Введение Этика Заявление In Vitro Для того, чтобы исследовать питательные зависимые изменения в секреции грелина NUCB2 /nesfatin-1 и общей от MGN3-1 клеток, средств массовой информации была собрана после определенных периодов инкубации. Для того чтобы предотвратить остатков клеток, образцы центрифугировали (13000 оборотов в минуту в течение 10 минут при 4 ° С), а верхний 700 мкл хранили при -20 ° С до NUCB2 /Nesfatin-1 и измерения общего грелина. Образцы крови давали свернуться на льду, и сыворотку отделяли центрифугированием (7000 оборотов в минуту в течение 9 минут при 4 ° C) и хранили при -20 ° С, пока не будут проведены анализы. Уровни NUCB2 /Nesfatin-1 секреции в сыворотке и средства массовой информации были измерены с помощью Nesfatin-1 (1-82) (Крыса) ELISA набор (номер по каталогу EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Предел чувствительности анализа составлял 1,2 нг /мл для nesfatin-1, при этом диапазон детектирования от 0,1-1000 нг /мл. Аналогичным образом, общий уровень секреции грелина в средах измеряли с помощью грелин (крысы, мыши) EIA комплект (номер по каталогу ЕК-031-31, Феникс Pharmaceuticals Inc, Калифорния). Предел чувствительности анализа был 1,16 нг /мл для общего грелина, с детектируемым диапазоне 0-100 нг /мл. Количество иммунореактивного материала определяли с использованием нелинейной регрессии кривой подгонки, которая была использована для количественного определения и сравнения концентрации NUCB2 /nesfatin-1 секреции в сыворотке крови и образцы печатных носителей. Анализ количественных данных QRT-PCR и ELISA проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим многократным сравнительного теста Тьюки. GraphPad Prism версия 5 (GraphPad Software Incorporated, Сан-Диего, штат Калифорния, США) использовали для статистического анализа и графиков. Значение было назначено при р &л; 0,05. Данные выражены в виде среднего значения ± SEM. NUCB2, ПК 1/3 и ПК 2 мРНК экспрессируется в клетках MGN3-1 и NUCB2 мРНК выражается в желудке, печени, малый кишечника и толстой кишки мышей-самцов Никаких изменений в мРНК грелина (S1A рисунок) и общей секреции грелина (s1b рис ) были обнаружены, когда клетки обрабатывали различными дозами глюкозы пост 1-часовой инкубации. экспрессия мРНК грелин была значительно выше в клетках, инкубированных в 1 мМ L-триптофана (рис. 7А) по сравнению с клетками инкубировали при 0,07 и 10 мМ L-триптофана. Нет существенной разницы в общей секреции грелина из клеток, обработанных различными дозами L-триптофан (рис. 7, б). Мы не обнаружили никаких изменений в экспрессии мРНК грелин (рис. 7в), но общая секрецию грелина был высок из клеток, инкубированных при 100 мкМ линоленовой кислоты (рис. 7D) по сравнению с контрольной, 1 и 10 мкМ доз. Никаких изменений в мРНК грелина (рис. 7E) и общей секреции грелина (рис. 7F) обнаружено не было, когда клетки обрабатывали различными дозами октановой кислоты. В то же время, грелин мРНК (рис. 7H), и общая секреция грелина (рис. 7i) были значительно выше в клетках, обработанных 100 мкМ олеиновой кислоты, по сравнению с контролем, 1 и 10 мкМ олеиновой кислоты. Там не было никаких существенных изменений в экспрессии мРНК NUCB2 в желудке (рис. 10А), тонкой кишки (рис. 10Б), толстой кишки (рис . 10С) и печени (рис. 10D) между мышей кормили высоким содержанием белка, высоким содержанием углеводов, с высоким содержанием жира или воды.
<р> Nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 закодирована сытости и жира, оказывающих влияние на белок-1] является мощным anorexigenic пептид участвует в регуляции энергетического баланса и гомеостаза глюкозы [1], [30]. Он представляет собой пептид 82 аминокислоты получен из белка-предшественника, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 состоит из 396 аминокислот, состоящий из двух ручных мотивов EF и ДНК-связывающий домен [1], [3]. Посттрансляционное обработка прогормоном конвертазами (ПК 1/3 и ПК 2) приводит к NUCB2 расщепляться на три пептиды, nesfatin-1 (1-82 аминокислот), nesfatin-2 (85-163 аминокислот), и nesfatin- 3 (166-396 аминокислот). /Nesfatin-1 аминокислотной последовательности NUCB2 высоко консервативен по позвоночных [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 обнаруживается в различных ядрах гипоталамуса, которые участвуют в энергетическом обмене, таких как дугообразного ядра, паравентрикулярной ядра, супраоптического ядра, латерального гипоталамуса области и гопа increta [8], [9]. Продуцирующих инсулин бета-клетки со-экспресс nesfatin-1 в панкреатических островках крыс и мышей [2], [4], [11], предполагая, что nesfatin-1 может играть важную роль в секреции инсулина и гомеостаз глюкозы [4], [29]. Грелин и NUCB /nesfatin-1 локализуется в желудочном oxyntic слизистых желез у грызунов [13] и человека [16]. было обнаружено NUCB2 экспрессия мРНК в очищенных эндокринных клеток слизистой оболочки желудка, чтобы быть выше, чем в мозге у крыс [13]. Полноразмерного белка NUCB2 наблюдалась в тонком и толстом кишечнике и печени самцов крыс и мышей ICR [5]. Широкое распространение NUCB2 /nesfatin-1 в центральных и периферических тканях указывает на роли nesfatin-1 в регуляции обмена веществ.
<Р> Ежедневное введение nesfatin-1 вызвало расширенное сокращение потребления пищи и массы тела [1] , Интрацеребровентрикулярное введение NUCB2 подавляет потребление пищи, вес тела и подкожную, брыжеечных и придатка жировой массы у взрослых крыс в зависимости от дозы. Кроме того, NUCB2 нокдаун у крыс вливая антисмысловой морфолино олигонуклеотида (как-MON) вызвало увеличение аппетита и массы тела [1]. Intra-паравентрикулярное инъекции ядро nesfatin-1 уменьшает совокупное потребление пищи через 1 и 3 ч [9]. Внутрибрюшинные инъекции nesfatin-1 привело к снижению потребления пищи в лептина устойчивостью дБ /дБ
мышей и высоким содержанием жиров кормили мышей [8]. Nesfatin-1 состоит из 3 структурных фрагментов, и только в середине фрагмента (остатки 24-53; М30) от nesfatin-1 участвует в производстве аноректические ответов [15], [28]. В совокупности эти результаты дают четкие доказательства, которые поддерживают чувство сытости эффекты nesfatin-1.
<Р> Nesfatin-1 является прием пищи отзывчивым glucoregulatory гормона [12], [13], и панкреатические островки крыс релиз NUCB2 в ответ на глюкозу [14]. В исследованиях на людях, глюкозы лечение субъектов имели более высокие базально-nesfatin 1 уровня по сравнению с контрольной группой [10]. В клетках MIN6 наблюдалось увеличение 4-кратное nesfatin-1 уровни, когда клетки инкубировали в высоким содержанием глюкозы (16,7 мМ) по сравнению с низким глюкозы (2,0 мМ) [4]. Nesfatin-1 повышается глюкоза стимулированную секрецию инсулина из культивируемых клеток, которые MIN6 инкубировались в высоким содержанием глюкозы, чем в условиях низкой глюкозы в зависимости от дозы [4]. В поджелудочной железе стрептозотоцина (STZ) -injected мышей с диабетом типа 1, было установлено, что оба NUCB2 и экспрессия мРНК препроинсулин были значительно ниже [4]. В отличие от этого, усиливается nesfatin-1 совместно с локализацией инсулина была обнаружена в островковых бета-клеток с высоким содержанием жиров-индуцированной ожирением мышей с сахарным диабетом 2 типа. Nesfatin-1 имеет ткани специфическое воздействие на поглощение глюкозы в адипоциты и мышцы [30] крыс. В целом, nesfatin-1 оказывает важную роль в регулировании всей глюкозы тела и энергетического гомеостаза
. <Р> В то время как nesfatin-1 появляется как важный прием пищи отзывчивым пептида [1], [12], [13], [30] , что вызывает его секрецию, остается неясным. Какие диеты компоненты вызывают после еды секрецию nesfatin-1? Этот вопрос остается без ответа. Основной целью данного исследования является определение, как различные питательные вещества могут модулировать клетки NUCB2 /nesfatin-1 в пробирке
в культуре ghrelinoma желудка (MGN3-1) от мышей и В естественных условиях
у самцов мышей. Наши результаты наших в пробирке
исследований указывают на то, что MGN3-1 клетки по-разному реагируют на питательные вещества в секретирующих NUCB2 /nesfatin-1 и грелин. Кроме того, острое или хроническое потребление питательных веществ делает экспрессию мРНК влияние NUCB2 и NUCB2 /nesfatin-1 выпуск в рационе определенным образом.
Материалы и методы
<р> Все исследования с использованием животных выполнили канадского совета руководств по уходу за животными, а также были одобрены советом по этике исследований на животных университета Саскачевана (номер протокола 2012-0033).
исследований
<р> мыши желудок ghrelinoma (MGN3-1) клетки [17], культивировали в среде DMEM (Invitrogen, Онтарио, Канада, каталогw95-040), который с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen; Catalogue|84 ) и 1% пенициллина (100 Ед /мл) и стрептомицина (100 мкг /мл) (Invitrogen; каталог—40-122) при 37 ° с в 10% CO <югу> 2. При 80% сплошности, MGN3-1 клетки высевают в 6 × 10 6 клеток /лунку в 12-луночного планшета и исследования были проведены, когда клетки достигали 80-90% сплошности. Каждое исследование повторяли трижды, и были объединены данные из трех исследований, чтобы получить N = 9-12 скважин /лечение. Чтобы определить, было ли глюкоза эффект в дозе и зависит от времени, таким образом, клетки инкубировали в течение 1 ч и 2 ч при 5,6, 25, 50 и 100 мМ глюкозы сред DMEM. Полная среда для роста клеток MGN3-1 требует, чтобы они растут на высоком уровне глюкозы, которая составляет 25 мм. В отношении исследований, проведенных с жирными кислотами и аминокислотами, мы проводили эти исследования с использованием DMEM при низких уровнях глюкозы (5,6 мМ), так как с использованием среды с высоким содержанием глюкозы (25 мм) может замаскировать эффект соответствующих питательных веществ на NUCB2 /nesfatin -1 секреции и синтеза. Что касается длинноцепочечных жирных кислот, мы исследовали влияние трех различных жирных кислот с использованием линоленовой кислоты (Sigma-Aldrich, Онтарио, Канада; Номер # L2376), каприловой кислоты (Sigma-Aldrich; Номер # C2875) и олеиновая кислота (Сигма -Aldrich; Продукт # O1383). Клетки инкубировали в течение 4-х часов с каждым жирными кислотами при температуре 0, 1, 10, 100 мкМ. Мы использовали L-триптофан (Sigma-Aldrich; Product # T8941), чтобы проверить действие аминокислоты на NUCB2 секреции и синтеза. Клетки инкубировали в течение 4-х часов с L-триптофана на 0,7, 1, 10 мМ. L-триптофан присутствует в контрольной среде (5,6 мМ глюкозы DMEM) при минимальной дозе 0,7 мм, что необходимо для их состояния роста.
В естественных условиях
исследований
<р> для хронического кормления диет, содержащих различные количества конкретных питательных веществ, возраста и веса соответствием (5 недель, средний вес тела: 20 грамм) самцов мышей C57BL /6 (Charles River Laboratories, Квебек, Канада) были размещены индивидуально для 17 недель в свет 12 часов: 12 часов темного цикла (свет выключали в 7 вечера и по состоянию на 7 часов утра), контролируемой температурой и влажностью виварий. Мыши были разделены на четыре группы, получавшими контроля (п = 6), высоким содержанием углеводов (п = 7), с высоким содержанием белка (N = 7), а также с высоким содержанием жира (п = 7) диета с вволю
доступ к воде и их определенной диеты. Все диеты были приобретены у Research сеймов (Нью-Брансуик, штат Нью-Джерси). Калорийность диеты были: контроль (# продукт D12451): 4,73 ккал /г с 20% энергии, получаемой из белка, 35% энергии, получаемой из углеводов и 45% энергии, получаемой из жира; высоким содержанием углеводов (продукт # D12450J) было 3,8 ккал /г с 20% энергии, получаемой из белка, 70% энергии, получаемой из углеводов и 10% энергии, получаемой из жира; с высоким содержанием белка (продукт # D08091802) было 3,8 ккал /г с 60% энергии, получаемой из белка, 30% энергии, получаемой из углеводов и 10% энергии, получаемой из жиров и высоким содержанием жира (Product # D12492) было 5,2 ккал /г с 20% энергия, полученная от белка, 20% энергии, получаемой из углеводов и 60% энергии, получаемой из жира. Все мыши получали с контрольной диете в течение одной недели до начала их конкретных диет. Потребление пищи, массы тела и уровня глюкозы в крови чтения сообщение 4 часов быстро измеряли один раз в неделю в течение 17 недель
<р> Для острого введения питательных веществ, возраста и веса соответствием (5 недель, средний вес тела.: 20 грамм) Самцов мышей C57BL /6 (Charles River Laboratories, Сент-Constant, Qu, Канада) были размещены по отдельности в течение 1 недели и 2 дня в 12 ч свет: 12 ч темнота (свет выключали в 7 вечера и в 7 утра ), контролируемой температурой и влажностью виварий. Мыши были акклиматизированы в течение 1 недели по прибытии и имели вволю доступ к воде и корму регулярной мыши в течение 11 дней. Так как мы проводим острое исследование рациона питания, мы нуждались в животных, чтобы акклиматизироваться к оральной процедуре зондового. Мы акклиматизировались мышей к этой процедуре, gavaging их проточной водой в течение 2-х дней до начала эксперимента день. На 12 й день мышей не кормили в течение 4-х часов, и были через желудочный зонд с определенной жидкой диеты. Мыши были разделены на 4 группы: С высоким содержанием белка (Isopure Протеиновый напиток, Zero Carb - Манго вкусом персика, природа лучше, Клифтон-Парк, Нью-Йорк; п = 7), Жирная (Сплендидо, холодного отжима Оливковое масло первого отжима, выбор президента , Канада; п = 7), высоким содержанием углеводов (D-глюкоза; BioShop; Catlogue # GLU501.500; п = 7), и вода (водопроводная вода; п = 7). В день исследования, 200 микролитров выше питательные вещества /вода вводили мышам перорально через зонд. чтения глюкозы крови отбирали через 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 и 120 минут, и кровь собирали в 15, 30, 60 и 120 мин для анализа ELISA для определения циркулирующих уровней NUCB2 /nesfatin -1. Тканях (желудок, тонкий кишечник [двенадцатиперстной кишки], толстой кишки и печени) собирали от каждой мыши по окончании исследования (глубокий изофлуран эвтаназии с последующим смещением шейных позвонков). Для обеспечения согласованности, сроки и продолжительность каждого эксперимента, операции и сбор образцов поддерживали постоянными для всех исследований.
Общая Экстракция РНК и синтез кДНК
<р> клетки или ткани собирали из каждого исследования сравнить экспрессию мРНК NUCB2. Из мышей, перенесших хроническую исследование рациона питания, ткани (желудок, тонкий кишечник, толстый кишечник и печень) собирали сразу после эвтаназии. Суммарную РНК экстрагировали из MGN3-1 клеток и тканей, с использованием реагента TRIzol изоляции РНК (Invitrogen). чистота РНК была подтверждена с помощью оптического поглощения отношением плотности (OD) (OD 260 нм /OD 280 нм) с использованием NanoDrop 2000c (Thermo, Вантаа, Финляндия). Только образцы с отношением поглощения больше, чем 1.8 были использованы для синтеза кДНК. Синтез кДНК проводили с использованием набора для синтеза кДНК iScript в соответствии с указаниями производителя (BioRad, Канада).
RT-PCR и количественного в реальном масштабе времени-PCR
<р> RT-PCR и QRT-ПЦР NUCB2, грелин и RT-PCR для ПК 1/3 и ПК 2 были проведены в соответствии с условиями, изложенными в таблице 1, с использованием системы CFX Connect ПЦР в реальном времени обнаружения (Bio-Rad). Для анализа QRT-PCR, экспрессия мРНК NUCB2 нормализовали с использованием бета-актина в качестве гена домашнего хозяйства. ПЦР-продукты для NUCB2 в желудке, печени и толстой кишки, и эти гены (NUCB2, грелин, ПК 1/3 и ПК 2) в MGN3-1 клеток подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, чтобы проверить, транскрипты усиленных. На основе предыдущих исследований [4], мы использовали бета-актина в качестве внутреннего контроля для нормализации сигнала мРНК NUCB2. При использовании тотальной РНК, где мРНК Количественное был очень точным, критические пороговые значения для бета-актина не показали изменчивость. Относительная экспрессия мРНК NUCB2 нормализовалось с бета-актина из того же образца в соответствии с методом Ливак [31].
иммуноцитохимию и микроскопию
<р> MGN3-1 клетки культивировали в системе Slide Labtek палаты (Nalge Nunc International, Рочестер, штат Нью-Йорк) и позволяли расти почти до слияния. Клетки промывали 1X фосфатным буферным раствором (PBS; 2 × 5 минут, 25 ° C) и фиксируют в 4% -ном растворе параформальдегида (PFA) в 1X PBS в течение 10 минут при 25 ° С, с последующим другим промыванием 1Х PBS ( 3 × 5 минут, 25 ° C). Фиксированные клетки проницаемыми в растворе 0,3% Triton-X (Bioshop, Берлингтон, Онтарио, Канада) в 1X PBS в течение 5 минут при комнатной температуре. Срезы инкубировали в блокирующем буфере, содержащем 10% сыворотки козьего в 1X PBS в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали в первичных антител (Таблица 2) при 4 ° С в течение ночи. Предметные стекла промывали PBS (3 × 5 минут, 25 ° C) и инкубировали с вторичным антителом (таблица 2; антитело РС1 /3 был щедрым подарком от д-ра Iris Lindberg, Университет штата Мэриленд школы медицины) в течение 4 часов при комнатная температура. И, наконец, слайды промывали PBS (3 × 5 минут, 25 ° C) и монтируется с Vectashield монтажной среды, содержащей 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Vector Laboratories, Берлингтон, Онтарио, Канада).
<р> Клетки были просмотрены с помощью Nikon Eclipse-Ti перевернутой флуоресцентного микроскопа (Nikon, Миссиссага, Онтарио, Канада) и изображения были получены с помощью камеры Nikon DS-Qi1 MC (Nikon). Изображения были проанализированы с использованием NIS-Elements фундаментальных исследований программного обеспечения (Nikon) на Dell HP Workstation. Изображения, показанные являются представительными клетки окрашивали для грелина, NUCB2, PC 1/3 и PC2. Для получения изображений высокого разрешения, клетки просматривать, анализировать и изображения, снятые с помощью Leica TCS SP5 конфокальной микроскопии.
Вестерн-блоттинга, иммуногистохимии и флуоресцентной микроскопии
<р> Для подтверждения присутствия nucleobindin-2 (NUCB2) в кишечнике и печени, три, за последние 3 месяца использовались старые мыши C57BL /6 самцов. Вкратце, печень и тонкой и толстой кишки были собраны и разделены для Вестерн-анализа или иммуногистохимии. Ткани для Вестерн-блоттинга гомогенизируют в Т-PER белковой ткани экстракционного реагента (Thermo Scientific,̑10) с последующим определение концентрации белка Бредфорда. Образцы были приготовлены в 1X буфере Лэммли, содержащем 0,2% 2-меркаптоэтанола (Bio-Rad,¡-0737 и -0710), а затем кипятили при температуре 95 ° С в течение 5 мин с последующим встряхиванием. Весь объем образца (20 мкл), каждый из которых содержит белок 50 мкг или синтетический крысы nesfatin-1 (ABGENT, 1 мкг /мкл, что использовали ранее в 4, 29), загружали на гель, и работать в мини-Протееподобным TGX 8-16 % градиентном геле (Bio-Rad,Lj-1104). После разделения белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Biotrace 0,2 мкм (Pall Life Sciences,đ77-000), а затем мембрану блокировали в 1X RapidBlock растворе (Amresco, # M325). NUCB2 обнаружение белка проводили с использованием кроличьей анти-nesfatin-1 (номер по каталогу H-003-22; 1:500 разведение, Phoenix Pharmaceuticals, Калифорния) и GAPDH белок был обнаружен при использовании кроличьей антисыворотки, направленной против GAPDH мыши (AbDSerotec, # AHP1628 ) разводили 1:1000. В качестве вторичного антитела козы против кроличьего IgG (H + L) конъюгат пероксидазы хрена (Bio-Rad,ª-6515), разбавленный 1:3000 использовался. Для визуализации белка мембрану инкубировали в течение 5 мин в Четкость Западной ЭХЛ субстрат (Bio-Rad,ª-5061) и визуализируют с помощью ChemiDoc MP системы визуализации (Bio-Rad,ª-8280) с функцией обнаружения хемилюминесценции. Мембрана зачистки между обнаружением белка проводили с помощью восстановления PLUS вестерн-блот зачистки буфера (Thermo Scientific,ǐ30). Точность плюс протеиновые двойные стандарты Xtra (Bio-Rad,¡-0377) были использованы в качестве маркеров молекулярной массы.
<Р> Для иммуногистохимических исследований, ткани, собранные фиксировали в 4% формальдегиде в течение 24 часов при 4 ° С. Фиксирующий был заменен этанолом (три 70% этанола), каждый из которых с последующим 10-минутной инкубации при 4 ° С. Тканей затем хранили в 70% этаноле при 4 ° С и обрабатывали и разрезали на Prairie Diagnostic Services Inc. (PDS Inc., Западная колледжа ветеринарной медицины Университета Саскачеван). Парафиновых срезах толщиной 4 мкм были подготовлены к иммунным окрашиванием. Эти срезы депарафинизировали ксилолом (инкубированных дважды в 100% ксилола, 5 минут, 25 ° C) и регидратации в серии градуированных этанола (инкубированных в два раза в 100% этаноле, и один раз в каждом 95% этанола, 70% этанола, 50% этанол, 2 минуты каждый, 25 ° C). Затем срезы инкубировали с 3% -ной перекиси водорода в дистиллированной воде, чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы (30 минут при комнатной температуре). Срезы затем блокировали белковый блок реагента бессывороточной (Dako Corporation, California) в течение 10 минут, а затем инкубируют с первичными антителами. Эти срезы затем инкубировали с кроличьей анти-nesfatin-1 (номер по каталогу H-003-22; 1:500 разведение; Феникс Фармацевтические препараты, Калифорния) в течение 24 часов при комнатной температуре. Все предметные стекла затем промывают три раза с 1x PBS и инкубировали с козьим анти-кроличьего IgG, техасский красный (красно-Nesfatin-1; Каталожный номер TI-1000; 1:100 разведении; Vector Laboratories, Калифорния) вторичного антитела в течение 1 ч при комнатной температура. Все первичные и вторичные антитела разводили в разбавителе антитела реагента (DakoCytomation, Миссиссага, Онтарио). Срезы три раза промывали PBS 1х и семь раз дистиллированной водой. И, наконец, слайды были установлены со средой Vectashield, содержащих DAPI ядерный краситель (синий, Vector Laboratories, Burlingame, California). Срезы рассматривается под Nikon Eclipse Ti-E перевернутой флуоресцентного микроскопа (Nikon Канада, Калгари, Канада). Изображения были получены с помощью Nikon DS-Qi1 MC охлажденный монохромное камерой, подключенной к компьютеру Dell HP Workstation и NIS элементов базового программного обеспечения исследования изображений (Nikon Канада, Калгари, Канада). Только представительные изображения тонкой и толстой кишки окрашивания для NUCB2 /nesfatin-1 с DAPI приведены в разделе результатов.
Nesfatin-1 /NUCB2 Уровни в сыворотке крови и средств массовой информации
<р> Для исследования питательных веществ зависимой изменения в /nesfatin-1 секреции NUCB2 из MGN3-1 клеток, средств массовой информации была собрана после определенных периодов инкубации. Для того чтобы предотвратить остатков клеток, образцы центрифугировали (13000 оборотов в минуту в течение 10 минут при 4 ° С), а верхний 700 мкл хранили при -20 ° С до nesfatin-1 измерения. Для измерения циркулирующих NUCB2 /nesfatin-1, собирали кровь в 7 a.m (вскоре после того, как начинается легкая фаза), 1 часа дня (середина легкой фазы) и на 7 p.m (до начала темной фазы). Образцы крови давали свернуться на льду, и сыворотку отделяли центрифугированием (7000 оборотов в минуту в течение 9 минут при 4 ° C) и хранили при -20 ° С, пока не будут проведены анализы. Уровни /секреции Nesfatin-1 NUCB2 в средствах массовой информации были измерены с помощью Nesfatin-1 (1-82) (Крыса) ELISA набор (номер по каталогу EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Предел чувствительности анализа составлял 1,2 нг /мл для nesfatin-1, при этом диапазон детектирования от 0,1-1000 нг /мл. Количество иммунореактивного материала определяли с использованием нелинейной регрессии кривой подгонки, которая была использована для количественного определения и сравнения концентрации NUCB2 /nesfatin-1 секреции в сыворотке крови и образцы печатных носителей.
NUCB2 /Nesfatin- 1 уровни в сыворотке крови и уровни СМИ и Total грелина в СМИ
Статистический анализ <бр>
Результаты
<р> Мы определили экспрессию NUCB2 (202 б.п.), прогормоном конвертаза 1/3 (400 пар оснований), и прогормоном конвертаза 2 (406 пар оснований) мРНК в клетках MGN3-1 (рис. 1А). Экспрессия мРНК NUCB2 (202 пар оснований) был также обнаружен в желудке, печени, тонкой кишки и толстой кишки самцов мышей линии C57 /BL6 (рис. 1, б). Абсолютные уровни экспрессии мРНК NUCB2 в желудке были выше, чем экспрессия мРНК NUCB2 в печени, тонкой кишки и толстой кишки (рис. 1в).
MGN3-1 клетки иммунопозитивные для грелина, NUCB2 /Nesfatin-1 , PC 1/3 и PC 2
<р> люминесцентной микроскопии показаны MGN3-1 клеток, окрашенных анти-nesfatin-1 антитела (Texas-красный цвет;. фиг.2В) и анти-грелина антитела (FITC-зеленый; рис. 2А) показали четкую совместную локализацию (желтый;. рис 2С) из nesfatin-1 и грелина иммунореактивности. Тем не менее, некоторые грелина позитивные клетки не были иммунореактивная для nesfatin-1 (фиг. 2С). MGN3-1 клетки показали PC 1/3 иммунореактивности (Texas красный, рис. 2D) и PC 2 иммунореактивности (Texas Red, рис. 2E). DAPI (синий) окрашивают ядро всех клеток, включая те клетки, не положительными для исследованных белков. слайды управления окрашивали только вторичным антителом (рис. 2F) не имели иммунореактивности. Конфокальной изображений показал MGN3-1 клетки окрашивали анти-nesfatin-1 антитело (Техас-красный; Фиг.3А.) И анти-грелин антитела (FITC, зеленый;. Фиг.3В) показали четкую совместную локализацию (желтый;. Фиг.3С) из nesfatin-1 и грелина иммунореактивности. Отрицательный контроль окрашивают только лишь вторичными антителами (рис. 3D).
NUCB2 экспрессии белка в толстой кишке, тонкой кишки и печени из мышей-самцов
<р> NUCB2 белок экспрессируется в толстой кишке, тонкий кишечник и печень от самцов мышей, показывая отличную полосу для NUCB2 соответствует приблизительно 50 кДа. Крысы nesfatin-1 пептида использовали в качестве положительного контроля показан в качестве отдельной полосы, соответствующей приблизительно 10 кДа (фиг.4А;. Левое изображение). Тем не менее, никакие полосы, показывающие полностью не обработаны nesfatin-1 были видны в 10 кДа в образцах ткани (рис 4А;. Левое изображение). Мы также обнаружили полосы приблизительно 47 кДа под 50 кДа в тонком кишечнике и печени, но не в толстой кишке (Фиг.4А;. Левое изображение). Отличительная полоса для GAPDH используется в качестве управляющего дома по поддержанию гена наблюдается при 37 кДа показано во всех тканях (рис 4A;. Правое изображение). NUCB2 /nesfatin-1 иммунореактивности обнаруживается в клетках слизистой тонкой кишки (фиг.4В;. Изображение слева) и толстой кишки (фиг.4В;. Правое изображение).
Эффекты глюкозы и L-триптофана на NUCB2 экспрессия мРНК в и NUCB2 /nesfatin-1 секрецию из клеток MGN3-1
<р> клетки инкубировали при 100 мМ глюкозы DMEM имели более высокую экспрессию мРНК NUCB2, чем клетки инкубировали при 5,6, 25 и 50 мМ концентрации глюкозы DMEM на 1 час после инкубации (рис. 5А). Через 2 ч после инкубации клетки инкубировали при 100 мМ DMEM были значительно выше в экспрессии мРНК NUCB2, чем клетки инкубировали при 5,6 и 50 мМ глюкозы DMEM (рис. 5в). Через 1 час (рис. 5, б) и 2-х часов (рис. 5D), не было никаких существенных различий в NUCB2 /nesfatin-1 секреции. NUCB2 экспрессия мРНК была значительно выше в клетках, инкубированных при 10 мМ L-триптофана (рис. 5E) по сравнению с клетками инкубировали при 0,07 и 1,0 мМ L-триптофана. NUCB2 /nesfatin-1 секрецию из клеток, инкубированных при 1,0 и 10,0 мМ L-триптофана, были значительно выше, чем клетки инкубировали при 0,7 мМ L-триптофан (рис. 5f).
Влияние линоленовой кислоты, октановой кислоты и олеиновой кислоты на экспрессию мРНК в NUCB2 и NUCB2 /nesfatin-1 секрецию из клеток MGN3-1
<р> Мы нашли выражение NUCB2 мРНК значительно снижается в клетках, обработанных 1, 10 и 100 мкМ олеиновой кислоты (рис. 6е) по сравнению с контролем. Никаких изменений в мРНК NUCB2 не наблюдали в клетках, обработанных линоленовой (рис. 6, а) и октановой кислоты (рис. 6в). Кроме того, NUCB2 /nesfatin-1 секрецию неизмененном в клетках, обработанных различными дозами линоленовой кислоты (рис. 6, б), каприловой кислоты (рис. 6D), и олеиновой кислоты (рис. 6f).
Влияние L-триптофан, линоленовая кислота, каприловая кислота и олеиновая кислота независимо друг от друга на экспрессию мРНК грелина в и общей секреции грелина из MGN3-1 клеток
Хронический влияние питательных веществ на NUCB2 мРНК экспрессии и сыворотки NUCB2 /nesfatin-1 у мышей
<р> вес тела, потребление пищи и уровень глюкозы в крови профиль мышей, которых кормили на различные диеты показаны на рисунке S2. Мышей, которых кормили на диете с высоким содержанием жира, имели значительно низкую экспрессию мРНК NUCB2 в желудке по сравнению с теми, подается на элемент управления, с высоким содержанием белка или с высоким содержанием углеводов диеты (рис. 8, а). Там не было существенных различий в экспрессии мРНК NUCB2 в тонком кишечнике между мышами, получавшими контролем, с высоким содержанием белка, высоким содержанием углеводов или высоким содержанием жиров диеты (рис. 8, б). Мыши кормили с высоким содержанием белка и высоким содержанием жиров диеты имеют сравнительно низкую экспрессию мРНК NUCB2 в толстой кишке, чем у мышей кормили контрольных или высоким содержанием углеводов диеты (рис. 8в). Мышей, которых кормили на диете с высоким содержанием белка имел значительное низкую экспрессию мРНК NUCB2 в печени, чем у мышей кормили других диет (рис. 8D). В 7 a.m, не было никаких различий в сыворотке nesfatin-1 /NUCB2 уровней у мышей кормили различные диеты (рис. 9а). На 1 p.m, высокий углеводной диеты кормили мышей имели значительно более высокую сыворотку nesfatin-1 /NUCB2 в обращении (рис. 9Б). Сыворотка nesfatin-1 /NUCB2 была значительно ниже у мышей, получавших с высоким содержанием углеводов, с высоким содержанием белка или с высоким содержанием жира, по сравнению с контрольной диетой кормили мышей в 7 часов вечера (рис. 9в).
Острые эффекты питательных веществ на экспрессию мРНК NUCB2 , уровень глюкозы в крови и сыворотки NUCB2 /nesfatin-1 у мышей
Новая стратегия может усилить коммуникацию между кишечником и мозгом
Пациенты, получающие иммунотерапию, должны потреблять больше клетчатки,
Страны с более старым населением имеют более высокий уровень инфицирования и смертности от SARS-CoV-2,
Новый суперактивирующий рецептор макрофагов может объяснить гипервоспаление при тяжелой форме COVID-19
Дырявый кишечник и космический полет - раскрыт механизм
Тяжелые осложнения COVID-19, связанные с нарушением кишечного барьера
Раковые химические вещества из кишечного микроба
Многие обычные кишечные бактерии несут мутации, вызывающие рак, говорится в новом исследовании, опубликованном в журнале Природа 27 февраля 2020 г. Фон В теле человека и на нем живут триллионы б
Метабаркодирование ДНК может улучшить анализ рациона человека
Новое исследование показало, что метабаркодирование ДНК служит новым мощным инструментом для мониторинга потребления растений людьми. которые могут помочь исследователям лучше понять, что мы едим и ка
Создание физической и генетической карты Cannabis sativa
В Каннабис сатива растение обычно используется в различных лекарственных, сельскохозяйственный в промышленных и рекреационных целях по всему миру. Несмотря на широкое распространение, остается мало