Plos ONE: Hranila različno urediti Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro v kulturi želodcu Ghrelinoma (MGN3-1) celice in in vivo na samcih miši

Povzetek

Nesfatin-1 se izloča, obrok odzivno anoreksije peptid kodiran v predhodnika nucleobindin-2 [NUCB2]. Obtoku nesfatin-1 poveča po prandially, ampak prehranska sestavine, ki uravnavajo NUCB2 /nesfatin-1 ostajajo neznani. Domnevali smo, da ogljikovih hidratov, maščob in beljakovin različno uravnavajo tkiva poseben izraz nesfatin-1. NUCB2, so bile odkrite prohormon convertases in nesfatin-1 v miške želodcu ghrelinoma [MGN3-1] celic. NUCB2 mRNA in proteina so odkrili tudi v jetrih miši, in tankega in debelega črevesa. MGN3-1 Celice smo obdelali z glukozo, maščobne kisline ali aminokisline. Moški C57BL /6 miši kronično hranili veliko maščob in ogljikovih hidratov in visoko proteinske diete za 17 tednov. Kvantitativni PCR in nesfatin-1 testi so bili uporabljeni za določitev nesfatin-1 na mRNA in beljakovin ravni. Glukoza spodbudila NUCB2 mRNA izražanja v MGN3-1 celicah. L-triptofan je povečala tudi NUCB2 mRNA izražanja in ghrelin mRNA izražanja in nesfatin-1 izločanje. Oleinska kislina inhibira NUCB2 mRNA ekspresije, medtem ko je bila izboljšana grelina mRNA izražanja in izločanje. NUCB2 mRNA izraz je bil bistveno manjši v jetrih hranjene veliko beljakovin prehrana v primerjavi z miši hranili druge diete. Kronično uživanje hrane z visoko vsebnostjo maščob povzročila znatno zmanjšanje NUCB2 mRNA v želodcu, medtem ko je veliko beljakovin in visoko vsebnost maščob prehrana povzroča podobno zatiranje NUCB2 mRNA v debelem črevesu. Nobenih razlik v serumu nesfatin-1 ravni bile ugotovljene pri miših pri 7 a.m, na začetku lahkega faze. prehrana z visoko vsebnostjo ogljikovih hidratov, krmljenih miših je pokazala pomembno zvišana nesfatin-1 ravni 1. popoldne serum nesfatin-1 je bila precej nižja v miši hranili z visoko vsebnostjo maščob, beljakovin ali ogljikovih hidratov v primerjavi s kontrolami na 7 p.m, tik pred temno fazo. Miši, ki je prejela bolus visoko vsebnostjo maščob je pomembno zvišana nesfatin-1 /NUCB2 na vseh testiranih po pitanjem časovnih točk, v primerjavi s kontrolno skupino in miši hranili druge diete. Naši rezultati prvič kažejo, da je nesfatin-1 moduliran s hranili

Navedba. Mohan H, Ramesh N, Mortazavi S, Le A, Iwakura H, Unniappan S (2014) Hranila različno uravnavajo Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro
v kultiviranih želodec Ghrelinoma (MGN3-1) celice in v Vivo
pri mišjih samcih. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10,1371 /journal.pone.0115102

Urednik: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Združene države Amerike

Prejeto: Maj 1, 2014; Sprejeto: 18. november 2014; Objavljeno: 15 december 2014

Copyright: © 2014 Mohan et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Data Zaloga:. avtorji potrjujejo, da so v celoti na voljo brez omejitev vse podatke, na katerih temeljijo ugotovitve. Vsi pomembni podatki so v papirju in njene dodatne informacije datotek

Financiranje: Te raziskave se financirajo z odprtim donacije za poslovanje iz kanadske Insitutes za raziskave zdravja (CIHR; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) in vzpostavitev Grant iz Saskatchewan Health Research Foundation (http://shrf.ca/). SU je CIHR New raziskovalec. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa. Financerji nimajo nobene vloge v raziskavah ali rokopisu pripravo

Konkurenčni interesi:.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 -encoded sitosti in maščob, ki vplivajo na protein-1] je močan anoreksije peptid vpleten v regulacijo energije bilance in homeostaze glukoze [1], [30]. Je kislina peptid 82 amino izveden iz proteina predhodnikov nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 je sestavljen iz 396 amino kislin, ki sestoji iz dveh EF znamke motivov in vezavo DNA domena [1], [3]. Post-translacijske predelava, ki jo prohormon convertases (PC 1/3 in PC 2) povzroči NUCB2 se razcepi v tri peptide, nesfatin-1 (1-82 aminokisline), nesfatin-2 (85-163 aminokisline), in nesfatin- 3 (166-396 aminokisline). NUCB2 /nesfatin-1 aminokislinsko zaporedje je zelo ohranjena čez vretenčarjev [6] [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 je na voljo v različnih hipotalamusa jeder, ki sodelujejo pri presnovi energije, kot ločni jedra, paraventricular jedra, supraoptic jedra, bočni hipotalamus območje in jajčne increta [8], [9]. proizvajajo insulin beta celice, co-express nesfatin-1 v pankreatičnih otočkih podgan in miši [2], [4], [11], kar kaže, da nesfatin-1 bi lahko imeli pomembno vlogo pri izločanja inzulina in glukoze homeostaze [4], [29]. Grelina in NUCB /nesfatin-1 so colocalized v želodcu oxyntic žleze sluznice pri glodavcih [13] in ljudi [16]. NUCB2 mRNA izraz v očiščenih endokrinih celicah želodca sluznice je bilo ugotovljeno, da je višja kot v možganih podgan [13]. Celotna dolžina NUCB2 protein opazili v majhnih in velikih črevesje in jetra podganjih samcev in ICR miši [5]. Široka porazdelitev NUCB2 /nesfatin-1 v osrednje in obrobne tkiv kaže na vlogo nesfatin-1 pri uravnavanju presnove.

Dnevno dajanje nesfatin-1 je povzročila razširjeno zmanjšanje vnosa hrane in telesne teže [1] . Intracerebroventrikularno dajanje NUCB2 zavira vnos hrane, telesne teže in podkožja, mezenteričnih in maso epididimalno maščob pri odraslih podganah v odvisnosti od odmerka. Poleg tega NUCB2 rasklapanje pri podganah z infuzijo protismiselno morfolino oligonukleotid (as-MON) povzročila povečanje apetita in telesne teže [1]. Znotraj paraventricular jedro injekcija nesfatin-1 zmanjšuje skupni vnos hrane na 1 do 3 ure [9]. Intraperitonealne injekcije nesfatin-1 za posledico zmanjšanje vnosa hrane v leptin odporno db /db
miši in z visoko vsebnostjo maščob prehrane krmljene miši [8]. Nesfatin-1 je sestavljen iz 3 strukturnih fragmentov in le sredi fragmenta (ostanki 24-53; M30) iz nesfatin-1 je vključena v proizvodnjo anorektični odgovorov [15], [28]. Skupaj ti rezultati jasne dokaze, ki podpirajo sitosti učinke nesfatin-1.

Nesfatin-1 je obrok odziven glukoregulacijskega hormone [12], [13], in trebušne slinavke otočki podgan javnost NUCB2 v odgovor na glukozo [14]. Pri ljudeh, je bilo glukoze obravnavajo teme višje bazalnih vrednosti nesfatin-1 v primerjavi s kontrolnimi osebami [10]. V MIN6 celicah, so opazili povečanje 4-krat v nesfatin-1 ravni, ko smo celice inkubirali v veliko glukoze (16,7 mm), v primerjavi z nizko glukozo (2,0 mm) [4]. Nesfatin-1 okrepljeno glukoze stimulira izločanje inzulina iz kultiviranih MIN6 celic, ki so bile inkubiranih v visoko glukozo kot nizko glukozo v skladu z odmerkom odvisne [4]. V trebušne slinavke v streptomicinsko (STZ) -injected miši z diabetes tipa 1, je bilo ugotovljeno, da sta bila oba NUCB2 in preproinzulin mRNA izraz bistveno nižji [4]. V nasprotju s tem pa je bil povečan nesfatin-1 co-lokalizacija z insulinom najdemo v otoček beta celic z visoko vsebnostjo maščob, prehrana povzroča debelih miših z diabetesa tipa 2. Nesfatin-1 ima tkiva posebne učinke na glukoze vnosa v podganjih adipocitov in mišic [30]. Na splošno, nesfatin-1 izvaja pomembno vlogo pri urejanju celotne glukoze v telesu in energetske homeostaze.

Čeprav nesfatin-1 se pojavlja kot pomemben obrok odzivno peptida [1], [12] [13] [30] , kaj sproži njeno izločanje ostaja nejasna. Kaj prehrana komponente sproži po obrok izločanje nesfatin-1? To vprašanje še nenaslovljene. Glavni cilj te raziskave je ugotoviti, kako različni hranila lahko modulirajo celic NUCB2 /nesfatin-1 in vitro
in kultivirani želodcu ghrelinoma (MGN3-1) iz miši in in vivo
pri moških miši. Naši rezultati naših in vitro
študije kažejo, da MGN3-1 celice različno odzivajo na hranil, ki izločajo NUCB2 /nesfatin-1 in grelina. Podobno, akutne ali kronične vnos hranil ne vpliva NUCB2 mRNA izražanja in NUCB2 /nesfatin-1 javnost na poseben način prehrane.

Etika Izjava materiale in metode

Vse študije na živalih, izpolnjene s kanadsko smernic Sveta za varstvo živali, in jih je odobrila Research etiko sveta živali univerze Saskatchewan (Protokol številka 2012-0033).

in vitro
študije

Mouse želodec ghrelinoma (MGN3-1) celice [17] smo kultivirali v DMEM (Invitrogen, Ontario, Kanada, Cataloguew95-040), ki je bila dopolnjena z 10% fetalnega govejega seruma (Invitrogen, Catalogue|84 ) in 1% penicilin (100 U /ml) in streptomicinom (100 mg /ml) (Invitrogen; Catalogue.140-122) pri 37 ° C v 10% CO _{2. Pri 80% konfluentne so MGN3-1 celice zasejali na 6 x 10 ^{6 celic /tudi v 12-tudi ploščo in študije so bile izvedene, ko so bile celice 80-90% konfluentne. V vsaki študiji smo ponovili trikrat in podatki iz treh študij združimo, da dobimo n = 9-12 Wells /zdravljenja. Da se ugotovi, ali so imeli glukoze učinek v dozi in odvisnosti od časa, smo celice inkubirali 1 uro in 2 uri z 5,6, 25, 50 in 100 mM glukoze DMEM medijem. Celoten medij rast MGN3-1 celic zahteva, da se jih raste na visoki ravni glukoze, ki je 25 mm. V zvezi študij maščobnih kislin in aminokislin, smo izvedli te študije z uporabo DMEM na nizki ravni glukoze (5,6 mm), ker je uporaba srednje visoko raven glukoze (25 mm) lahko prikrije vpliv posameznih hranil na NUCB2 /nesfatin -1 izločanje in sinteza. Glede dolgoverižnih maščobnih kislin, smo testirali učinek treh različnih maščobnih kislin, ki uporabljajo linolenske kisline (Sigma-Aldrich, Ontario, Kanada; Izdelek # L2376), oktanojske kisline (Sigma-Aldrich; vozila # C2875) in oleinska kislina (Sigma -Aldrich; Izdelek # O1383). Celice inkubiramo 4 ure pri posameznih maščobnih kislin na 0, 1, 10, 100 um. Uporabili smo L-triptofan (Sigma-Aldrich; stroja # T8941) testirati učinek amino kisline na NUCB2 izločanje in sintezo. Celice inkubiramo 4 ure z L-triptofan po 0,7, 1, 10 mM. L-triptofan je prisoten v kontrolnega medija (5,6 mM DMEM glukoze) v minimalni dozi 0,7 mm, kar je bistvenega pomena za njihovo stanje rasti.}}

in vivo
študije

za kronično hranjenje diete, ki vsebujejo različne količine hranilne snovi, starost in težo ujema (5 tednov stari, povprečno telesno težo: 20 gramov) samce C57BL /6 miši (Charles River Laboratories, Quebec, Kanada) so bile nastanjene individualno za 17 tednov na 12 ur svetlobe na: 12 ur zatemnitve (luči off ob 7. uri in na ob 7. uri), temperatura in vlažnost nadzorom vivariju. Miši so bile razdeljene v štiri skupine krmljenih o nadzoru (n = 6), visoka ogljikovih hidratov (n = 7), veliko beljakovin (n = 7), in z visoko vsebnostjo maščobe (n = 7), dieto z ad libitum
dostop do vode in njihovo specifično prehrano. Vse diete so bile kupljene od raziskovalnih diete (New Brunswick, NJ). Vsebnost kalorij diete so: kontrola (# Product D12451): 4.73 kcal /gm z 20% energije, ki izvira iz beljakovin, 35% energije, pridobljene iz ogljikovih hidratov in 45% energije, pridobljene iz maščob; visoko vsebnostjo ogljikovih hidratov (Product # D12450J) je imel 3,8 kcal /gm z 20% energije, ki izvira iz beljakovin, 70% energije izvira iz ogljikovih hidratov, 10% energije, pridobljene iz maščob; veliko beljakovin (Product # D08091802) je imel 3,8 kcal /gm z 60% energije, ki izvira iz beljakovin, 30% energije izvira iz ogljikovih hidratov, 10% energije, pridobljene iz maščob in visoko vsebnostjo maščob (Product # D12492) je imel 5,2 kcal /gm z 20% energija izvira iz beljakovin, 20% energija izvira iz ogljikovih hidratov in 60% energije, pridobljene iz maščob. Vse miši smo hranili s kontrolno prehrana za en teden pred začetkom njihove posebne diete. Uživanje hrane, telesna teža in glukoze v krvi branja objavili 4 ure hitro Izmerili smo enkrat na teden za 17 tednov

Za akutno uprave hranil, starosti in teže ujema (stari 5 tednov, povprečno telesno težo.: 20 gramov) moški C57BL /6 miši (Charles River Laboratories, St Constant, QU, Kanada) so bile nastanjene individualno za 1 teden in 2 dni v 12 h lučjo: 12 h zatemnitve (luči off ob 7. uri in ob 7. uri ), temperatura in vlažnost nadzorom vivariju. Miši aklimatizacije 1 teden po prihodu in je ad libitum dostop do vode in redno miške večerjo za 11 dni. Ker izvajamo akutno študijo prehrane, smo morali živali za aklimatizacijo na ustnem postopku gavaža. aklimatizacije smo miši do tega postopka tako, da jih gavaging z vodo iz pipe za 2 dni pred eksperimentalno dan. Na 12 ^{th dan so bile miši postimo 4 ure in so bili gavaged s posebnim tekoči dieti. Miši so bile razdeljene v 4 skupine: Visoka beljakovin (Isopure Protein Drink, Zero Carb - Mango breskev okus; Narava je najboljši, Clifton Park, New York; n = 7), visoko vsebnostjo maščob (Splendido, hladno stiskano ekstra deviško oljčno olje, predsednika Choice , Kanada; n = 7), visoka ogljikovih hidratov (D-glukoza; BioShop; Catlogue # GLU501.500; n = 7) in vodo (voda iz vodovoda; n = 7). Na dan študije je bila 200 ul v zgornji hranil /vode damo mišim oralno. Vrednosti glukoze v krvi je delo na 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 in 120 minut, in kri zberemo v 15, 30, 60 in 120 minut za analizo ELISA za določanje obtoku ravni NUCB2 /nesfatin -1. Tkiva (želodec, tanko črevo [dvanajstniku], debelem črevesu in jetra) so bili zbrani iz vsake miši ob koncu študije (globoko izofluran usmrtitve sledi cervikalno dislokacijo). Da bi ohranili doslednost, čas in trajanje vsakega poskusa, kirurgije in odvzem vzorcev so konstantna za vse študije.}

Total RNA Pridobivanje in cDNA Sinteza

Celice ali tkiva so bili zbrani iz vsake študije za primerjavo NUCB2 mRNA izraz. Od miši je bil opravljen kronično študijo prehrana, tkiva (želodcu, tanko črevo, debelo črevo in jeter) so bile pridelane takoj po evtanaziji. Celotno RNA je bila vzeta iz celic in tkiv MGN3-1 z uporabo izolacijskega reagenta TRIzola RNA (Invitrogen). RNA čistost je bila potrjena z optično gostoto (OD) absorpcijsko razmerje (OD 260 nm /OD 280 nm) z uporabo NanoDrop 2000C (Thermo, Vantaa, Finska). Samo vzorci z absorpcijsko razmerje večje od 1,8 bili uporabljeni za sintezo cDNK. Sinteza cDNA je bila izvedena s pomočjo iScript cDNA sintezo komplet po navodilih proizvajalca (BioRad, Kanada).

RT-PCR in kvantitativnih Real Time PCR

RT-PCR in QRT-PCR za NUCB2, grelina in RT-PCR za PC 1/3 in PC 2 so bile izvedene kot po pogojih, navedenih v tabeli 1, s pomočjo sistema za CFX Connect PCR v realnem času Detection (Bio-Rad). Za analizo QRT-PCR, smo mRNA Izražanje NUCB2 normalizirajo uporabo beta-aktin kot gen gospodinjstvu. PCR produkti za NUCB2 v želodcu, jetrih in debelem črevesu in teh genov (NUCB2, grelina, PC 1/3 in PC 2) v celicah MGN3-1 smo elektroforezo na 1% agaroznem gelu za preverjanje transkriptov ojačani. Na podlagi predhodnih raziskav [4], smo uporabili beta-aktin kot notranji nadzor za normalizacijo signal NUCB2 mRNA. Pri uporabi celotne RNA, kjer je mRNA količinsko zelo natančen, kritične mejne vrednosti za beta-aktina ni pokazala variabilnost. Relativna NUCB2 mRNA izraz je normaliziran z beta-aktina iz istega vzorca v skladu z metodo Livak [31].

imunocitokemija in mikroskopija

MGN3-1 celice smo gojili v Slide sistem Labtek senat (Nalge Nunc International, Rochester, NY) in pustimo, da rastejo do konfluence v bližini. Celice smo sprali z 1X raztopino fosfatnega pufra (PBS; 2 x 5 min, 25 ° C) in pritrjen na 4% paraformaldehida raztopine (PFA) v 1X PBS 10 minut pri 25 ° C, čemur sledi drugo pralno z 1X PBS ( 3 × 5 minut, 25 ° C). Osnovna celice smo permeabiliziramo v raztopini 0,3% Triton-X (Bioshop, Burlington, Ontario, Kanada) v 1X PBS 5 minut pri sobni temperaturi. Ploščice smo inkubirali v pufru za blokiranje, ki vsebuje 10% seruma koz v 1X PBS 1 uro pri sobni temperaturi. Celice smo nato inkubirali v primarno protitelo (tabela 2) pri 4 ° C preko noči. Ploščice smo sprali s PBS (3 x 5 minut, 25 ° C) in inkubirali pri sekundarnih protiteles (tabela 2, protitelo PC1 /3 je velikodušno darilo od Dr. Iris Lindberg, University of Maryland School of Medicine), za 4 ure na sobna temperatura. Na koncu so diapozitivi sprali s PBS (3 x 5 minut, 25 ° C) in so nameščeni na Vectashield montažo medij, ki vsebuje 4 ", 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Kanada).

Celice ogledov z uporabo Nikon Eclipse-TI obrnjeno fluorescentni mikroskop (Nikon, Mississauga, Ontario, Kanada) in slike so bile posnete z Nikon DS-Qi1 MC fotoaparat (Nikon). Slike so bile analizirane z NIS-Elements osnovno raziskovalno opremo (Nikon) na Dell HP delovno postajo. Slike so prikazane reprezentativne celic barvanega za ghrelin, NUCB2, PC 1/3 in PC2. Za visoko slikanje resolucije, so gledano celice, analizirajo in slike posnete z Leica TCS SP5 konfokalnim mikroskopom.

Western Blot Analiza, Imunohistokemija in fluorescenčno mikroskopijo

Za potrjuje prisotnost nucleobindin-2 (NUCB2) v črevesju in jetrih, tri, 3 mesece smo uporabili stare C57BL /6 miši moškega spola. Na kratko, so bili zbrani jeter ter tanko in debelo črevo, in ločeno za zahodno analize ali imunohistokemiji. Robčki za Western blot homogenizirano v T-PER tkivo beljakovin ekstrakcije reagenta (Thermo znanstvenega,̑10) sledi beljakovin določitev koncentracije s Bradford testom. Vzorci so bili pripravljeni v 1X Laemmli pufru, ki vsebuje 0,2% 2-merkaptoetanola (Bio-Rad,¡-0737 in -0710) in nato smo kuhali pri 95 ° C za 5 minut, čemur sledi vrtinčenjem. Obseg celoten vzorec (20 xl), od katerih vsaka vsebuje 50 mikrogramov proteina ali sintetičnih rat nesfatin-1 (ABGENT, 1 pg /ul; prej uporabljali v 4, 29) je bil naložen na gel, in vodijo v Mini-Protean TGX 8-16 % gradient gel (Bio-Rad,Lj-1104). Po ločitvi, so proteini prenese na 0,2 um BioTrace nitrocelulozno membrano (Pall biosistemske vede,đ77-000) in nato membrane blokiran 1X RapidBlock raztopine (AMRESCO, # M325). NUCB2 detekcija proteina smo izvedli s pomočjo kunčjega anti-nesfatin-1 (kataloška številka H-003-22; 1:500 redčenja, Phoenix Pharmaceuticals, Kalifornija) in GAPDH protein smo zaznali z uporabo kuncev protiseruma usmerjenega proti miške GAPDH (AbDSerotec, # AHP1628 ) razredčimo 1:1000. Kot sekundarnih protiteles, kozjega anti-kunčjega IgG (H + L) HO konjugata (Bio-Rad,ª-6515) razredčenega 1:3000 bila uporabljena. Za beljakovin vizualizacijo smo membrano inkubirali 5 minut pri Clarity Western ECL substrata (Bio-Rad,ª-5061) in posneli s pomočjo ChemiDoc MP slikovnega sistema (Bio-Rad,ª-8280) z zaznavanjem kemiluminiscentnim. Membrane odstranjevanje med detekcijo proteinov je bila izvedena s pomočjo Restore PLUS western blot odstranjevanje buffer (Thermo Scientific,ǐ30). Natančne plus beljakovin dvojna Xtra standardi (Bio-Rad,¡-0377), so bili uporabljeni kot označevalcev molekulsko maso.

Za Imunohistokemične študije, tkiva, zbrani v 4% formaldehidu so bile za 24 ur pri 4 ° C. Fiksir bil nadomeščen z etanolom (tremi 70% etanola), vsak sledi 10-minutni inkubaciji pri 4 ° C. Tkivo je bilo nato shrani v 70% etanolu pri 4 ° C in so bili predelani in prerezana na Prairie diagnozo Services Inc (PDS Inc., Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan). Parafinski odseki 4 um debeline so bili pripravljeni za imunskim barvanjem. Ti odseki so bili deparaffinized s ksilenom (dvakrat inkubirana pri 100% ksilena, 5 minut, 25 ° C) in rehidrirane stopenjsko etanola niza (dvakrat inkubirana v 100% etanolu in enkrat v vsakem 95% etanola, 70% etanola, 50% etanol, 2 minuti vsak, 25 ° C). Odseki smo nato inkubirali s 3% vodikovega peroksida v destilirani vodi blokirati endogene peroksidaze aktivnost (30 minut pri sobni temperaturi). Odseki smo nato blokirali z seruma protein blok reagenta (DAKO Corporation, Kalifornija) za 10 minut, nato pa inkubirana s primarnimi protitelesi. Ti odseki smo nato inkubirali z kunčjega anti-nesfatin-1 (kataloška številka H-003-22; 1:500 redčenja, Phoenix Pharmaceuticals, Kalifornija) za 24 ur pri sobni temperaturi. Vsi preparati so trikrat nato sprali z 1x PBS in inkubiramo s kozjega anti-kunčjega Texas Red IgG (Red-Nesfatin-1; Kataloška številka TI-1000; 1:100 redčenje Vector Laboratories, California) sekundarno protitelo za 1 uro pri sobni temperature. Vse osnovne in srednje protitelesa smo razredčili v redčila protitelesa reagenta (DakoCytomation, Mississauga, Ontario). Drsniki speremo trikrat z 1x PBS in sedem krat z destilirano vodo. Na koncu so bili diapozitivi, vgrajene v Vectashield medij, ki vsebuje DAPI jedrsko barvanje (Modri; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija). Oddelki so vidna v okviru Nikon Eclipse Ti-E obrnjenem fluorescenčni mikroskop (Nikon Kanadi, Mississauga, Kanada). Slike so bile posnete z Nikon DS-Qi1 MC ohlajeno enobarvni kamero priključen na računalnik Dell HP delovno postajo in NIS elementov temeljne raziskave slikanje programske opreme (Nikon Kanada, Mississauga, Kanada). Samo reprezentativne slike malih in velikih črevesa barvanjem za NUCB2 /nesfatin-1 z DAPI so prikazani v poglavju rezultati.

Nesfatin-1 /NUCB2 Ravni v serumu in mediji

Da bi raziskali odvisno hranilo spremembe v NUCB2 /nesfatin-1 izločanja iz MGN3-1 celic, smo medije po posebnih inkubacijske dobe zbrali. Da bi preprečili celične ostanke smo vzorce centrifugirali (13.000 vrtljajev na minuto za 10 minut pri 4 ° C) in v zgornjem 700 p.L smo shranili pri -20 ° C, dokler nesfatin-1 meritve. Za merjenje kroži NUCB2 /nesfatin-1 je kri zbrana na 7 a.m (kmalu po tem, ko začne svetloba faza), 1 popoldne (sredina svetlobnega fazo) in 7 p.m (pred začetkom temno faza). Vzorce krvi je bilo dovoljeno strjevanju na ledu in serum ločimo s centrifugiranjem (7000 obr 9 minut pri 4 ° C) in shranimo pri -20 ° C, dokler niso bile izvedene teste. NUCB2 ravni /Nesfatin-1 izločanje v medijih so bile izmerjene z uporabo Nesfatin-1 (1-82) (Rat) ELISA kit (Kataloška številka EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Kalifornija). Mejo občutljivosti metode bila 1,2 ng /ml za nesfatin-1, z zaznavno območju od 0,1-1000 ng /ml. Znesek imunoreaktivnih materiala smo določili z uporabo nelinearne regresije krivulje-fit, ki je bila uporabljena za količinsko in primerjavo koncentracije NUCB2 /nesfatin-1 izločanje v serumskih vzorcih in medijev.

NUCB2 /Nesfatin- 1 ravni v serumu in ravni medijske in Total ghrelin v medijskem

Da bi raziskali hranil odvisne spremembe v NUCB2 /nesfatin-1 in skupno izločanje ghrelin od MGN3-1 celic, so mediji po posebnih inkubacijske dobe zbirajo. Da bi preprečili celične ostanke smo vzorce centrifugirali (13.000 vrtljajev na minuto za 10 minut pri 4 ° C) in v zgornjem 700 p.L smo shranili pri -20 ° C, dokler NUCB2 /Nesfatin-1 in celotne meritve ghrelin. Vzorce krvi je bilo dovoljeno strjevanju na ledu in serum ločimo s centrifugiranjem (7000 obr 9 minut pri 4 ° C) in shranimo pri -20 ° C, dokler niso bile izvedene teste. NUCB2 /Nesfatin-1 stopnje izločanja v serumu in mediji so bile izmerjene z uporabo Nesfatin-1 (1-82) (Rat) ELISA kit (Kataloška številka EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Kalifornija). Mejo občutljivosti metode bila 1,2 ng /ml za nesfatin-1, z zaznavno območju od 0,1-1000 ng /ml. Prav tako je bil celoten obseg izločanja grelina v medijih merijo v ghrelin (podgana, miš) EIA kit (Kataloška številka EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc, Kalifornija). Mejo občutljivosti metode bila 1,16 ng /ml za skupno ghrelin z zaznavno območju od 0-100 ng /ml. Znesek imunoreaktivnih materiala smo določili z uporabo nelinearne regresije krivulje-fit, ki je bila uporabljena za količinsko in primerjavo koncentracije NUCB2 /nesfatin-1 izločanje v serumskih vzorcih in medijev.

Statistična analiza

Analize kvantificiranih podatkov QRT-PCR in ELISA smo opravili z uporabo One-Way ANOVA, ki mu sledi preskus multiple primerjave Tukey je. GraphPad Prism različice 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, ZDA) je bila uporabljena za statistične analize in grafe. Pomen je bila dodeljena, ko p < 0,05. Podatki so izraženi kot povprečje ± SEM.

Rezultati

NUCB2, PC 1/3 in PC 2 mRNA so izražene v MGN3-1 celicah in NUCB2 mRNA je izražena v želodcu, jetrih, majhna čreva in debelo črevo za male miši

Ugotovili smo izražanje NUCB2 (202 bp), prohormon konvertaze 1/3 (400 bp), in prohormon konvertaze 2 (406 bp) mRNA v MGN3-1 celic (sl. 1A). NUCB2 (202 bp) mRNA izraz je bila odkrita tudi v želodcu, jetrih, tankega in debelega črevesa moških C57 /BL6 mišim (sl. 1B). Absolutni ravni NUCB2 mRNA izražanja v želodcu so bile višje od NUCB2 mRNA izražanja v jetrih, tankem črevesu in debelem črevesu (sl. 1C).

MGN3-1 celice immunopositive za ghrelin, NUCB2 /Nesfatin-1 , PC 1/3 in PC 2

fluorescenčno mikroskopijo prikaže MGN3-1 celice obarvane z anti-nesfatin-1 protitelesa (Texas-rdeče barve;. Slika 2B) in anti-ghrelin protitelesa (FITC-Green, sl. 2A) je pokazala jasno sodelovanje lokalizacije (rumena,. slika 2c) nesfatin-1 in ghrelin radioinkorporacijo. Vendar pa nekateri ghrelin pozitivne celice niso bile imunoreaktivnega za nesfatin-1 (sl. 2C). MGN3-1 celice pokazala PC 1/3 radioinkorporacijo (Texas Red,. Slika 2D) in PC 2 radioinkorporacijo (Texas Red, slika 2E.). DAPI (Blue) obarvajo jedro vseh celic, vključno s tistimi celicami ne pozitivnih za beljakovine raziskano. Kontrolni drsi obarvajo s samim sekundarnim protitelesom (sl. 2F) ni radioinkorporacijo. Konfokalni slikanje pokazala MGN3-1 celice obarvane z anti-nesfatin-1 protitelesa (Texas-Red, slika 3A.) In anti-grelina protitelesa (FITC-Green,. Slika 3B) je pokazala jasno sodelovanje lokalizacije (rumena,. Slika 3C) od nesfatin-1 in ghrelin radioinkorporacijo. Negativna kontrola se obarvajo z zgolj samo sekundarnih protiteles (sl. 3D).

NUCB2 protein izraz v debelem črevesu, tankem črevesu in jetrih iz mišjih

NUCB2 beljakovine je izraženo v debelem črevesu, tanko črevo in jetra iz mišjih samcih, ki kažejo poseben pas za NUCB2 ustreza približno 50 kDa. Rat nesfatin-1 peptid uporabimo kot pozitivno kontrolo je prikazan kot ločen trak, ki ustreza približno 10 kDa (slika 4A;. Levi sliko). Vendar pa ni trakovi, ki kažejo popolnoma predelana nesfatin-1 so bili vidni pri 10 kDa v vzorcih tkiva (slika 4A;. Levo sliko). Našli smo tudi pasove približno 47 kDa pod kDa pasu 50 v tankem črevesu in jetrih, vendar ne v debelem črevesu (slika 4A;. Levi slike). Ločena skupina za GAPDH uporablja kot gen za nadzor house-vodenje so opazili pri 37 kDa prikazana v vseh tkivih (slika 4A;. Desno slika). NUCB2 /nesfatin-1 radioinkorporacijo najdemo v sluzničnih celic tankega črevesa (slika 4B;. Levo sliko) in debelo črevo (slika 4B;. Desna slika).

Učinki glukoze in L-triptofan na NUCB2 mRNA izraz v in NUCB2 /nesfatin-1 izločanje iz MGN3-1 celic

Cells inkubiranih pri 100 mM glukoze DMEM imelo višjo NUCB2 mRNA izraz kot celic inkubiranih pri 5,6, 25 in 50 koncentracije glukoze mM DMEM na 1 urni post-inkubacija (sl. 5A). 2 uri po inkubaciji smo celice inkubirali pri 100 mM DMEM bistveno višja v NUCB2 ekspresijo mRNA od celic inkubiranih na 5,6 in 50 mM glukoza DMEM (sl. 5c). 1 uro (sl. 5b) in 2 uri (sl. 5D), ni bilo bistvenih razlik v NUCB2 /nesfatin-1 izločanje. NUCB2 mRNA izraz je bila bistveno višja v celicah, inkubiranih pri 10 mM L-triptofan (sl. 5E) v primerjavi s celicami inkubiranih na 0,07 in 1,0 mM L-triptofan. NUCB2 /nesfatin-1 izločanje iz celic inkubiranih pri 1,0 in 10,0 mM L-triptofan je bila bistveno višja od celic inkubiranih pri 0,7 mM L-triptofan (sl. 5F).

Vpliv linolenske kisline, oktanojske kisline in oleinske kisline na NUCB2 mRNA izražanja v in NUCB2 /nesfatin-1 izločanje iz MGN3-1 celic

Ugotovili smo, NUCB2 mRNA izraz bistveno zmanjša v celicah, ki so se zdravili z 1, 10 in 100 LM oleinske kisline (sl. 6e) v primerjavi s kontrolo. v celicah, zdravljenih z linolensko (sl. 6a) in oktanojske kisline (sl. 6c) niso opazili nobenih sprememb v NUCB2 mRNA. Nadalje je NUCB2 /nesfatin-1 izločanje nespremenjeno v celicah, obdelanih z različnimi odmerki linolenske kisline (sl. 6B), oktanojske kisline (sl. 6D), in oleinske kisline (sl. 6F).

Vpliv L-triptofan, linolenska kislina, oktanojska kislina in oleinska kislina samostojno grelina mRNA izražanja v in skupno izločanje grelina od MGN3-1 celic

Ni spremembe v ghrelin mRNA (S1A sliki) in skupno izločanje ghrelin (S1B sliki ) je bilo ugotovljeno, ko smo celice obdelali z različnimi odmerki glukoze po 1 uro inkubacije. Grelina mRNA izraz je bila bistveno višja v celicah, inkubiranih v 1 mM L-triptofan (sl. 7A), v primerjavi s celicami inkubiranih pri 0,07 in 10 mM L-triptofan. Ni bistvenih razlik v skupni izločanje ghrelin iz celic obdelanih z različnimi odmerki L-triptofana (sl. 7B). Ugotovili smo, ne spremeni grelina ekspresijo mRNA (sl. 7C), vendar skupaj izločanje grelina bila visoka iz celic inkubiranih pri 100 uM linolenske kisline (sl. 7D) v primerjavi nadzirati, 1 in 10 uM doz. Nobenih sprememb v ghrelin mRNA (sl. 7E) in skupno izločanje ghrelin (sl. 7F) Ugotovljeno je bilo, ko smo celice obdelali z različnimi odmerki oktanojske kisline. Medtem so grelina mRNA (sl. 7H), ter skupno izločanje grelina (sl. 7I) bistveno višja v celicah, obdelanih s 100 uM oleinska kislina, v primerjavi s kontrolo, 1 in 10 uM oleinske kisline.

Kronična učinki hranil na NUCB2 mRNA izražanja in serumu NUCB2 /nesfatin-1 v miši

telesno težo, vnos hrane in glukoze v krvi profil miši hranjene na različnih dietah so prikazani v S2 sliki. Miši hranjene na visoko vsebnostjo maščob prehrana imela precej nizke ekspresije NUCB2 mRNA v želodcu primerjavi s tistimi hranili na kontrolo, visoke beljakovine ali visoke dietah ogljikovih hidratov (sl. 8A). Ni bilo bistvene razlike v izražanju NUCB2 mRNA v tankem črevesu med miših, krmljenih o nadzoru, visoko beljakovin, z visoko vsebnostjo ogljikovih hidratov in visoko vsebnostjo maščob dietah (sl. 8B). Miši hranili na visoki beljakovin in mastno diete imajo relativno nizko izražanje NUCB2 mRNA v debelem črevesu kot miši hranjene na kontrolne ali visok ogljikohidratnih diet (sl. 8c). Miši hranjene na dieti z visoko beljakovin še eno pomembno nizko izražanje NUCB2 mRNA v jetrih kot miši hranjene na drugih dietah (sl. 8D). Ob 7. a.m, ni bilo razlik v serumu nesfatin-1 /NUCB2 ravni pri miših, krmljenih različne diete (sl. 9a). Na 1 p.m, imel miši prehrana z visoko vsebnostjo ogljikovih hidratov krmijo bistveno višjo serum nesfatin-1 /NUCB2 v obtoku (sl. 9B). Serum nesfatin-1 je /NUCB2 bistveno nižja v miši hranili veliko ogljikovih hidratov, veliko beljakovin ali visoko maščobe, v primerjavi s kontrolno prehrana krmljene miši ob 7. uri (Sl. 9C).

Akutni učinki hranil na NUCB2 ekspresijo mRNA glukoze v krvi in ​​serumu NUCB2 /nesfatin-1 na miših

ni prišlo do bistvenih sprememb v izražanju NUCB2 mRNA v želodcu (sl. 10A), tankega črevesa (sl. 10B), debelo črevo (sl . 10C) in jeter (sl. 10D) med miši hranjene na visoki proteina, z visoko vsebnostjo ogljikovih hidratov, visoko vsebnostjo maščob ali vode.

• Plos ONE: Kakšne vrste kapsule endoskopa je primerna za krmiljenim lastni pogon kapsule endoskopa? Eksperimentalna študija Uporaba prašičjo Želodec Model za klinično uporabo (z Videos)
• Plos ONE: Želodec temperature Records odkriti Zdravstvena Obnašanje in Prehod na trdnih potrošnjo hrane pri sesnih sesalcih, Harbour Seal Pup (Phoca vitulina)