umano è localizzato sul cromosoma 1p13 [6]. Entrambi i geni sono composti da 12 esoni e codificano varie isoforme di splicing [6] - [9]. L'omologia di sequenza e la conservazione dei confini introne-esone tra i geni e Chit1 AMCase suggeriscono che questi geni sono sorte da una duplicazione di un gene ancestrale [3], [6].

Recenti studi hanno dimostrato associazioni tra l'espressione delle chitinasi mammifero e condizioni infiammatorie. Per esempio, i livelli di Chit1 sono elevati nel plasma di pazienti con malattia di Gaucher, la bronco liquido di lavaggio dei fumatori e dei pazienti con broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e il liquido cerebrospinale di pazienti con malattia di Alzheimer [9] - [12] . espressione e l'attività AMCase sono anche sovraregolati durante le risposte delle vie aeree allergiche in modelli murini di asma [13]. chitina polimerici induce l'espressione AMCase e il reclutamento di cellule immunitarie che sono associati con l'allergia e l'asma [14]. Inoltre, diverse varianti genetiche di AMCase sono associati con l'asma bronchiale negli esseri umani [15], [16]. Questi risultati suggeriscono che gli enzimi chitinolytic svolgono un ruolo importante nella risposta alla malattia. Tuttavia, le loro funzioni fisiopatologici rimangono poco conosciuta.

Quantificazione dei Chit1 e dei livelli di mRNA AMCase è un passo importante verso la comprensione del in vivo
regolazione della chitinasi nei mammiferi. Recentemente abbiamo stabilito un sistema di PCR quantitativa utilizzando un unico DNA standard per quantificare e confrontare i livelli di espressione dei geni chitinasi e di riferimento sulla stessa scala [17]. Nel nostro precedente lavoro, abbiamo dimostrato che AMCase è un importante trascrizione nello stomaco del mouse e si esprime a livelli paragonabili a quelli di Pepsinogeno C [17].

Qui, abbiamo applicato la nostra metodologia per la quantificazione del livelli di mRNA delle chitinasi mammiferi in tessuti umani normali, che è un prerequisito per comprendere i loro ruoli patologiche in tessuti malati. Inoltre, abbiamo stabilito un sistema di quantificazione per confrontare i livelli di mRNA di geni multipli tra un certo numero di tessuti umani e topo utilizzando un DNA standard di ibrido umano-topo. Il nostro studio dimostra che quantitativamente Chit1 mRNA è espresso a livelli elevati nelle normali polmoni umani e topo. Al contrario, AMCase è prevalentemente sovraespresso nel topo, ma non stomaco umano.

Risultati

Istituzione e validazione di un PCR in tempo reale per il rilevamento di chitinasi nei tessuti umani

abbiamo già istituito un sistema di PCR in tempo reale che è in grado di determinare i livelli di mRNA dei due chitinasi mammiferi nei tessuti di topo e di confrontare questi livelli con quelli dei geni di riferimento utilizzando la stessa scala [17]. In questo studio, abbiamo voluto confrontare i livelli di espressione genica dei geni Chit1 e AMCase attraverso tessuti umani normali (Figura 1A). Come nei tessuti di topo [17], abbiamo usato il deidrogenasi geni housekeeping gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH) e β-actina come i geni di riferimento perché sono costitutivamente espressi ad alti livelli nella maggior parte delle cellule [18]. Inoltre, abbiamo scelto pepsinogeno C (noto anche come progastricsin) come gene di riferimento nello stomaco perché il livello di AMCase mRNA nello stomaco topo era paragonabile al livello di mRNA di pepsinogeno C, che costituisce un componente importante della mucosa gastrica [ ,,,0],19]. L'utilizzo di questi tre geni di riferimento, abbiamo valutato i livelli di espressione genica di Chit1 e AMCase nei tessuti umani normali (Figura 1A).

Abbiamo progettato diverse serie di primer per la PCR quantitativa e valutato l'idoneità in base al fatto che hanno mostrato una singola temperatura di fusione (Tm) e una singola banda su un gel di poliacrilammide 10% [17]. Come mostrato nella Figura S1A-E, le curve di dissociazione dei cinque cDNA mostrano solo picco ciascuno. Elettroforesi su gel ha mostrato chiaramente le bande singole le dimensioni previste per Chit1 (55 bp), AMCase (62 bp), GAPDH (57 bp), β-actina (57 bp) e pepsinogeno C (61 bp) (Figura S1F). Così, abbiamo confermato che i prodotti di PCR corretti sono stati amplificati dalla miscela di tessuti cDNA umano.

Abbiamo poi costruito un DNA modello standard per PCR in tempo reale legando cinque frammenti bersaglio in un rapporto uno a uno (Figura 1B e Figura S2). Il 1.396-nucleotide-lungo DNA modello standard era costituito da cinque frammenti di cDNA che coprivano la regione di destinazione PCR e 60-143 basi delle regioni fiancheggianti e conteneva Bgl
II, Sal
I, Xho
i e Non
siti che di restrizione (Figura 1B e Figura S2).

La quantificazione di entrambe le chitinasi e gli mRNA di riferimento si basa su curve standard. Abbiamo usato le curve standard per confrontare e valutare le strategie in tempo reale PCR di quantificazione. Ogni curva standard è stata generata utilizzando 10 volte diluizioni seriali del DNA standard di umano e le cinque coppie di primer (Figura S3A-E, rosso cerchi chiuso). Usando il DNA modello standard che contiene i cinque frammenti di cDNA umani, uguali quantità possono essere assegnati a tutti i cinque geni in ogni diluizione usare per costruire le curve standard (Figura S3A-E, rosso cerchi chiuso).

Per provare l'uguaglianza delle curve, una concentrazione nota dell'intero cDNA codificante umana è stato amplificato e successivamente analizzato come campione sconosciuto. Questo test è stato eseguito per verificare che ogni diluizione testata portato alla quantità prevista. Come mostrato nella Figura S3A-E, blu rombi chiusi, sono stati osservati quantità uguali per ogni diluizione testata; questi sono stati utilizzati per costruire la curva standard.

La quantificazione di trascritti a bassa abbondanza e trascrizioni abbondanti ci permette di convalidare la sensibilità e l'affidabilità della PCR in tempo reale, indicando che il nostro metodo PCR in tempo reale offre una grande gamma dinamica di quantificazione, elevata precisione e alta sensibilità (Figura S3A-e). Così, il nostro metodo PCR in tempo reale fornisce i valori affidabili per i due geni umani e chitinasi i tre geni di riferimento umani sulla stessa scala.

L'espressione di Chit1 e AMCase nelle normali tessuti umani

Per studiare il in vivo
regolazione dell'espressione dei geni Chit1 e AMCase umani, l'RNA totale da vari tessuti umani normali è stato analizzato utilizzando una PCR real-time quantitativa con il DNA di serie specificamente progettato (Figura 1). I valori ottenuti sono stati espressi come molecole per 10 ng di RNA totale in asse y (Figura 2 e Figura 3).

Sia Chit1 e AMCase mRNA sono stati ampiamente espressi nei tessuti umani normali (Figura 2A e 2B). I massimi livelli di Chit1 mRNA sono stati rilevati nel polmone umano, seguita dalla milza, fegato fetale e timo (Figura 2A). I più alti livelli di mRNA AMCase sono stati rilevati nel polmone, seguito da cervello fetale, fegato, tiroide e del cuore (Figura 2B). Anche se AMCase mRNA era espresso a livelli straordinariamente elevati nello stomaco del mouse [17], il suo livello di espressione nello stomaco umano era molto più basso rispetto a quelli del polmone, cervello fetale, fegato fetale, della tiroide e del cuore (Figura 2B). In altri tessuti, sia il Chit1 e AMCase mRNA sono stati espressi a bassa, ma i livelli facilmente rilevabili sopra sfondo (Figura 2A e 2B Figura).

Quando confrontato con livelli AMCase mRNA, Chit1 mRNA era espresso a livelli relativamente più elevati in milza e fegato fetale. Al contrario, il cervello del feto, della prostata e del fegato hanno espresso una maggiore quantità di AMCase mRNA di Chit1 mRNA (Figura 2).

L'analisi dei livelli di espressione di Chit1, AMCase, GAPDH, β-actina e Pepsinogeno C mRNA in tessuti normali polmone umano e lo stomaco

Poiché molti studi sulla fisiopatologia della chitinasi mammiferi sono stati effettuati utilizzando polmone e dello stomaco [6], [8], [9], [13], [14], [20 ] - [23], abbiamo confrontato i livelli di espressione delle chitinasi ei geni di riferimento in questi due tessuti umani. I dati quantitativi sono mostrati in Figura 3. normalizzare il livello Chit1 a 1.0, i relativi livelli di espressione di AMCase, GADPH, e mRNA beta-actina nel tessuto polmonare umana erano 0,8, 39 e 343, rispettivamente (Figura 3A). I geni GAPDH e beta-actina sono ben noti geni housekeeping e sono costitutivamente espressi ad alti livelli nella maggior parte dei tessuti [18]. I nostri risultati indicano che Chit1 e AMCase mRNA sono espressi a livelli simili nel tessuto polmonare umano normale, anche se il livello di espressione Chit1 era molto più basso rispetto a quelli dei due geni housekeeping (confrontare trama non-log con grafico log in figura 3).

normalizzare il livello di Chit1 a 1.0, i relativi livelli di espressione del AMCase, GAPDH, β-actina e pepsinogeno C in tessuto normale stomaco umano erano 1.5, 323, 1.736 e 3.962, rispettivamente (Figura 3B). Qui, i livelli di espressione di entrambi Chit1 e AMCase erano molto inferiori a quelli di GAPDH e β-actina. Anche se pepsinogen C mRNA è stato altamente espresso nei campioni di stomaco umano, AMCase mRNA era paragonabile a Chit1. Questi risultati indicano che i livelli di espressione Chit1 e AMCase sono relativamente bassi nei tessuti umani esaminati e che il livello di espressione AMCase nello stomaco differisce significativamente tra uomo e topo.

Costituzione e validazione di un sistema di quantificazione per l'uomo e mouse chitinasi mRNA utilizzando un DNA ibrido umano-topo

accanto cercato di confrontare i livelli di espressione dei due chitinasi tra esseri umani e topi sulla stessa scala utilizzando un sistema real-time PCR (Figura 4A). Abbiamo quindi costruito un DNA standard di ibrido umano-mouse per il real-time PCR legando i DNA modello standard umane e di topo (Figura 4B). La risultante 2.305-nucleotide-lungo stampo di DNA conteneva dieci frammenti di cDNA che coprivano la regione di destinazione PCR e 9-143 basi delle regioni fiancheggianti dei geni umani e di topo (vedi dettagli in figura S4).

Le convalide della curva standard e il sistema PCR quantitativa in tempo reale sono stati eseguiti come mostrato in Figura S5, S6 Figura e Figura S7. diluizioni seriali del DNA standard di ibrido umano-topo sono stati usati per costruire una curva standard. Ogni curva standard è stata generata utilizzando 10 volte diluizioni seriali del DNA standard e di cinque diverse coppie di primer (Figura S5A-E, cerchi rossi chiusi). Usando il DNA modello standard che contiene i cinque frammenti di cDNA, quantità uguali possono essere assegnati a tutti i cinque geni umani utilizzando coppie di primer umano-specifici in ogni diluizione che è stato utilizzato per costruire le curve standard (Figura S5A-E, cerchi rossi chiuso ). Analogamente, uguali quantità possono essere assegnati a tutti i cinque geni murini (Figura S6A-E, viola triangoli chiusi).

Per verificare l'uguaglianza delle curve, una concentrazione nota dell'intero cDNA codificante è stato amplificato e successivamente analizzati come un campione sconosciuto. Quantità uguali di tutta umani cDNA codificanti sono stati osservati per ogni diluizione testata; questi quantitativi sono stati poi utilizzati per costruire la curva standard (Figura S5A-E, blu rombi chiuso). Allo stesso modo, sono stati osservati anche quantità uguali del mouse intero cDNA codificanti (Figura S6A-E, croci verdi). La quantificazione di trascritti bassa abbondanza e trascrizioni abbondanti permette di validare la sensibilità e l'affidabilità della PCR in tempo reale, indicando che il nostro metodo PCR in tempo reale offre un'ampia gamma dinamica di quantificazione, elevata precisione e alta sensibilità (Figura S5A- e e Figura 6A-e).

Inoltre, le quattro linee (due curve standard e due curve di diluizione delle concentrazioni note dell'intero cDNA codificanti umano e topo, rispettivamente) sovrapposti (Figura S7A-e). Così, il nostro metodo PCR in tempo reale fornisce i valori relativi affidabili per i quattro geni chitinasi ed i sei geni di riferimento (Figura 4B).

Confronto di Chit1 e AMCase mRNA livelli tra tessuti normali uomo e topo

Abbiamo usato il umana RNA totale Maestro Panel II e il mouse RNA totale master Panel (Clontech Laboratories) come fonti di RNA totale per questo studio. Ci sono quattro tessuti (polmone, fegato, milza e reni) che si sovrapponevano tra i pannelli umane e di topo e relativi ad asma e malattia di Gaucher. Poiché non vi sono state differenze di rilievo nell'espressione chitinasi nei tessuti dello stomaco, abbiamo anche esaminato i livelli di espressione di questi chitinasi in altri organi digestivi, delle ghiandole salivari, stomaco, intestino tenue e crasso tra uomo e topo. Abbiamo quantificato e confrontato i livelli di espressione di questi tessuti utilizzando il DNA umano-mouse standard ibrido (Figura 4B); i dati quantitativi sono mostrati in Figura 5.

Abbiamo trovato il più alto livello di espressione di mRNA Chit1 nel topo (ma non umana) stomaco, seguita da tessuti polmonari umani. Nel complesso, Chit 1 mRNA era espresso a livelli più elevati nei tessuti umani rispetto nei tessuti di topo, eccetto per lo stomaco (Figura 5A). Il più alto livello di espressione di mRNA AMCase era nel topo stomaco, seguita da ghiandole salivari del mouse. Negli altri tessuti umani e di topo, i livelli di mRNA AMCase erano bassi nei tessuti umani (Figura 5B). Entrambi i livelli Chit1 e AMCase mRNA nelle piccole e grandi intestini erano molto bassi in entrambi i tessuti umani e di topo (figura 5), ​​che erano in linea con i dati precedenti ottenuti dal Northern blotting [6], [21].

ha scoperto che AMCase mRNA era espresso a bassi livelli in normale stomaco umano, ma è stato altamente espresso nei tessuti del mouse dello stomaco (Figura 5B). Così, abbiamo anche confrontato i livelli di espressione delle chitinasi ei geni di riferimento utilizzando i cDNA che sono stati preparati dai tessuti polmonari e dello stomaco.

normalizzare il livello Chit1 umano nel tessuto polmonare a 1.0, i livelli di espressione relativi del mouse Chit1, AMCase umana e di topo AMCase mRNA erano 0,3, 0,3 e 7, rispettivamente (figura 6A). Murino AMCase è stato altamente espresso nel polmone del mouse. Il livello di mRNA Chit1 nel polmone umano era circa 3 volte superiore a quello del polmone del mouse. I livelli di mRNA Chit1 e AMCase erano significativamente inferiori ai livelli di espressione dei GAPDH e beta-actina geni (figura 6A).

normalizzare il livello umano Chit1 in to1.0 stomaco, i relativi livelli di espressione del mouse Chit1, il AMCase umana e di topo AMCase mRNA erano 10, 0,7 e 1.978, rispettivamente (Figura 6B). Pepsinogeno C è un importante enzima digestivo nello stomaco. Il livello di espressione di AMCase nei topi è stato molto superiori a quelli della GAPDH e β-actina e era paragonabile al livello di pepsinogeno C, mentre la stomaco umano mostrato un livello molto basso di espressione AMCase mRNA. I relativi livelli di espressione di mRNA nello stomaco umano e il mouse sono stati rispettivamente 1.0 e 2.826,.

Al fine di verificare se le differenze di livello di mRNA tra topo e umani si sono riflessi a livello proteico, abbiamo analizzato la prossima attività enzimatica di questi chitinasi nei tessuti dello stomaco. In primo luogo abbiamo analizzato l'attività AMCase nel topo e tessuti dello stomaco umano. Il AMCase mouse mostra un doppio pH ottimale con un importante ottimale intorno pH 2 e un ottimale secondario intorno a pH 5 [6], mentre AMCase umano mostra un'ampia pH ottimale a pH 2~pH 5 [16], [24]. Così, abbiamo misurato l'attività chitinolytic a pH 2,0 e pH 5,0 utilizzando il substrato sintetico di 4-metilumbelliferil β-D-N, N'-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose) [6], [21]. Abbiamo rilevato robusta attività chitinolytic in estratto stomaco del mouse a pH 2.0 e l'attività forte a pH 5.0. Al contrario, nessuna attività è stata rilevata in quella di umana a pH 2.0 ed è stato osservato molto bassa attività a pH 5.0 (Figura 7A, a sinistra).

Il test enzimatico di serie Chit1 è stata eseguita utilizzando 4 metilumbelliferil β- DN, N ', N' '- triacetylchitotriose (4MU-chitotriose) a pH 5.2 [6], [10], [21], [25]. Per monitorare l'effetto di AMCase sull'attività Chit1, abbiamo analizzato l'attività chitinase utilizzando 4MU-chitotriose a pH 2.0. Relativamente forte attività chitinase contro 4MU-chitotriose è stato rilevato nell'estratto stomaco del mouse a pH 2.0 (Figura 7A a destra), e abbiamo anche rilevato l'attività chitinase debole a pH 5.2 (Figura 7A a destra). Dal momento che AMCase ha un secondo ideale a circa pH 5, questi risultati hanno indicato che la maggior parte delle attività chitinolytic a pH 5.2 può essere dovuto a AMCase piuttosto che Chit1 e che il mouse AMCase potrebbe idrolizzare 4MU-chitotriose come substrato a pH 2.0. Presi insieme, la maggior parte delle attività chitinasica nello stomaco del mouse determinato dall'attività AMCase. In estratto stomaco umano abbiamo anche osservato livelli molto deboli, ma rilevabili di attività chitinolytic a pH 2.0 e pH 5.2 (Figura 7A, a destra, pannello inferiore). attività di chitinasi a pH 5.2 era paragonabile a quella a pH 2.0, indicando espressione Chit1 in stomaco umano.

Infine, abbiamo analizzato i livelli di espressione della proteina mediante Western blotting utilizzando anticorpi contro AMCase. Gli anticorpi anti-AMCase stati generati contro il peptide precedentemente riportato topo [14] e controparte umana. Anti-topo anticorpi AMCase riconosciuto un robusto gruppo di proteine ​​unico nel estratto del mouse stomaco, ma non da umano (Figura 7B, a sinistra). Allo stesso modo l'anticorpo anti-umano AMCase anche riconosciuto una singola banda nell'estratto del mouse (Figura 7B, a destra). Nel estratto umana c'erano bande deboli di peso molecolare leggermente superiore che sono stati riconosciuti da entrambi umano e topo anticorpi (Figura 7B). Dal momento che non vi era alcuna significativa attività chitinase sia a pH 2,0 o pH 5,0 monitorato utilizzando 4MU-chitobiose in estratto stomaco umano, queste bande non possono essere correlati alla AMCase umana. Di conseguenza, le attività chitinolytic ed i relativi livelli di espressione della proteina tra mouse e tessuti dello stomaco umano sono stati coerenti con i nostri dati ottenuti a livello di mRNA.

Discussione

Gli studi precedenti sul in vivo
regolazione della Chit1 e AMCase in uomo e topo sono state effettuate utilizzando Northern blotting, PCR semi-quantitativa e real-time PCR [6], [8], [9], [13], [14], [22] , [23]. Sebbene questi metodi presentano diversi vantaggi rispetto l'esame dei pattern di espressione genica, hanno fallito di confrontare i livelli dei diversi trascritti genici sulla stessa scala. In questo studio, abbiamo applicato la nostra metodologia [17] per indagare i livelli di espressione di questi chitinasi nei tessuti umani. Inoltre, per valutare i livelli di espressione di chitinasi in tessuti umani e di topo, abbiamo sviluppato un sistema di quantificazione utilizzando un singolo essere umano e il DNA mouse standard ibrido. Abbiamo dimostrato da tessuti e di espressione specie-specifico dei due chitinasi attivi mammiferi, Chit1 e AMCase. I nostri dati supportano generalmente precedenti studi riportati da Boot et al [6], [21]. Tuttavia, la nostra analisi è sufficientemente sensibile per rilevare mRNA e offre una rassegna completa dei pattern di espressione genica delle chitinasi in tessuti umani e di topo sulla stessa scala.

Una caratteristica evidente dell'espressione delle chitinasi dei mammiferi è l'espressione conservato di Chit1 tra tessuti polmonari umane e di topo. Abbiamo trovato che Chit1 era espresso a livelli relativamente elevati nei tessuti polmonari umane e di topo che erano quasi paragonabili tra loro, che indica che il livello di espressione del mRNA Chit1 è conservato. Nei polmoni, Chit1 può agire come parte del sistema di difesa dell'ospite che protegge contro gli agenti patogeni chitina contenenti, come i funghi e acari [25]. La conservazione di espressione genica Chit1 nell'uomo e nel topo suggerisce l'importanza fisiologica del Chit1 nel polmone.

L'espressione di chitinasi nello stomaco è di particolare interesse. AMCase mRNA è sintetizzato a livelli straordinariamente elevati nello stomaco mouse, ma non nello stomaco umano (Figura 6B). Il confronto di questi livelli di espressione ha dimostrato che il livello di mRNA AMCase nello stomaco umano era di circa 1 /2.800 di quella nella controparte mouse. Abbiamo confermato che i livelli di espressione di mRNA pepsinogeno C ed i due geni di pulizia erano molto elevati nei tessuti umani e il mouse dello stomaco (Figura 6B). Pertanto, il livello di espressione diminuita di AMCase mRNA nello stomaco umano non è dovuta a degradazione dell'RNA durante la preparazione cDNA. Inoltre, abbiamo scoperto che il mouse stomaco espresso grande quantità di AMCase, mentre la controparte umana non ha (Figura 7). Questi risultati indicano che il livello di espressione del AMCase nei tessuti dello stomaco differisce significativamente tra umani e topi.

Lo stomaco è un organo importante che svolge ruoli fondamentali nella digestione di alimenti e protezione contro organismi nocivi. L'acido cloridrico viene secreto nello stomaco, creando condizioni di acidità (pH = ~2) appropriati per la digestione delle proteine ​​da pepsina [19], [26]. Murine AMCase mostra profonda stabilità acidi ed è più attivo a circa pH 2 [6]. Lo stomaco del mouse produce una quantità enorme di AMCase mRNA [17] e il suo prodotto di traduzione (Figura 7). Di conseguenza, AMCase può funzionare come un enzima digestivo che scompone cibi chitina contenenti nello stomaco mouse.

Al contrario, il livello di espressione di mRNA AMCase e del suo prodotto erano relativamente basso nello stomaco umano (figura 5, Figura 6 e la Figura 7). Questo non è inaspettato perché moderni umani non mangiano una notevole quantità di alimenti contenenti chitina. Questi risultati suggeriscono che AMCase non può giocare un ruolo nella difesa contro gli organismi chitina contenenti nello stomaco umano. Molte malattie dello stomaco sono associati con l'infezione da parte di organismi esogeni. La gravità delle infezioni gastrite associate come Helicobacter pylori
necessariamente correlato con l'attività degli enzimi endogeni [23]. Resta quindi una questione di dibattito se il basso livello di AMCase nello stomaco umano partecipa alla risposta ai disturbi gastrici
.

Un elevato livello di attività chitinolytic sono stati rilevati in estratti di stomaco e dell'intestino del mouse [6] . Poiché non vi sono differenze di rilievo nei livelli di espressione chitinase nello stomaco tra uomo e topo, abbiamo esaminato i livelli di espressione di questi chitinasi in altri organi digestivi, tra cui ghiandole salivari e intestino tenue e crasso. I nostri risultati indicano che sia Chit1 e AMCase mRNA livelli in piccoli e grandi intestini erano molto bassi in entrambi i tessuti umani e di topo, anche se ghiandole salivari del mouse e dello stomaco producono alti livelli di entrambe le chitinasi mRNA (Figura 5). Questi risultati suggeriscono che le proteine ​​chitinasi mammiferi nell'intestino del mouse sono probabilmente derivano dalle parti superiori del tratto gastrointestinale, come la ghiandola salivare e lo stomaco, che è coerente con la nozione preventiva Boot et al [6], [21].

I livelli di espressione del gene Chit1 nei tessuti polmonari si conserva tra gli esseri umani e topi. Al contrario, il livello di espressione del AMCase nei tessuti dello stomaco è specie-specifico. I risultati suggeriscono che la regolazione dell'espressione di mRNA Chiti1 nel polmone è stata conservata durante l'evoluzione, considerando che la diminuita espressione di AMCase nello stomaco umano potrebbe essere il risultato di silenziamento genico. L'esame della regolazione dell'espressione di questi chitinasi mammiferi potrebbe dare intuizioni i ruoli fisiopatologici di questi enzimi. Una caratterizzazione dettagliata delle regioni promotrici dei geni Chit1 e AMCase e l'identificazione del cis
- e trans -acting
fattori saranno necessari per la comprensione dell'espressione genica selettivo di questi chitinasi negli esseri umani e nei topi.

L'espressione di Chit1 e AMCase mRNA è indotta in varie condizioni patologiche. Utilizzando il sistema quantitativo descritto qui, saremo in grado di confrontare i livelli di mRNA chitinase attraverso i tessuti umani e di topo mediante real-time PCR. Questa analisi aiuterà la comprensione della funzione biologica di questi chitinasi, soprattutto negli studi fisiopatologici delle malattie umane utilizzando modelli murini. La nostra metodologia è applicabile alla quantificazione degli mRNA di geni multipli tra campioni umani e topo utilizzando la stessa scala. Un uso pratico di questa cross-specie i dati di espressione genica comparativa è il confronto delle malattie umane con modelli di topo e di coltura cellulare.

Materiali e Metodi

RNA e cDNA Preparazione

The Human RNA totale Maestro Panel II e il topo RNA totale master Panel (Clontech Laboratories) sono stati usati per esaminare la distribuzione dei trascritti in vari tessuti. Intestino tenue umano RNA totale è stato acquistato da Clontech Laboratories. Inoltre, l'RNA è stato isolato da ghiandole salivari e intestino tenue e crasso di 3 mesi di età topi maschi. C57BL /6J (Clear Giappone) sono stati allevati presso l'impianto di RIKEN Brain Science Institute degli animali. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali. Il protocollo è stato approvato dalla commissione per l'etica della sperimentazione animale del RIKEN Brain Science Institute (Approvazione n H19-2B013). Tutto intervento è stato eseguito utilizzando etere etilico come anestetico, e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo le sofferenze. I tessuti per la preparazione di mRNA sono stati forniti da Drs. Miyazaki e Nukina al RIKEN Brain Science Institute. L'RNA totale è stato preparato dalla ghiandola salivare e intestino tenue e crasso con TRIzol Reattivo (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Abbiamo analizzato 21 diversi tessuti umani e otto tessuti adulti mouse. Per rimuovere tracce di contaminazione DNA genomico, campioni di RNA totale sono stati trattati con RQ1 RNase-free DNasi (Promega) in base alle raccomandazioni del produttore. Ciascuno dei campioni di RNA totale è stato sottoposto a trascrizione inversa utilizzando esameri casuali come primer, come riportato in precedenza [17].

Real-time PCR

La creazione e la validazione del tempo reale sistema di PCR per i tessuti umani sono state eseguite come descritto [17]; l'unica eccezione è l'uso di primer umani. Le sequenze nucleotidiche dei primer che sono stati selezionati per la PCR in tempo reale per il sistema umano sono mostrati nella Tabella S1. Ogni campione è stato amplificato in triplicato, e ogni esperimento è stato ripetuto almeno due volte.

Costruzione della Human standard DNA e preparazione di cinque cDNA umani che copre l'intera regione codificante

La costruzione del DNA modello standard per i geni umani e la preparazione dei cinque cDNA umani che ricoprivano l'intera regione codificante state effettuate essenzialmente come descritto [17]; l'unica eccezione è l'uso di primer umani. I primer avanti e retromarcia sono elencate nella Tabella S2. I prodotti di PCR sono stati digeriti con gli enzimi di restrizione appropriati e ligati utilizzando T4 DNA ligasi. I frammenti legatura sono stati amplificati utilizzando il primer forward 5'-CATGGAATTCTGGTCTGGGCCATTGATCTGGATG-3 'e il primer reverse 5'-CAATCTCATCTTGTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3' e clonati nel vettore pGEM-T Easy (Promega). Le sequenze verificate di cDNA sono mostrati nella Figura S2. no.

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