PLoS ONE: Næringsstoffer Differentielt Regulere Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro i kulturperler mave Ghrelinoma (MGN3-1) Celler og in vivo i hanmus

Abstrakt

Nesfatin-1 udskilles, mel-responsiv anorexigene peptid kodet i forstadiet nucleobindin-2 [NUCB2]. Cirkulerende nesfatin-1 stigninger postprandialt, men kosten komponenter, der modulerer NUCB2 /nesfatin-1 er fortsat ukendt. Vi antager, at kulhydrat, fedt og protein forskelligt regulere vævsspecifik udtryk for nesfatin-1. NUCB2, blev påvist prohormone konvertaser og nesfatin-1 i mus mave ghrelinoma [MGN3-1] celler. NUCB2 mRNA og protein blev også påvist i mus lever, og små og store tarmene. MGN3-1 celler blev behandlet med glukose, fedtsyrer eller aminosyrer. C57BL /6-mus blev kronisk fodret med højt fedtindhold, højt kulhydrat og højt proteinindhold kost i 17 uger. Kvantitativ PCR og nesfatin-1 assays blev anvendt til at bestemme nesfatin-1 ved mRNA og protein niveauer. Glucose stimulerede NUCB2 mRNA-ekspression i MGN3-1 celler. L-tryptophan også øget NUCB2 mRNA ekspression og ghrelin mRNA udtryk, og nesfatin-1-sekretion. Oliesyre inhiberede NUCB2 mRNA-ekspression, mens ghrelin mRNA-ekspression og sekretion blev styrket. NUCB2 mRNA-ekspression var signifikant lavere i leveren hos mus fodret med et højt proteinindhold kost sammenlignet med mus fodret andre diæter. Kronisk indtagelse af kost med højt fedtindhold forårsagede en signifikant reduktion i NUCB2 mRNA i maven, mens højt proteinindhold og højt fedtindhold kost forårsagede lignende undertrykkelse af NUCB2 mRNA i tyktarmen. Ingen forskelle i serum nesfatin-1-niveauer blev fundet i mus ved 7 a.m, ved begyndelsen af ​​den lette fase. Høj kulhydrat kost fodret mus viste signifikant forhøjede nesfatin-1-niveauer ved 13:00 Serum nesfatin-1 var signifikant lavere i mus fodret højt fedtindhold, protein eller kulhydrat i forhold til kontrollen ved 7 p.m, lige før den mørke fase. Mus, som modtog en bolus af højt fedtindhold havde signifikant forhøjet nesfatin-1 /NUCB2 på alle tidspunkter undersøgte post-sonde point, sammenlignet med kontrolmus og mus fodret andre diæter. Vores resultater for første gang viser, at nesfatin-1 moduleres af næringsstoffer

Henvisning:. Mohan H, Ramesh N, Mortazavi S, Le A, Iwakura H, Unniappan S (2014) Næringsstoffer Differentielt Regulere Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 In Vitro
i dyrkede mave Ghrelinoma (MGN3-1) Celler og In Vivo
i hanmus. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10,1371 /journal.pone.0115102

Redaktør: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, USA

Modtaget: May 1, 2014 Accepteret: November 18, 2014; Udgivet: 15 December, 2014

Copyright: © 2014 Mohan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Denne forskning er finansieret af en åben driftstilskud fra de canadiske Insitutes of Health Research (CIHR; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) og en Establishment Grant fra Saskatchewan Health Research Foundation (http://shrf.ca/). SU er en CIHR Ny Investigator. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Funders har ingen rolle i forskning eller manuskriptet forberedelse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 kodede mæthed og fedt-påvirke protein-1] er en potent anorexigene peptid impliceret i reguleringen af ​​energibalancen og glukose homøostase [1], [30]. Det er en 82 aminosyrepeptid afledt af precursorprotein, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 er sammensat af 396 aminosyrer, som består af to EF hand-motiver og et DNA-bindende domæne [1], [3]. Posttranslationel processering af prohormone konvertaser (PC 1/3 og PC 2) bevirker NUCB2 at blive spaltet i tre peptider, nesfatin-1 (1-82 aminosyrer), nesfatin-2 (85-163 aminosyrer), og nesfatin- 3 (166-396 aminosyrer). NUCB2 /nesfatin-1 aminosyresekvens er stærkt konserveret på tværs hvirveldyr [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 forekommer i forskellige hypothalamus-kerner, der er involveret i energistofskiftet, såsom den bueformede nucleus, paraventrikulære kerne, supraoptic kerne, lateral hypothalamus område og zona increta [8], [9]. Insulinproducerende betaceller co-udtrykker nesfatin-1 i de Langerhanske øer i rotter og mus [2], [4], [11], hvilket antyder, at nesfatin-1 kunne spille en vigtig rolle i insulinsekretion og glucosehomeostase [4], [29]. Ghrelin og NUCB /nesfatin-1 er colocalized i mavens oxyntic slimhinder kirtler hos gnavere [13] og mennesker [16]. NUCB2 mRNA-ekspression i oprensede maveslimhinden endokrine celler viste sig at være højere end i hjernen hos rotter [13]. Fuldlængde NUCB2 protein blev observeret i tynd- og tyktarmen og leveren hos hanrotter, og ICR-mus [5]. Den brede fordeling af NUCB2 /nesfatin-1 i centrale og perifere væv peger på en rolle for nesfatin-1 i reguleringen stofskiftet.

Daglig administration af nesfatin-1 forårsagede udvidet reduktion i fødeindtagelse og kropsvægt [1] . Intracerebroventrikulær administration af NUCB2 undertrykker fødeindtagelse, kropsvægt og subkutan, mesenteriske og epididymis fedtmasse i voksne rotter på en dosisafhængig måde. Desuden NUCB2 knockdown i rotter ved infusion antisense morpholino oligonucleotid (som-MON) medførte en stigning i appetit og kropsvægt [1]. Intra-paraventrikulære kerne injektion af nesfatin-1 reducerer kumulativ fødeindtagelse på 1 og 3 timer [9]. Intraperitoneale injektioner af nesfatin-1 resulterede i en reduktion i fødeindtagelsen i leptin resistent db /db Salg mus og kost med højt fedtindhold fodret mus [8]. Nesfatin-1 er sammensat af 3 strukturelle fragmenter og kun midten af ​​fragmentet (resterne 24-53; M30) af nesfatin-1 er involveret i produktion af anorektiske svar [15], [28]. Tilsammen udgør disse resultater giver klare beviser for, at støtte mæthed effekter af nesfatin-1.

Nesfatin-1 er et måltid lydhør glukoregulerende hormon [12], [13], og pancreasøer af rotter frigive NUCB2 som reaktion på glucose [14]. I humane studier, glucose behandlede forsøgspersoner havde højere basale nesfatin-1-niveauer i forhold til kontrolpersoner [10]. I MIN6-celler, blev en 4 gange stigning i nesfatin-1-niveauer observeret, når cellerne blev inkuberet i høj glucose (16,7 mM) sammenlignet med lav glucose (2,0 mM) [4]. Nesfatin-1 forøget glucose insulinudskillelse fra dyrkede MIN6 celler, som blev inkuberet i høj glucose end i lav glucose på en dosisafhængig måde [4]. I bugspytkirtlen af ​​streptozotocin (STZ) -injiceret mus med type 1 diabetes, blev det konstateret, at både NUCB2 og præproinsulingen mRNA-ekspression var betydeligt lavere [4]. I modsætning hertil blev forbedret nesfatin-1 co-lokalisering med insulin fundet i ø-beta-celler fedtrig kost-induceret fede mus med type 2 diabetes. Nesfatin-1 har vævsspecifikke effekter på glukoseoptagelse i rotteadipocytter og muskler [30]. Samlet set nesfatin-1 udøver vigtige roller i reguleringen hele kroppen glukose og energi homøostase.

Mens nesfatin-1 fremstår som en vigtig måltid lydhør peptid [1], [12], [13], [30] , hvad der udløser dets sekretion fortsat uklar. Hvad kost komponenter udløse efter måltid sekretion af nesfatin-1? Dette spørgsmål er stadig adresseløse. Hovedfokus i denne undersøgelse er at bestemme, hvordan forskellige næringsstoffer kan modulere NUCB2 /nesfatin-1 in vitro
i dyrkede mave ghrelinoma (MGN3-1) celler fra mus og in vivo
i mandlige mus. Vores resultater fra vores in vitro
undersøgelser viser, at MGN3-1 celler reagerer forskelligt på næringsstoffer i hemmelig NUCB2 /nesfatin-1 og ghrelin. Tilsvarende akut eller kronisk indtagelse af næringsstoffer gør indflydelse NUCB2 mRNA ekspression og NUCB2 /nesfatin-1 udgivelse i en kost specifik måde.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle undersøgelser med dyr overholdt den canadiske Råd Animal Care retningslinjer, og blev godkendt af Animal Research Ethics Board fra University of Saskatchewan (protokol nummer 2012-0033).

In vitro
Studies

mus mave ghrelinoma (MGN3-1) celler [17] blev dyrket i DMEM (Invitrogen, Ontario, Canada; Katalog.995-040), der blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen; Katalog|84 ) og 1% penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml) (Invitrogen; Katalog.140-122) ved 37 ° C i 10% CO _{2. Ved 80% sammenløb blev MGN3-1 celler podet ved 6 × 10 ^{6 celler /brønd i en plade med 12 brønde, og undersøgelserne blev udført, når cellerne var 80-90% sammenflydende. Hver undersøgelse blev gentaget tre gange og dataene fra tre undersøgelser blev poolet for at opnå en n = 9-12 brønde /behandling. For at bestemme om glucose havde en virkning i en dosis og tid afhængig måde, blev celler inkuberet i 1 time og 2 timer med 5,6, 25, 50, og 100 mM glucose DMEM-medium. Den komplette vækstmedium af MGN3-1 celler kræver, at de vokser i et højt glukose niveau, hvilket er 25 mM. I forhold til de undersøgelser udført med fedtsyrer og aminosyrer, vi udførte disse undersøgelser under anvendelse af DMEM ved lave glucoseniveauer (5,6 mm), eftersom anvendelse af en høj glucose medium (25 mm) kunne maskere virkningen af ​​de respektive næringsstoffer på NUCB2 /nesfatin -1 sekretion og syntese. Med hensyn til langkædede fedtsyrer, testede vi virkningen af ​​tre forskellige fedtsyrer ved hjælp linolensyre (Sigma-Aldrich, Ontario, Canada; Product # L2376), octansyre (Sigma-Aldrich; Product # C2875) og oliesyre (Sigma -Aldrich; Produkt # O1383). Cellerne blev inkuberet i 4 timer med hver fedtsyrer ved 0, 1, 10, 100 uM. Vi anvendte L-tryptophan (Sigma-Aldrich; Product # T8941) for at teste virkningen af ​​en aminosyre på NUCB2 sekretion og syntese. Cellerne blev inkuberet i 4 timer med L-tryptophan 0.7, 1, 10 mM. L-tryptophan er til stede i kontrolmedium (5,6 mM glucose DMEM) ved en minimumsdosis på 0,7 mM, hvilket er afgørende for deres vækst tilstand.}}

In vivo
Studies

i den kroniske fodring af diæter indeholdende forskellige mængder af specifikke næringsstoffer, alder og vægt-matchede (5 uger gamle, gennemsnitlig legemsvægt: 20 gram) C57BL /6 mus (Charles River Laboratories, Quebec, Canada) blev huset individuelt for 17 uger i en 12 timers lys: 12 timer mørke cyklus (lys slukket på 19:00 og om på 7:00), temperatur og fugtighed kontrolleret vivarium. Mus blev opdelt i fire grupper fodret med en kontrol (n = 6), høj kulhydrat (n = 7), højt proteinindhold (n = 7), og højt fedtindhold (n = 7) kost med ad libitum
adgang til vand og deres specifikke kost. Alle diæter blev købt fra Research Diets (New Brunswick, NJ). Indholdet af diæter kalorieindhold var: kontrol (Produkt # D12451): 4,73 kcal /g med 20% energi fra protein, 35% energi fra kulhydrat og 45% energi fra fedt; høj kulhydrat (Produkt # D12450J) havde 3,8 kcal /g med 20% energi fra protein, 70% energi fra kulhydrat og 10% energi fra fedt; højt proteinindhold (Produkt # D08091802) havde 3,8 kcal /g med 60% energi fra protein, 30% energi fra kulhydrat og 10% energi fra fedt, og højt fedtindhold (Produkt # D12492) havde 5,2 kcal /g med 20% energi fra protein, 20% energi fra kulhydrat og 60% energi fra fedt. Alle mus blev fodret med kontrolgruppen kost for en uge før start deres specifikke diæter. Fødeindtagelse, kropsvægt, og blodglukoseaflæsninger skrive 4 timer hurtigt blev målt en gang om ugen i 17 uger

For akut administration af næringsstoffer, alder og vægt-matchede (5 uger gamle, gennemsnitlige kropsvægt.: 20 gram) C57BL /6-mus (Charles River Laboratories, St. Constant, QU, Canada) blev holdt individuelt for 1 uge og 2 dage i en 12 timers lys: 12 timer mørke-cyklus (lyset slukket 7 PM og på 7 AM ), temperatur og fugtighed kontrolleret vivarium. Mus blev akklimatiseret i 1 uge ved ankomsten og havde ad libitum adgang til vand og regelmæssig musefoder i 11 dage. Da vi udfører en akut kost undersøgelse, vi havde brug for dyrene at akklimatisere til den mundtlige sonde procedure. Vi akklimatiseret musene til denne procedure ved hjælp af sondeernæring dem med ledningsvand i 2 dage forud for den eksperimentelle dag. På den 12 ^{th dag blev musene fastet i 4 timer og blev tvangsfodret med et specifikt flydende kost. Musene blev inddelt i 4 grupper: Høj protein (Isopure Protein Drink, Zero Carb - Mango fersken smag, Nature bedste, Clifton Park, New York; n = 7), High fedt (Splendido, koldpresset Ekstra Jomfru Olivenolie, President s Choice , Canada, n = 7), High kulhydrat (D-glucose; BioShop; Catlogue # GLU501.500; n = 7), og vand (ledningsvand, n = 7). På dagen for undersøgelsen blev 200 mikroliter af de ovennævnte næringsstoffer /vand administreres til mus ved oral sondeernæring. Blodglucosevisninger blev taget ved 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 og 120 minutter, og blod blev opsamlet ved 15, 30, 60 og 120 minutter for ELISA analyse for at bestemme cirkulerende niveauer af NUCB2 /nesfatin -1. Væv (mave, tyndtarm [tolvfingertarmen], tyktarmen og lever) blev indsamlet fra hver mus ved ophør af studiet (dyb isofluran eutanasi efterfulgt af cervikal dislokation). For at opretholde konsistens, timingen og varigheden af ​​hvert forsøg, operationer og prøvetagning blev holdt konstant for alle studier.}

Total RNA Extraction og cDNA Synthesis

Celler eller væv blev indsamlet fra hver undersøgelse at sammenligne NUCB2 mRNA-ekspression. Fra mus, der undergik den kroniske kost undersøgelsen, væv (mave, tyndtarm, tyktarm og lever) blev høstet umiddelbart efter aflivning. Totalt RNA blev ekstraheret fra MGN3-1 celler og væv under anvendelse af TRIzol RNA-isolering reagens (Invitrogen). RNA renhed blev valideret af optisk densitet (OD) absorption ratio (OD 260 nm /OD 280 nm) ved hjælp af en NanoDrop 2000c (Thermo, Vantaa, Finland). Kun prøver med en absorption forhold større end 1,8 blev anvendt til cDNA-syntese. Syntese af cDNA'er blev udført ved anvendelse iScript cDNA syntesekit som anvist af producenten (BioRad, Canada).

RT-PCR og Quantitative Real Time-PCR

RT-PCR og QRT-PCR for NUCB2, ghrelin, og RT-PCR til PC 1/3 og PC 2 blev gennemført som pr betingelser i tabel 1, ved hjælp af CFX Connect Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). På QRT-PCR-analyse, blev mRNA-ekspression af NUCB2 normaliseret under anvendelse beta-actin som et housekeeping-gen. PCR-produkter til NUCB2 i maven, leveren og tyktarmen og disse gener (NUCB2, ghrelin, PC 1/3 og PC 2) i de MGN3-1 celler blev elektroforeret i 1% agarosegel for at verificere transkripter amplificeret. Baseret på tidligere undersøgelser [4], anvendte vi beta-actin som en intern kontrol for at normalisere signalet fra NUCB2 mRNA. Ved anvendelse af total RNA, hvor mRNA kvantificering var meget præcis, de kritiske tærskelværdier for beta-actin viste ingen variation. Relativ NUCB2 mRNA ekspression blev normaliseret med beta-actin fra den samme prøve i henhold til den Livak metoden [31].

immunocytokemi og Mikroskopi

MGN3-1 celler blev dyrket i en Labtek Chamber Slide System (Nalge Nunc International, Rochester, NY) og lodes vokse til næsten konfluens. Celler blev vasket med 1X phosphatpufferopløsning (PBS; 2 × 5 minutter 25 ° C) og fikseret i 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning i 1X PBS i 10 minutter ved 25 ° C, efterfulgt af en anden vask med 1X PBS ( 3 × 5 minutter 25 ° C). De fikserede celler blev permeabiliseret i en opløsning af 0,3% Triton-X (BioShop, Burlington, Ontario, Canada) i 1X PBS i 5 minutter ved stuetemperatur. Slides blev inkuberet i blokeringsbuffer indeholdende 10% gedeserum i 1X PBS i 1 time ved stuetemperatur. Celler blev derefter inkuberet i primært antistof (tabel 2) ved 4 ° C natten over. Slides blev vasket med PBS (3 × 5 minutter, 25 ° C) og inkuberes med sekundært antistof (tabel 2; den PC1 /3 antistof var en generøs gave fra Dr. Iris Lindberg, University of Maryland School of Medicine) i 4 timer ved stuetemperatur. Endelig blev objektglassene vasket med PBS (3 x 5 minutter 25 ° C) og monteret med Vectashield mounting medium indeholdende 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada).

Cellerne blev vist ved hjælp af et Nikon Eclipse-Ti inverteret fluorescens mikroskop (Nikon, Mississauga, Ontario, Canada) og billeder blev taget med et Nikon DS-Qi1 MC kamera (Nikon). Billeder blev analyseret med NIS-Elements grundforskning software (Nikon) på en Dell HP Workstation. Billeder viste er repræsentative celler farvet for ghrelin, NUCB2, PC 1/3 og PC2. Til høj opløsning billeddannelse blev cellerne set, analyseret og billeder taget med et Leica TCS SP5 konfokalt mikroskop.

Western blot-analyse, Immunhistokemi og Fluorescence Microscopy

I bekræfter tilstedeværelsen af ​​nucleobindin-2 (NUCB2) i tarmen og leveren, tre, 3 måneder gamle C57BL /6 hanmus blev anvendt. Kort fortalt blev leveren, og små og store tarme indsamlet, og adskilt for vestlige analyse eller immunhistokemi. Væv til Western blot homogeniseret i T-PER væv protein udvinding reagens (Thermo Scientific,N.510) efterfulgt proteinkoncentration bestemmelse ved Bradford assay. Prøverne blev fremstillet i 1X Laemmli-puffer indeholdende 0,2% 2-mercaptoethanol (Bio-Rad,¡-0737 og -0710) og efterfølgende blev kogt ved 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af hvirvelbehandling. Hele prøvevolumen (20 pi) hver indeholdende 50 ug protein eller syntetisk rotte nesfatin-1 (ABGENT, 1 pg /pl; tidligere anvendt i 4, 29) blev fyldt på en gel, og kører i en Mini-PROTEAN TGX 8-16 % gradient gel (Bio-Rad,Lj-1104). Efter separation blev proteinerne overført til en 0,2 um Biotrace nitrocellulosemembran (PALL Life Sciences,.377-000), og derefter blev membranen blokeret i 1X RapidBlock opløsning (Amresco, # M325). NUCB2 protein detektion blev udført under anvendelse af kanin-anti-nesfatin-1 (Katalog nr H-003-22; 1:500 fortynding Phoenix Pharmaceuticals, California) og GAPDH protein blev påvist ved anvendelse af kanin-antiserum rettet mod muse GAPDH (AbDSerotec, # AHP1628 ) fortyndet 1:1000. Som sekundært antistof, ged anti-kanin IgG (H + L) HRP-konjugat (Bio-Rad,ª-6515) fortyndet 1:3000 blev anvendt. For protein visualisering blev membranen inkuberet i 5 minutter i Clarity Western ECL-substrat (Bio-Rad,ª-5061) og afbildet under anvendelse ChemiDoc MP imaging system (Bio-Rad,ª-8280) med kemiluminescensdetektion. Membran stripping mellem protein detektion blev udført ved hjælp af Restore PLUS western blot stripping buffer (Thermo Scientific,ǐ30). Præcisions plus protein dual xtra standarder (Bio-Rad,¡-0377) blev anvendt som molekylvægtsmarkører.

I immunhistokemiske undersøgelser, vævene opsamlede blev fikseret i 4% formaldehyd i 24 timer ved 4 ° C. Fiksativ blev erstattet med ethanol (tre 70% ethanol), hver efterfulgt af en 10 minutters inkubation ved 4 ° C. Væv blev derefter opbevaret i 70% ethanol ved 4 ° C og blev behandlet og sektioneret på Prairie Diagnostic Services Inc. (PDS Inc., Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan). Paraffin sektioner af 4 um tykkelse blev forberedt til immunfarvning. Disse snit blev afparaffiniseret med xylen (inkuberet to gange i 100% xylen; 5 minutter, 25 ° C) og rehydreret i en gradueret ethanolserie (inkuberet to gange i 100% ethanol, og en gang i hver 95% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol, 2 minutter hver, 25 ° C). Snittene blev derefter inkuberet med 3% hydrogenperoxid i destilleret vand for at blokere endogen peroxidaseaktivitet (30 minutter ved stuetemperatur). Snittene blev derefter blokeret med serum-frit protein blok reagens (DAKO Corporation, California) i 10 minutter før den blev inkuberet med primære antistoffer. Disse snit blev derefter inkuberet med kanin-anti-nesfatin-1 (Katalog nr H-003-22; 1:500 fortynding Phoenix Pharmaceuticals, Californien) i 24 timer ved stuetemperatur. Alle objektglas blev efterfølgende vasket tre gange med 1x PBS og inkuberet med gede-anti-kanin-Texas Red IgG (Rød-Nesfatin-1; Katalog nummer TI-1000; 1:100 fortynding Vector Laboratories, Californien) sekundært antistof i 1 time ved stue temperatur. Alle primære og sekundære antistoffer blev fortyndet i antistoffortyndingsmiddel reagens (DakoCytomation, Mississauga, Ontario). Objektglassene blev vasket tre gange med 1 x PBS og syv gange med destilleret vand. Endelig blev objektglassene monteret med Vectashield-medium, der indeholder nuklear farvestof DAPI (blå; Vector Laboratories, Burlingame, Californien). Snittene blev set under et Nikon Eclipse Ti-E inverteret fluorescens mikroskop (Nikon Canada, Mississauga, Canada). Billeder blev taget med et Nikon DS-Qi1 MC afkølet monokromt kamera forbundet til en Dell HP Workstation computer og NIS elementer grundforskning imaging software (Nikon Canada, Mississauga, Canada). Kun repræsentative billeder af små og tyktarmen farvning for NUCB2 /nesfatin 1 med DAPI er vist i resultatafsnittet.

Nesfatin-1 /NUCB2 Niveauer i Serum og Medier

For at undersøge næringsstof afhængig ændringer i NUCB2 /nesfatin-1-sekretion fra MGN3-1 celler, medier blev opsamlet efter bestemte inkubationsperioder. For at forhindre cellerester blev prøver centrifugeret (13000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C) og toppen 700 pi blev opbevaret ved -20 ° C indtil nesfatin-1 måling. Til måling cirkulerende NUCB2 /nesfatin-1, blod blev opsamlet ved 7 a.m (kort efter den lette fase begynder), 13:00 (midten af ​​lette fase) og ved 7 p.m (før påbegyndelsen af ​​den mørke fase). Blodprøver fik lov til at størkne på is, og serum blev adskilt ved centrifugering (7000 rpm i 9 minutter ved 4 ° C) og opbevaret ved -20 ° C, indtil assays blev udført. NUCB2 /Nesfatin-1-sekretion niveauer i medierne blev målt under anvendelse af Nesfatin-1 (1-82) (Rat) ELISA-kit (Katalog nr EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Grænsen for analysesensitivitet var 1,2 ng /mL for nesfatin-1, med påviselig interval fra 0,1 til 1000 ng /mL. Mængden af ​​immunoreaktivt materiale blev bestemt ved anvendelse af en ikke-lineær regression kurve-fit, som blev anvendt til at kvantificere og sammenligne koncentrationen af ​​NUCB2 /nesfatin-1-sekretion i serum og medieprøver.

NUCB2 /Nesfatin- 1 niveauer i Serum og medier og Total ghrelin niveauer i medierne

For at undersøge næringsstoffer afhængige ændringer i NUCB2 /nesfatin-1 og total ghrelin sekretion fra MGN3-1 celler, medier blev opsamlet efter bestemte inkubationsperioder. For at forhindre cellerester blev prøver centrifugeret (13000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C) og toppen 700 pi blev opbevaret ved -20 ° C indtil NUCB2 /Nesfatin-1 og total ghrelin måling. Blodprøver fik lov til at størkne på is, og serum blev adskilt ved centrifugering (7000 rpm i 9 minutter ved 4 ° C) og opbevaret ved -20 ° C, indtil assays blev udført. NUCB2 /Nesfatin-1-sekretion niveauer i serum og medier blev målt ved anvendelse af Nesfatin-1 (1-82) (Rat) ELISA-kit (Katalog nr EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Grænsen for analysesensitivitet var 1,2 ng /mL for nesfatin-1, med påviselig interval fra 0,1 til 1000 ng /mL. Tilsvarende blev de samlede ghrelin sekretion niveauer i medierne målt ved hjælp af Ghrelin (rotte, mus) EIA kit (Katalognummer EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Californien). Grænsen for analysens sensitivitet 1,16 ng /mL for total ghrelin, med påviselig interval fra 0-100 ng /ml. Mængden af ​​immunoreaktivt materiale blev bestemt ved anvendelse af en ikke-lineær regression kurve-fit, som blev anvendt til at kvantificere og sammenligne koncentrationen af ​​NUCB2 /nesfatin-1-sekretion i serum og medieprøver.

Statistisk analyse

Analyser af de kvantificerede QRT-PCR og ELISA-data blev udført ved hjælp af One-Way ANOVA efterfulgt af Tukey multiple sammenligning test. GraphPad Prism-version 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, USA) blev anvendt til statistiske analyser og grafer. Signifikans blev tildelt, når p < 0,05. Data er udtrykt som gennemsnit ± SEM.

Resultater

NUCB2, PC 1/3 og PC 2 mRNA udtrykkes i MGN3-1 celler og NUCB2 mRNA udtrykkes i mave, lever, lille tarmen og tyktarmen af ​​hanmus

Vi identificerede ekspression af NUCB2 (202 bp), prohormon-konvertase 1/3 (400 bp), og prohormon-konvertase 2 (406 bp) mRNA'er i MGN3-1 celler (fig. 1A). NUCB2 (202 bp) mRNA-ekspression blev også påvist i maven, leveren, tyndtarmen og tyktarmen af ​​mandlige C57 /BL6-mus (fig. 1B). Absolutte niveauer af NUCB2 mRNA-ekspression i maven var højere end NUCB2 mRNA-ekspression i leveren, tyndtarmen og tyktarmen (fig. 1C).

MGN3-1 celler er immunpositive for ghrelin, NUCB2 /Nesfatin-1 , PC 1/3 og PC 2

Fluorescens mikroskopi viste MGN3-1 celler farvet med anti-nesfatin-1-antistof (Texas-rød;. figur 2B) og anti-ghrelin antistof (FITC-Green, fig. 2A) viste klart co-lokalisering (gul;. figur 2C) af nesfatin-1 og ghrelin immunoreaktivitet. Men nogle ghrelin positive celler var ikke immunreaktive for nesfatin-1 (fig. 2C). MGN3-1 celler viste PC 1/3 immunreaktivitet (Texas Red;. Figur 2D) og PC 2 immunoreaktivitet (Texas Red, Fig 2E.). DAPI (blå) farves kernen i alle celler, herunder de celler ikke er positive for de undersøgte proteiner. Kontrolglas farvet med sekundært antistof alene (fig. 2F) havde ingen immunoreaktivitet. Konfokal imaging viste MGN3-1 celler farvet med anti-nesfatin-1-antistof (Texas-Red, fig 3A.) Og anti-ghrelin antistof (FITC-Green;. Figur 3B) viste klart co-lokalisering (gul;. Fig 3C) af nesfatin-1 og ghrelin immunoreaktivitet. Negativ kontrol er farvet med kun sekundære antistoffer alene (fig. 3D).

NUCB2 proteinekspression i tyktarmen, tyndtarmen og leveren fra hanmus

NUCB2 protein udtrykkes i tyktarmen, tyndtarmen og leveren fra hanmus viser distinkt bånd for NUCB2 svarende til ca. 50 kDa. Rotte nesfatin-1-peptid anvendt som en positiv kontrol er vist som en særskilt bånd svarende til ca. 10 kDa (figur 4A;. Venstre billede). Men nogen bånd viser fuldt bearbejdede nesfatin-1 var synlige ved 10 kDa i vævsprøverne (figur 4A;. Venstre billede). Vi fandt også bånd på ca. 47 kDa under 50 kDa bånd i tyndtarmen og leveren, men ikke i tyktarmen (fig 4A,. Venstre billede). observeres en distinkt bånd for GAPDH anvendt som kontrol house-keeping gen ved 37 kDa vist i alle væv (figur 4A;. højre billede). NUCB2 /nesfatin-1 immunreaktivitet findes i slimhindeceller tyndtarmen (figur 4B;. Venstre billede) og tyktarmen (fig 4B;. Højre billede).

Virkninger af glucose og L-Tryptophan på NUCB2 mRNA-ekspression i, og NUCB2 /nesfatin-1-sekretion fra MGN3-1 celler

celler inkuberet ved 100 mM glucose DMEM havde en højere NUCB2 mRNA-ekspression end-celler inkuberet i 5,6, 25 og 50 mM DMEM glucosekoncentrationer ved 1 time efter inkubation (fig. 5A). Ved 2 timer efter inkubation,-celler inkuberet i 100 mM DMEM var signifikant højere i NUCB2 mRNA-ekspression end-celler inkuberet i 5,6 og 50 mM glucose DMEM (fig. 5C). Ved 1 time (fig. 5B) og 2 timer (fig. 5D), var der ingen signifikante forskelle i NUCB2 /nesfatin-1-sekretion. NUCB2 mRNA-ekspression var betydeligt højere i celler inkuberet ved 10 mM L-tryptophan (fig. 5E) i sammenligning med celler inkuberet ved 0,07 og 1,0 mM L-tryptophan. NUCB2 /nesfatin-1-sekretion fra celler inkuberet ved 1,0 og 10,0 mM L-tryptophan var betydeligt højere end celler inkuberet ved 0,7 mM L-tryptophan (Fig. 5F).

Virkning af linolensyre, octansyre og oliesyre syre på NUCB2 mRNA-ekspression i, og NUCB2 /nesfatin-1-sekretion fra MGN3-1 celler

Vi fandt NUCB2 mRNA-ekspression betydeligt reduceret i celler behandlet med 1, 10 og 100 uM oliesyre (fig. 6E) sammenlignet med kontrollen. Der blev ikke observeret nogen ændringer i NUCB2 mRNA i celler behandlet med linolensyre (fig. 6A) og octansyre (fig. 6C). Endvidere NUCB2 /nesfatin-1-sekretion var uændret i celler behandlet med forskellige doser af linolensyre (fig. 6B), octansyre (fig. 6D), og oliesyre (fig. 6F).

Virkning af L-tryptophan, linolensyre, octansyre og oliesyre selvstændigt med ghrelin mRNA-ekspression i, og total ghrelin sekretion fra MGN3-1 celler Salg

Ingen ændringer i ghrelin mRNA (S1A figur) og total ghrelin sekretion (S1B figur ) blev fundet, når celler blev behandlet med forskellige doser af glucose indlæg 1 times inkubation. Ghrelin mRNA-ekspression var betydeligt højere i celler inkuberet ved 1 mM L-tryptophan (fig. 7A) i sammenligning med celler inkuberet ved 0,07 og 10 mM L-tryptophan. Ingen signifikant forskel i total ghrelin sekretion fra celler behandlet med forskellige doser af L-tryptophan (fig. 7B). Vi fandt ingen ændring i ghrelin-mRNA-ekspression (fig. 7C), men total ghrelin sekretion var høj fra celler inkuberet ved 100 uM linolensyre (fig. 7D) i sammenligning med kontrol, 1 og 10 uM doser. Ingen ændringer i ghrelin mRNA (fig. 7E) og total ghrelin sekretion (fig. 7F) blev fundet, når celler blev behandlet med forskellige doser af octansyre. I mellemtiden ghrelin mRNA (fig. 7H), og total ghrelin sekretion (fig. 7,) var signifikant højere i celler behandlet med 100 pM oliesyre, sammenlignet med kontrollen, 1 og 10 uM oleinsyre.

Kronisk effekter af næringsstoffer på NUCB2 mRNA-ekspression og serum NUCB2 /nesfatin-1 i mus

kropsvægt, fødeindtagelse og blodsukker profil mus fodret med forskellige diæter er vist i S2 Figur. Mus fodret med en diæt med højt fedtindhold havde signifikant lav ekspression af NUCB2 mRNA i maven i forhold til dem fodret med en kontrol, højt proteinindhold eller høje kulhydrat kost (fig. 8A). Der var ingen signifikant forskel i ekspressionen af ​​NUCB2 mRNA i tyndtarmen mellem mus fodret med en kontrol, højt proteinindhold, højt kulhydrat eller højt fedtindhold (fig. 8B). Mus fodret med højt proteinindhold og højt fedtindhold kost har forholdsvis lav ekspression af NUCB2 mRNA i tyktarmen end mus fodret med kontrol- eller høj kulhydrat kost (fig. 8C). Mus fodret med et højt proteinindhold kost havde en signifikant lav ekspression af NUCB2 mRNA i leveren end mus fodret med de øvrige diæter (fig. 8D). Ved 7 a.m, var der ingen forskel i serum nesfatin-1 /NUCB2 niveauer i mus fodret forskellige diæter (Fig. 9A). Ved 1 p.m, den høje kulhydrat kost fodret mus havde signifikant højere serum nesfatin-1 /NUCB2 i omløb (fig. 9B). Serum nesfatin-1 /NUCB2 var signifikant lavere hos mus fodret højt kulhydratindhold, højt proteinindhold eller højt fedtindhold sammenlignet med kontroldiæten fodret mus ved 7 pm (fig. 9C).

Akutte virkninger af næringsstoffer på NUCB2 mRNA-ekspression , blodsukker og serum NUCB2 /nesfatin-1 i mus

Der var ingen signifikante ændringer i ekspressionen af ​​NUCB2 mRNA i maven (fig. 10A), tyndtarmen (fig. 10B), tyktarm (fig . 10C) og leveren (fig. 10D) mellem mus fodret med et højt proteinindhold, højt kulhydratindhold, højt fedtindhold eller vand.

• PLoS ONE: Hvilken slags Capsule endoskop er egnet til en Kontrollerbar selvkørende Capsule endoskop? Eksperimentel undersøgelse med et porcint mave Model for klinisk anvendelse (med videoer)
• PLoS ONE: Mave Temperatur Records Reveal Sygepleje Adfærd og overgang til fast føde Forbrug i en fravænnede Pattedyr, Harbour Seal Pup (Phoca vitulina)