PLOS ONE: Los nutrientes regulan diferencialmente Nucleobindin-2 /nesfatin-1 in vitro en células del estómago Ghrelinoma cultivadas (MGN3-1) e in vivo en ratones machos

Extracto

nesfatin-1 es secretada, péptido anorexígeno comida sensible codificada en el precursor nucleobindin-2 [NUCB2]. Que circula nesfatin-1 aumenta postprandial, pero los componentes de la dieta que modulan NUCB2 /nesfatin-1 siguen siendo desconocidos. La hipótesis de que los hidratos de carbono, grasas y proteínas diferencialmente regular la expresión específica de tejido de nesfatin-1. NUCB2, se detectaron convertases prohormonas y nesfatin-1 en ghrelinoma estómago de ratón [MGN3-1] células. NUCB2 ARNm y proteínas también se detectaron en el hígado del ratón, y intestinos delgado y grueso. células MGN3-1 fueron tratadas con glucosa, ácidos grasos o aminoácidos. C57BL /6 ratones machos fueron alimentados crónicamente alta en grasas, alta en carbohidratos y dietas altas en proteínas durante 17 semanas. Quantitative PCR y ensayos de nesfatin-1 se utilizaron para determinar nesfatin-1 en los niveles de ARNm y de proteínas. La glucosa estimula la expresión de ARNm en NUCB2 MGN3-1 células. L-triptófano también aumentó la expresión NUCB2 ARNm y la expresión de ARNm grelina, y nesfatin-1 secreción. El ácido oleico inhibe la expresión de ARNm NUCB2, mientras que la expresión de ARNm y la secreción de grelina se mejoró. la expresión de ARNm NUCB2 fue significativamente menor en el hígado de los ratones alimentados con una dieta alta en proteínas en comparación con los ratones alimentados con otras dietas. La ingesta crónica de dieta alta en grasa causó una reducción significativa en NUCB2 mRNA en el estómago, mientras que alta en proteínas y dieta alta en grasas causados ​​supresión similar de NUCB2 mRNA en el intestino grueso. No hay diferencias en suero nesfatin-1 niveles se encontraron en ratones a 7 a.m, al comienzo de la fase de luz. los ratones alimentados con la dieta alta en carbohidratos mostraron significativamente elevados niveles nesfatin-1 a la 1 pm Suero nesfatin-1 fue significativamente menor en los ratones alimentados con alto contenido en grasas, proteínas o carbohidratos en comparación con los controles a las 7 pm, justo antes de la fase oscura. Los ratones que recibieron un bolo de alto contenido en grasas tuvo una elevación significativa nesfatin-1 /NUCB2 en todos los puntos de tiempo ensayados post-sonda, en comparación con los ratones de control y ratones alimentados con otras dietas. Nuestros resultados, por primera vez indican que nesfatin-1 es modulada por los nutrientes

Visto:. Mohan H, Ramesh N, S Mortazavi, Le A, H Iwakura, Unniappan S (2014) Los nutrientes regulan diferencialmente Nucleobindin-2 /nesfatin-1 In Vitro
en el estómago cultivadas Ghrelinoma (MGN3-1) Las pilas y en Vivo Hoteles en ratones machos. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10.1371 /journal.pone.0115102

Editor: Yvette Tache, Universidad de California, Los Angeles, Estados Unidos de América

Recibido: 1 de mayo de 2014; Aceptado: 18 Noviembre 2014; Publicado: 15 de diciembre 2014

Derechos de Autor © 2014 Mohan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación: Esta investigación está financiada por una beca abierta de funcionamiento de los Insitutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) y una subvención Establecimiento de la Fundación de Investigación de Saskatchewan Salud (http://shrf.ca/). SU es un CIHR Nueva Investigador. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Los donantes no tienen ningún papel en la investigación o la preparación de manuscritos

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 codificados en la saciedad y la grasa que influyen en la proteína-1] es un péptido anorexígeno potente implicado en la regulación del balance energético y la homeostasis de la glucosa [1], [30]. Es un péptido de ácido 82 amino derivado de la proteína precursora, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 se compone de 396 aminoácidos, que consiste en dos motivos de mano EF y un dominio de unión de ADN [1], [3]. procesamiento posterior a la traducción por convertases prohormonas (PC 1/3 y PC 2) provoca NUCB2 que se escinde en tres péptidos, nesfatin-1 (1-82 aminoácidos), nesfatin-2 (85-163 aminoácidos), y nesfatin- 3 (166-396 aminoácidos). /Nesfatin-1 secuencia de aminoácidos NUCB2 está altamente conservada en todos los vertebrados [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 se encuentra en varios núcleos hipotalámicos que están involucrados en el metabolismo energético, tales como el núcleo arqueado, núcleo paraventricular, núcleo supraóptico, área hipotalámica lateral y increta zona [8], [9]. productoras de insulina de las células beta co-expresa nesfatin-1 en los islotes pancreáticos de ratas y ratones [2], [4], [11], lo que sugiere que nesfatin-1 podría desempeñar un papel importante en la secreción de insulina y la homeostasis de la glucosa [4], [29]. La grelina y NUCB /nesfatin-1 se colocalized en las glándulas mucosas gástricas oxínticas en roedores [13] y los seres humanos [16]. la expresión de ARNm NUCB2 en las células endocrinas de la mucosa gástrica purificados se encontró que era más alta que en el cerebro de ratas [13]. Se observó que la proteína de longitud completa NUCB2 en los intestinos grueso y delgado y el hígado de las ratas macho y ratones ICR [5]. La amplia distribución de NUCB2 /nesfatin-1 en los puntos tejidos centrales y periféricos a un papel para nesfatin-1 en la regulación del metabolismo.

La administración diaria de nesfatin-1 provocó una reducción prolongada en la ingesta de alimentos y el peso corporal [1] . la administración intracerebroventricular de NUCB2 suprime la ingesta de alimentos, peso corporal y subcutánea, mesentérica y la masa grasa epididimal en ratas adultas de una manera dependiente de la dosis. Además, desmontables NUCB2 en ratas mediante la infusión de oligonucleótido antisentido morfolino (AS-MON) causó un aumento en el apetito y el peso corporal [1]. inyección núcleo paraventricular Intra-de nesfatin-1 reduce la ingesta de alimentos acumulada a 1 y 3 horas [9]. inyecciones intraperitoneales de nesfatin-1 resultó en una reducción en la ingesta de alimentos en resistente leptina db /db
ratones y dieta alimentado ratones alto contenido de grasa [8]. Nesfatin-1 se compone de 3 fragmentos estructurales y sólo el fragmento de mediados de (residuos 24-53; M30) de nesfatin-1 está implicado en la producción de respuestas anoréxicos [15], [28]. En conjunto, estos resultados proporcionan pruebas claras de que el apoyo de los efectos de saciedad nesfatin-1.

nesfatin-1 es una comida de respuesta hormonal glucorregulador [12], [13], y los islotes pancreáticos de ratas liberar NUCB2 en respuesta a la glucosa [14]. En estudios en humanos, los sujetos tratados con glucosa tenían nesfatin-1 basal niveles más altos en comparación con los sujetos control [10]. En las células MIN6, se observó un aumento de 4 veces en los niveles de nesfatin-1 cuando se incubaron las células en glucosa alta (16,7 mM) en comparación con bajo nivel de glucosa (2,0 mM) [4]. Nesfatin-1 de glucosa mejorada estimuló la secreción de insulina de las células MIN6 cultivadas que se incubaron en glucosa alta que en bajo nivel de glucosa de una manera dependiente de la dosis [4]. En el páncreas de estreptozotocina (STZ) ratones inyectados con la diabetes tipo 1, se encontró que tanto NUCB2 y la expresión de ARNm de preproinsulina fueron significativamente más bajos [4]. Por el contrario, el aumento de nesfatin-1 co-localización con insulina se encuentra en las células beta de los islotes de ratones obesos inducida por la dieta alta en grasa con diabetes tipo 2. Nesfatin-1 tiene efectos específicos de tejido en la captación de glucosa en adipocitos de rata y músculo [30]. En general, nesfatin-1 ejerce un papel importante en la regulación de la glucosa en todo el cuerpo y la homeostasis energética.

Mientras nesfatin-1 está emergiendo como un péptido sensible comida importante [1], [12], [13], [30] , lo que desencadena su secreción sigue sin estar clara. ¿Qué componentes de la dieta activan la secreción después de las comidas de nesfatin-1? Esta cuestión sigue sin resolverse. El objetivo principal de este estudio es determinar cómo los diferentes nutrientes pueden modular las células NUCB2 /nesfatin-1 in vitro Hoteles en ghrelinoma estómago cultivadas (MGN3-1) de ratones y in vivo en
masculina ratones. Nuestros resultados de nuestro in vitro
estudios indican que MGN3-1 células responden de manera diferente a los nutrientes en la secreción de NUCB2 /nesfatin-1 y la grelina. Del mismo modo, la ingesta aguda o crónica de nutrientes hace la expresión del ARNm influencia NUCB2 y NUCB2 /1 nesfatin de liberación de una manera específica dieta.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

Todo estudios que utilizan animales cumplen con el Consejo canadiense de manejo de estos animales, y fueron aprobados por el Consejo de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Saskatchewan (Protocolo número desde 2012 hasta 0033).

in vitro estudios

ghrelinoma estómago

ratón células (MGN3-1) [17] se cultivaron en DMEM (Invitrogen, Ontario, Canadá; Catálogow95-040) que fue suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen; Catálogo|84 ) y 1% de penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) (Invitrogen; Catálogo—40-122) a 37 ° C en 10% de CO _{2. Al 80% de confluencia, se sembraron MGN3-1 células a 6 x 10 ^{6 células /pocillo en una placa de 12 pocillos y los estudios se realizaron cuando las células eran 80 a 90% de confluencia. Cada estudio se repitió tres veces y los datos de tres estudios se agruparon para obtener una n = 9-12 pocillos /tratamiento. Para determinar si la glucosa tuvo un efecto en una dosis y manera dependiente del tiempo, se incubaron las células durante 1 hora y 2 horas con 5,6, 25, 50, y 100 mM de glucosa en medio DMEM. El medio de crecimiento completo de las células MGN3-1 requiere que sean creciendo a un nivel alto de glucosa, que es de 25 mm. En relación con los estudios llevados a cabo con ácidos grasos y aminoácidos, hemos realizado estos estudios utilizando DMEM a los niveles de glucosa bajos (5,6 mM), ya que el uso de un medio de alta glucosa (25 mM) podría enmascarar el efecto de los respectivos nutrientes en NUCB2 /nesfatin -1 secreción y síntesis. Con respecto a los ácidos grasos de cadena larga, hemos probado el efecto de tres ácidos grasos diferentes que utilizan el ácido linolénico (Sigma-Aldrich, Ontario, Canadá; Producto # L2376), ácido octanoico (Sigma-Aldrich; Producto # C2875) y el ácido oleico (Sigma -Aldrich; Producto # O1383). Las células se incubaron durante 4 horas con cada uno de los ácidos grasos a los 0, 1, 10, 100 mM. Se utilizó L-triptófano (Sigma-Aldrich; Producto # T8941) para probar el efecto de un aminoácido en la secreción de NUCB2 y síntesis. Las células se incubaron durante 4 horas con L-triptófano a 0.7, 1, 10 mM. L-triptófano está presente en el medio de control (5,6 mM de glucosa DMEM) a una dosis mínima de 0,7 mm, la cual es esencial para el crecimiento de su condición.}}

En Vivo
Estudios

para la alimentación crónica de las dietas que contienen cantidades variables de nutrientes, la edad y emparejado con el peso específico (5 semanas peso corporal de edad, promedio: 20 gramos) C57BL /6 ratones machos (Charles River Laboratories, Quebec, Canadá) fueron alojados individualmente para 17 semanas en una luz de 12 horas: 12 horas ciclo de oscuridad (luces apagadas a las 7 de la tarde y en a las 7 am), temperatura y humedad controladas vivero. Los ratones se dividieron en cuatro grupos alimentados con un control (n = 6), alta en carbohidratos (n = 7), alta en proteínas (n = 7), y alta en grasas (n = 7) con dieta ad libitum
el acceso al agua y su dieta específica. Todas las dietas fueron adquiridos de Research Diets (New Brunswick, Nueva Jersey). El contenido calórico de las dietas eran: control (Producto # D12451): 4,73 kcal /g con 20% de energía derivada de la proteína, 35% de la energía derivada de hidratos de carbono y 45% de la energía derivada de la grasa; alta en carbohidratos (Producto # D12450J) tenía 3,8 kcal /g con 20% de energía procedente de las proteínas, el 70% de la energía proviene de los hidratos de carbono y 10% de la energía derivada de la grasa; alta en proteínas (Producto # D08091802) tenía 3,8 kcal /g con 60% de energía procedente de las proteínas, 30% de la energía derivada de carbohidratos y 10% de la energía derivada de la grasa y alta en grasas (Producto # D12492) tenían 5,2 kcal /g con 20% la energía derivada de proteínas, 20% de la energía proviene de los hidratos de carbono y 60% de la energía derivada de la grasa. Todos los ratones fueron alimentados con la dieta de control durante una semana antes de comenzar sus dietas específicas. la ingesta de alimentos, el peso corporal, y las lecturas de glucosa en sangre postal 4 horas rápida se midieron una vez a la semana durante 17 semanas

Para la administración aguda de nutrientes, la edad y (, el peso corporal promedio de 5 semanas de edad con peso.: 20 gramos) de sexo masculino C57BL /6 ratones (Charles River Laboratories, St. Constant, QU, Canadá) se alojaron individualmente durante 1 semana y 2 días en un 12 h luz: 12 h oscuridad ciclo (luces apagadas a las 7 pm y los a las 7 am ), temperatura y humedad controladas vivero. Los ratones fueron aclimatadas durante 1 semana a su llegada y tuvieron acceso ad libitum a agua y pienso normal de ratón durante 11 días. Dado que estamos llevando a cabo un estudio de la dieta aguda, necesitábamos los animales para que se aclimate al procedimiento sonda oral. Nos aclimatados a los ratones con este procedimiento alimentando por sonda con agua del grifo durante 2 días antes del día de experimentación. En la 12 ^{TH días, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 horas y se gavaged con una dieta líquida específica. Los ratones se dividieron en 4 grupos: Alto contenido de proteínas (Isopure Bebida de proteínas, Zero Carb - Mango sabor de melocotón; de Best Nature, Clifton Park, Nueva York; n = 7), alta en grasas (Splendido; prensado en frío de aceite de oliva virgen extra; del Presidente Elección , Canadá; n = 7), alta en carbohidratos (D-glucosa; Bioshop; Catlogue # GLU501.500; n = 7), y agua (el agua del grifo; n = 7). En el día del estudio, a 200 microlitros de los nutrientes anteriores /agua se administró a los ratones mediante alimentación forzada oral. lecturas de glucosa en sangre se tomaron a 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 y 120 minutos, y se recogió sangre a los 15, 30, 60, y 120 minutos para el análisis ELISA para determinar los niveles de NUCB2 /nesfatin circulante -1. Tejidos (estómago, intestino delgado [duodeno], el intestino grueso y el hígado) se recogieron de cada ratón a la terminación del estudio (la eutanasia profunda isoflurano seguido por dislocación cervical). Para mantener la coherencia, el momento y la duración de cada experimento, las cirugías y la recogida de muestras se mantuvieron constantes para todos los estudios.}

Total Extracción de ARN y síntesis de ADNc

Las células o tejidos se recogieron de cada estudio para comparar la expresión de ARNm NUCB2. De los ratones que sufrió el estudio de la dieta crónica, tejidos (estómago, intestino delgado, intestino grueso y el hígado) fueron recolectadas inmediatamente después de la eutanasia. El ARN total se extrajo de las MGN3-1 células y tejidos, usando el reactivo de aislamiento de ARN TRIzol (Invitrogen). La pureza del RNA fue validado por la relación de la densidad de absorción óptica (DO) (DO 260 nm /DO 280 nm) utilizando un NanoDrop 2000c (Thermo, Vantaa, Finlandia). Sólo las muestras con una relación de absorción mayor que 1,8 se utilizaron para la síntesis de ADNc. La síntesis de ADNc se realizó utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript como lo indique el fabricante (BioRad, Canadá).

RT-PCR cuantitativa y PCR en tiempo real

RT-PCR y QRT-PCR para NUCB2, la grelina, y RT-PCR para PC y PC 1/3 2 se llevaron a cabo de acuerdo con las condiciones descritas en la Tabla 1, utilizando el Sistema de CFX Conectar PCR en tiempo real de detección (Bio-Rad). Para el análisis de QRT-PCR, la expresión de ARNm de NUCB2 se normalizó el uso de beta-actina como gen de mantenimiento. Los productos de PCR para NUCB2 en el estómago, el hígado y el intestino grueso y estos genes (NUCB2, la grelina, PC y PC 1/3 2) en las células MGN3-1 se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1% para verificar transcripciones amplificados. Basado en estudios anteriores [4], se utilizó beta-actina como control interno para normalizar la señal de NUCB2 mRNA. Cuando se utiliza el ARN total, donde la cuantificación de ARNm era muy precisa, los valores umbrales críticos para la beta-actina no mostraron variabilidad. la expresión de ARNm NUCB2 relativa se normalizó con beta-actina de la misma muestra de acuerdo con el método de Livak [31].

MGN3-1 células inmunocitoquímica y microscopía
se cultivaron en un sistema de Slide Cámara Labtek (Nalge Nunc International, Rochester, NY) y se dejaron crecer hasta casi confluencia. Las células se lavaron con solución de tampón de fosfato 1X (PBS; 2 x 5 minutos, 25 ° C) y se fijaron en una paraformaldehído 4% de solución (PFA) en 1X PBS durante 10 minutos a 25 ° C, seguido de otro lavado con PBS 1X ( 3 x 5 minutos, 25 ° C). Las células fijadas se permeabilizaron en una solución de 0,3% de Triton-X (Bioshop, Burlington, Ontario, Canadá) en 1X PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron en tampón de bloqueo que contenía 10% de suero de cabra en 1X PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se incubaron entonces en el anticuerpo primario (Tabla 2) a 4 ° C durante la noche. Las láminas fueron lavadas con PBS (3 x 5 minutos, 25 ° C) y se incubaron con el anticuerpo secundario (Tabla 2, el anticuerpo PC1 /3 fue un generoso regalo del Dr. Iris Lindberg, Universidad de Maryland School of Medicine) durante 4 horas a temperatura ambiente. Por último, los portaobjetos se lavaron con PBS (3 x 5 minutos, 25 ° C) y se montaron con Vectashield medio que contiene 4 'de montaje, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canadá).

Las células fueron vistos usando un microscopio invertido de fluorescencia Nikon Eclipse-Ti (Nikon, Mississauga, Ontario, Canadá) y las imágenes fueron capturadas usando una cámara Nikon DS-Qi1 MC (Nikon). Las imágenes fueron analizados utilizando el software de investigación básica NIS-Elements (Nikon) en una estación de trabajo Dell HP. Las imágenes mostradas son representativas células teñidas para la grelina, NUCB2, PC 1/3 y PC2. Para obtener imágenes de alta resolución, se examinaron las células, analizaron e imágenes capturadas utilizando un microscopio confocal Leica TCS SP5.

Análisis de transferencia Western, inmunohistoquímica y la microscopía de fluorescencia

Para confirmar la presencia de nucleobindin-2 (NUCB2) en el intestino y el hígado, tres, 3 meses de edad se utilizaron ratones C57BL /6 macho. Brevemente, se recogieron el hígado y los intestinos delgado y grueso, y se separan para el análisis Western o inmunohistoquímica. Los tejidos para Western blot se homogeneizaron en T-PER proteína del tejido reactivo de extracción (Thermo Scientific,̑10) siguieron determinación de la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford. Las muestras se prepararon en tampón de Laemmli 1X que contenía 0,2% de 2-mercaptoetanol (Bio-Rad,¡-0737 y -0710) y, posteriormente, se hirvieron a 95 ° C durante 5 min seguido de agitación en vórtex. El volumen total de la muestra (20 l) que contienen cada una proteína de 50 mg o sintético rata nesfatin-1 (Abgent, 1μg /l, que se utiliza anteriormente en 4, 29) se cargó en un gel, y se ejecutan en un Mini-PROTEAN TGX 8-16 % de gel de gradiente (Bio-Rad,Lja 1104). Después de la separación, las proteínas se transfirieron a una membrana de 0,2 micras BioTrace nitrocelulosa (Pall Life Sciences,đ77-000) y luego membrana se bloqueó en solución 1X RapidBlock (AMRESCO, # M325). la detección de proteínas NUCB2 se realizó a través de conejo anti-nesfatin-1 (número de catálogo H-003-22; 1:500 dilución; Phoenix Pharmaceuticals, California) y GAPDH proteína se detectó mediante el uso de antisuero de conejo dirigido contra GAPDH de ratón (AbDSerotec, # AHP1628 ) diluido 1:1000. Como anticuerpo secundario, IgG de cabra anti-conejo (H + L) conjugado con HRP (Bio-Rad,ª-6515) diluido 1:3000 se utilizó. Para la visualización de la proteína de la membrana se incubó durante 5 min en Claridad Western ECL sustrato (Bio-Rad,ª-5061) y la imagen usando ChemiDoc sistema de imágenes de MP (Bio-Rad,ª-8280) con detección de quimioluminiscencia. Membrana de separación entre la detección de proteínas se realizó utilizando Restaurar más tampón de extracción blot occidental (Thermo Scientific,ǐ30). Precision Plus de proteínas estándares duales Xtra (Bio-Rad,¡-0377) fueron utilizados como marcadores de peso molecular.

Para los estudios inmunohistoquímicos, los tejidos recogidos se fijaron en formaldehído al 4% durante 24 horas a 4 ° C. Fijador fue reemplazado con etanol (tres 70% de etanol), cada una seguida por una incubación de 10 minutos a 4 ° C. Los tejidos se almacenaron en etanol al 70% a 4 ° C y se procesaron y se seccionaron a la pradera de diagnóstico Services Inc. (PDS Inc., Western College de Medicina Veterinaria, Universidad de Saskatchewan). Las secciones en parafina de 4 micras de espesor fueron preparados para la inmunotinción. Estas secciones se desparafinaron con xileno (se incubaron dos veces en 100% de xileno; 5 minutos, 25 ° C) y rehidratada en una serie de etanol graduada (incubó dos veces en etanol al 100%, y una vez en cada etanol 95%, 70% de etanol, 50% etanol; 2 minutos cada uno, 25 ° C). Las secciones se incubaron a continuación con peróxido de hidrógeno al 3% en agua destilada para bloquear la actividad peroxidasa endógena (30 minutos a temperatura ambiente). Las secciones se bloquearon a continuación con el reactivo de bloque de proteína sin suero (DAKO Corporation, California) durante 10 minutos antes de ser incubadas con anticuerpos primarios. Estas secciones fueron incubadas con conejo anti-nesfatin-1 (número de catálogo H-003-22; 1:500 dilución; Phoenix Pharmaceuticals, California) durante 24 horas a temperatura ambiente. Todos los portaobjetos se lavaron posteriormente tres veces con 1x PBS y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-conejo IgG Texas Red (rojo-nesfatin-1; Número de catálogo TI-1000; 1:100 dilución; Vector Laboratories, California) anticuerpo secundario durante 1 hora a la habitación temperatura. Todos los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron en diluyente reactivo de anticuerpos (DakoCytomation, Mississauga, Ontario). Los portaobjetos se lavaron tres veces con 1x PBS y siete veces con agua destilada. Por último, los portaobjetos se montaron con medio Vectashield que contiene DAPI tinte nuclear (azul; Vector Laboratories, Burlingame, California). Las secciones se observan bajo un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse Ti-E invertido (Nikon Canadá, Mississauga, Canadá). Las imágenes fueron capturadas utilizando una cámara monocromática refrigerada Nikon DS-QI1 MC conectado a un ordenador Dell HP Estación de trabajo y elementos de software de imagen NIS investigación básica (Nikon Canadá, Mississauga, Canadá). Sólo las imágenes representativas de tinción intestino delgado y grueso para NUCB2 /nesfatin-1 con DAPI se muestran en la sección de resultados.

nesfatin-1 /NUCB2 Los niveles en suero y los medios de comunicación

Para investigar nutrientes depende cambios en NUCB2 /1-nesfatin la secreción de MGN3-1 células, se recogieron los medios después de períodos de incubación específicos. Con el fin de evitar que los residuos de células, las muestras se centrifugaron (13.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C) y la parte superior 700 l se almacenó a -20 ° C hasta nesfatin-1 de medición. Para la medición de circulación NUCB2 /nesfatin-1, se extrajo sangre a las 7 am (poco después del comienzo de la fase de luz), 1 p.m. (medio de la fase de la luz) y a las 7 pm (antes del comienzo de la fase oscura). Las muestras de sangre se dejaron coagular sobre hielo, y se separó el suero por centrifugación (7000 rpm durante 9 minutos a 4 ° C) y se almacenaron a -20 ° C, hasta que se llevaron a cabo ensayos. NUCB2 niveles /nesfatin-1 secreción en los medios de comunicación se midieron utilizando el nesfatin-1 (1-82) Kit (Rata) ELISA (número de catálogo EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). El límite de sensibilidad del ensayo fue 1,2 ng /ml para nesfatin-1, con un rango detectable 0,1 a 1000 ng /mL. Se determinó la cantidad de material inmunorreactivo utilizando una regresión no lineal curva de ajuste, que se utilizó para cuantificar y comparar la concentración de NUCB2 /nesfatin 1-secreción en las muestras de suero y los medios de comunicación.

NUCB2 /Nesfatin- 1 Los niveles en suero y los niveles medios y totales de grelina en los medios de comunicación

Para investigar los cambios dependientes de nutrientes en la secreción de grelina NUCB2 /nesfatin-1 y total a partir de células MGN3-1, se recogieron los medios después de períodos de incubación específicos. Con el fin de evitar que los residuos de células, las muestras se centrifugaron (13.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C) y la parte superior 700 l se almacenó a -20 ° C hasta NUCB2 /nesfatin-1 y de medición total grelina. Las muestras de sangre se dejaron coagular sobre hielo, y se separó el suero por centrifugación (7000 rpm durante 9 minutos a 4 ° C) y se almacenaron a -20 ° C, hasta que se llevaron a cabo ensayos. NUCB2 /nesfatin-1 los niveles de secreción en el suero y los medios de comunicación se midieron usando el nesfatin-1 (1-82) kit (Rat) ELISA (Número de catálogo EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). El límite de sensibilidad del ensayo fue 1,2 ng /ml para nesfatin-1, con un rango detectable 0,1 a 1000 ng /mL. Del mismo modo, el total de los niveles de secreción de grelina en los medios de comunicación se midió utilizando la grelina (rata, ratón) kit de EIA (número de catálogo EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc, California). El límite de sensibilidad del ensayo fue de 1,16 ng /ml para la grelina total, con un rango de detección de 0-100 ng /ml. Se determinó la cantidad de material inmunorreactivo utilizando una regresión no lineal curva de ajuste, que se utilizó para cuantificar y comparar la concentración de NUCB2 /nesfatin 1-secreción en las muestras de suero y los medios de comunicación.

Análisis estadístico

los análisis de los datos qRT-PCR y ELISA cuantitativos se realizaron utilizando ANOVA de un factor seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey. GraphPad Prism versión 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, EE.UU.) fue utilizado para los análisis estadísticos y gráficos. La significación se asigna cuando p < 0,05. Los datos se expresan como media ± SEM.

Resultados

NUCB2, PC y PC 1/3 2 ARNm se expresan en las células y MGN3-1 NUCB2 ARNm se expresa en el estómago, hígado, intestino delgado e intestino delgado de los ratones macho

Se identificaron expresión de NUCB2 (202 pb), prohormona convertasa 1/3 (400 pb), y la prohormona convertasa 2 (406 pb) en ARNm MGN3-1 células (Fig. 1A). NUCB2 (202 pb) la expresión de ARNm también se detectó en el estómago, el hígado, el intestino delgado y el intestino grueso de los ratones C57 /BL6 macho (Fig. 1B). los niveles absolutos de expresión NUCB2 mRNA en el estómago eran más altos que la expresión NUCB2 mRNA en el hígado, el intestino delgado y el intestino grueso (Fig. 1C).

MGN3-1 células son immunopositive de grelina, NUCB2 /nesfatin-1 , 1/3 PC y PC 2

la microscopia de fluorescencia muestra MGN3-1 células teñidas con anti-nesfatin-1 anticuerpo (Texas-Red; Fig. 2B) y el anticuerpo anti-ghrelina (FITC-verde; fig. 2A) mostró clara co-localización (amarillo; Fig. 2C) de la inmunorreactividad nesfatin-1 y la grelina. Sin embargo, algunas células positivas de grelina no eran inmunorreactivas para nesfatin-1 (Fig. 2C). células MGN3-1 mostraron PC 1/3 inmunorreactividad (Texas Red; Fig. 2D) y PC 2 inmunoreactividad (Texas Red, Fig 2E.). DAPI (azul) tiñe el núcleo de todas las células, incluyendo las células no positivos para las proteínas estudiadas. portaobjetos de control teñidas con el anticuerpo secundario solo (Fig. 2F) no tenían inmunorreactividad. imagen confocal mostró MGN3-1 células teñidas con anti-nesfatin-1 anticuerpo (Texas-Red; la figura 3A.) y el anticuerpo anti-ghrelina (FITC-verde; Fig. 3B) mostró clara co-localización (amarillo; Fig. 3C) de inmunorreactividad nesfatin-1 y la grelina. El control negativo se tiñe con sólo anticuerpos secundario solo (Fig. 3D).

expresión de la proteína NUCB2 en intestino grueso, intestino delgado y el hígado de ratones machos

proteína NUCB2 se expresa en el intestino grueso, intestino delgado y el hígado de los ratones machos que muestran banda distinta para NUCB2 correspondiente a aproximadamente 50 kDa. Rat péptido nesfatin-1 utilizado como control positivo se muestra como una banda distinta correspondiente a aproximadamente 10 kDa (Fig 4A;. Imagen de la izquierda). Sin embargo, no hay bandas que muestran la procesados ​​completamente nesfatin-1 eran visibles en 10 kDa en las muestras de tejido (Fig 4A;. Imagen de la izquierda). También encontramos bandas de aproximadamente 47 kDa por debajo de la banda de 50 kDa en el intestino delgado y el hígado, pero no en el intestino grueso (Fig 4A;. imagen de la izquierda). Una banda distinta para GAPDH utilizado como gen de control de mantenimiento de la casa se observa a 37 kDa se muestra en todos los tejidos (Figura 4A;. Imagen derecha). NUCB2 /nesfatin-1 inmunoreactividad se encuentra en las células de la mucosa de intestino delgado (Fig 4B;. Imagen izquierda) y el intestino grueso (Fig 4B;. Imagen de la derecha).

Efectos de la glucosa y L-triptófano en NUCB2 la expresión de ARNm en, y NUCB2 /nesfatin-1 secreción a partir de células MGN3-1

Las células incubadas en DMEM 100 mM de glucosa tenían una expresión NUCB2 mRNA más alta que las células incubadas en 5,6, 25 y 50 las concentraciones de glucosa DMEM mM a 1 hora después de la incubación (Fig. 5A). A las 2 horas post-incubación, las células se incubaron a mM DMEM 100 fueron significativamente más altos en la expresión NUCB2 mRNA de las células incubadas en 5,6 y 50 mM de glucosa DMEM (Fig. 5C). En 1 hora (Fig. 5B) y 2 horas (Fig. 5D), no hubo diferencias significativas en NUCB2 /nesfatin-1 secreción. la expresión de ARNm NUCB2 fue significativamente mayor en las células incubadas en 10 mM de L-triptófano (Fig. 5E) en comparación con las células incubadas en 0,07 y 1,0 mM de L-triptófano. NUCB2 /nesfatin-1 secreción de las células se incubaron a 1,0 y 10,0 mM de L-triptófano fueron significativamente mayores que las células se incubaron a 0,7 mM de L-triptófano (Fig. 5F).

Efecto del ácido linolénico, ácido octanoico y ácido oleico ácido sobre la expresión de mRNA en NUCB2, y NUCB2 /nesfatin-1 secreción de las células MGN3-1

Nos encontramos la expresión de ARNm NUCB2 redujo significativamente en las células tratadas con 1, 10 y 100 mM de ácido oleico (Fig. 6E) en comparación con el control. No se observaron cambios en NUCB2 mRNA en células tratadas con linolénico (Fig. 6A) y ácido octanoico (Fig. 6C). Además, NUCB2 /nesfatin-1 secreción era inalterada en células tratadas con diferentes dosis de ácido linolénico (Fig. 6B), ácido octanoico (Fig. 6D), y el ácido oleico (Fig. 6F).

Efecto de L-triptófano, ácido linolénico, ácido octanoico y ácido oleico de forma independiente en la expresión de ARNm en la grelina, y la secreción total de grelina de MGN3-1 células

No hay cambios en mRNA grelina (S1A Figura) y la secreción total de la grelina (Figura S1B ) fueron encontrados cuando las células fueron tratadas con diferentes dosis de glucosa horas de incubación tras 1. expresión grelina mRNA fue significativamente mayor en las células incubadas en 1 mM de L-triptófano (Fig. 7A) en comparación con las células incubadas en 0,07 y 10 mM de L-triptófano. No hay diferencia significativa en la secreción total de grelina a partir de células tratadas con diferentes dosis de L-triptófano (Fig. 7B). Encontramos ningún cambio en la expresión de ARNm de la grelina (Fig. 7C), pero la secreción total de grelina fue alta a partir de células incubadas a 100 M de ácido linolénico (Fig. 7D) en comparación con el control, 1 y 10 mM dosis. No se encontraron cambios en mRNA grelina (Fig. 7E) y la secreción de grelina total (Fig. 7F) cuando las células se trataron con diferentes dosis de ácido octanoico. Mientras tanto, la grelina mRNA (Fig. 7H), y la secreción de grelina total (Fig. 7I) fueron significativamente mayores en las células tratadas con 100 mM de ácido oleico, en comparación con el control, 1 y 10 mM de ácido oleico.

crónica efectos de los nutrientes sobre la expresión del ARNm NUCB2 y suero NUCB2 /nesfatin-1 en ratones

El perfil de peso corporal, consumo de alimentos y la glucosa en sangre de los ratones alimentados con distintas dietas se muestran en la Figura S2. Los ratones alimentados con una dieta alta en grasas tenían significativamente baja expresión de ARNm NUCB2 en el estómago en comparación con los alimentados con un control, alta en proteínas o hidratos de carbono dietas altas (Fig. 8A). No hubo diferencia significativa en la expresión de mRNA NUCB2 en el intestino delgado entre los ratones alimentados con una control, alta en proteínas, alta en carbohidratos o dietas altas en grasa (Fig. 8B). Ratones alimentados con la alta en proteínas y dietas altas en grasa tiene comparativamente baja expresión de mRNA NUCB2 en el intestino grueso que los ratones alimentados con el control o alta de hidratos de carbono dietas (Fig. 8C). Los ratones alimentados con una dieta alta en proteínas tenían una baja expresión significativa de NUCB2 mRNA en el hígado que los ratones alimentados con las otras dietas (Fig. 8D). A las 7 am, no hubo diferencias en el suero nesfatin-1 /NUCB2 niveles en los ratones alimentados con diferentes dietas (Fig. 9A). A la 1 pm, los ratones alimentados con la dieta alta en carbohidratos tenía el suero significativamente mayor nesfatin-1 /NUCB2 en circulación (Fig. 9B). Suero nesfatin-1 /NUCB2 fue significativamente menor en los ratones alimentados con alto contenido en carbohidratos, alta en proteínas o alto de grasa, en comparación con los ratones control alimentados con la dieta a las 7 pm (Fig. 9C).

Los efectos agudos de los nutrientes sobre la expresión del ARNm NUCB2 , la glucosa en sangre y suero NUCB2 /nesfatin-1 en ratones

No hubo cambios significativos en la expresión de mRNA NUCB2 en el estómago (Fig. 10A), intestino delgado (Fig. 10B), intestino grueso (Fig . 10C) e hígado (Fig. 10D) entre los ratones alimentados con una proteína de alta, alta en carbohidratos, alta en grasa o agua.

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