PLoS ONE: Nutrienti differenzialmente Regolamentare Nucleobindin-2 /nesfatin-1 in vitro in colture di stomaco Ghrelinoma (MGN3-1) Le cellule ed in vivo nei topi maschi

Astratto

nesfatin-1 è secreta, pasto-reattiva peptide anorexigenic codificato nel precursore nucleobindin-2 [NUCB2]. Di circolazione aumenta nesfatin-1 postprandiale, ma i componenti alimentari che modulano NUCB2 /nesfatin-1 rimangono sconosciute. Abbiamo ipotizzato che carboidrati, grassi e proteine ​​in modo differenziale regolano tessuto specifica espressione di nesfatin-1. NUCB2, pro-ormone convertasi e nesfatin-1 sono stati rilevati nel topo ghrelinoma stomaco [MGN3-1] cellule. NUCB2 mRNA e di proteine ​​sono state rilevate anche in fegato di topo, e intestino tenue e crasso. cellule MGN3-1 sono stati trattati con il glucosio, acidi grassi o aminoacidi. Maschio C57BL /6 topi sono stati alimentati cronicamente alto contenuto di grassi, ad alto contenuto di carboidrati e diete ricche di proteine ​​per 17 settimane. PCR quantitativa e nesfatin-1 saggi sono stati utilizzati per determinare nesfatin-1 a livello di mRNA e di proteine. Il glucosio stimolato l'espressione di mRNA NUCB2 in MGN3-1 cellule. L-triptofano anche aumentato espressione NUCB2 mRNA e l'espressione di mRNA grelina, e nesfatin-1 della secrezione. L'acido oleico ha inibito l'espressione di mRNA NUCB2, mentre l'espressione di mRNA grelina e la secrezione è stata rafforzata. espressione di mRNA NUCB2 era significativamente più bassa nel fegato di topi alimentati con una dieta ricca di proteine ​​rispetto ai topi nutriti altre diete. assunzione cronica di dieta ricca di grassi ha causato una significativa riduzione NUCB2 mRNA nello stomaco, mentre proteine ​​e dieta ad alto contenuto di grassi ha causato simile soppressione della NUCB2 mRNA nell'intestino crasso. Nessuna differenza nel siero nesfatin-1 livelli sono stati trovati in topi a 7 a.m, all'inizio della fase di luce. Dieta ad alto contenuto di carboidrati topi nutriti hanno mostrato significativamente elevati nesfatin-1 livelli a 13:00 Siero nesfatin-1 era significativamente più bassa nei topi alimentati con alto contenuto di grassi, proteine ​​o carboidrati rispetto ai controlli alle 7 pm, appena prima della fase di buio. I topi che hanno ricevuto un bolo di alto contenuto di grassi era significativamente elevati nesfatin-1 /NUCB2 a tutti i tempi testati post-sonda gastrica, rispetto ai topi di controllo e topi nutriti altre diete. I nostri risultati per la prima volta indicano che nesfatin-1 è modulato da nutrienti

Visto:. Mohan H, Ramesh N, S Mortazavi, Le A, Iwakura H, Unniappan S (2014) Nutrienti differenzialmente Regolamentare Nucleobindin-2 /nesfatin-1 in vitro
in stomaco Colta Ghrelinoma (MGN3-1) cellule e in Vivo
nei topi maschi. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10.1371 /journal.pone.0115102

Editor: Yvette Tache, Università della California, Los Angeles, Stati Uniti d'America

Ricevuto: 1 Maggio 2014; Accettato: 18 novembre 2014; Pubblicato: 15 dicembre 2014

Copyright: © 2014 Mohan et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

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Finanziamento: Questa ricerca è finanziata da una sovvenzione di funzionamento aperta dalle canadesi gli Istituti di ricerca di salute (CIHR; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) e uno stabilimento sovvenzione della Fondazione Saskatchewan Health Research (http://shrf.ca/). SU è un CIHR Nuova Investigator. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto. I finanziatori non hanno alcun ruolo nella ricerca o preparazione del manoscritto

Conflitto di interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 sazietà -encoded e grassi influenzano la proteina-1] è un potente peptide anorexigenic implicati nella regolazione del bilancio energetico e glucosio omeostasi [1], [30]. È un peptide di 82 aminoacidi derivato dalla proteina precursore, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 è composto da 396 aminoacidi, costituito da due motivi mano EF e di legame al DNA dominio [1], [3]. l'elaborazione post-traslazionale dal pro-ormone convertasi (PC 1/3 e PC 2) provoca NUCB2 per essere aperto in tre peptidi,-1 nesfatin (1-82 aminoacidi), nesfatin-2 (85-163 aminoacidi), e nesfatin- 3 (166-396 amminoacidi). NUCB2 /nesfatin-1 sequenza aminoacidica è altamente conservata tra vertebrati [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 si trova in vari nuclei ipotalamici che sono coinvolti nel metabolismo energetico, come il nucleo arcuato, nucleo paraventricolare, nucleo supraoptic, zona ipotalamica laterale e zona increta [8], [9]. Cellule produttrici di insulina beta co-express nesfatin-1 nelle isole pancreatiche di ratti e topi [2], [4], [11], suggerendo che nesfatin-1 potrebbe svolgere un ruolo importante nella secrezione di insulina e l'omeostasi del glucosio [4], [29]. La grelina e NUCB /nesfatin-1 sono colocalized nelle gastrici ghiandole della mucosa oxintiche nei roditori [13] e gli esseri umani [16]. mRNA NUCB2 in cellule endocrine della mucosa gastrica purificati è risultata essere superiore nel cervello di ratti [13]. La proteina tutta la lunghezza NUCB2 è stata osservata nelle piccole e grandi intestino e il fegato di ratti maschi e topi ICR [5]. L'ampia distribuzione di NUCB2 /nesfatin-1 nei tessuti centrali e periferici punti ad un ruolo per nesfatin-1 nella regolazione del metabolismo.

la somministrazione giornaliera di nesfatin-1 ha causato esteso riduzione dell'assunzione di cibo e del peso corporeo [1] . amministrazione intracerebroventricular di NUCB2 sopprime l'assunzione di cibo, il peso corporeo e sottocutanea, mesenterica e la massa grassa dell'epididimo nei ratti adulti in maniera dose-dipendente. Inoltre, atterramento NUCB2 nei ratti infondendo antisenso morfolino oligonucleotidi (as-MON) ha causato un aumento di appetito e peso corporeo [1]. Intra-paraventricolare nucleo iniezione di nesfatin-1 riduce l'assunzione di cibo cumulativa a 1 e 3 ore [9]. iniezioni intraperitoneale di nesfatin-1 portato ad una riduzione dell'assunzione di cibo in resistente leptina db /db
topi e dieta nutriti topi alto contenuto di grassi [8]. Nesfatin-1 è composto da 3 frammenti strutturali e solo la metà del frammento (residui 24-53; M30) di nesfatin-1 è coinvolto nella produzione di risposte anoressizzanti [15], [28]. Insieme, questi risultati forniscono la prova evidente che supporta gli effetti di sazietà del nesfatin-1.

nesfatin-1 è un pasto reattivo ormone glucoregulatory [12], [13], e isole pancreatiche di ratti rilasciare NUCB2 in risposta al glucosio [14]. In studi sugli esseri umani, i soggetti trattati avevano più alti di glucosio basali nesfatin-1 livelli rispetto ai soggetti di controllo [10]. Nelle cellule MIN6, un aumento di 4 volte nei livelli nesfatin-1 è stata osservata quando le cellule sono state incubate in alte concentrazioni di glucosio (16,7 mM) rispetto al basso livello di glucosio (2,0 mm) [4]. Nesfatin-1 maggiore di glucosio stimolata la secrezione di insulina dalle cellule in coltura MIN6 che sono state incubate in alti livelli di glucosio rispetto al basso livello di glucosio in modo dose-dipendente [4]. Nel pancreas di streptozotocina (STZ) topi -injected con diabete di tipo 1, si è constatato che sia NUCB2 e l'espressione di mRNA preproinsulina erano significativamente più bassi [4]. Al contrario, una maggiore nesfatin-1 co-localizzazione con insulina è stato trovato nelle cellule isolotto beta di alto contenuto di grassi indotta dalla dieta topi obesi con diabete di tipo 2. Nesfatin-1 ha effetti specifici di tessuto sulla captazione del glucosio negli adipociti di ratto e del muscolo [30]. Nel complesso, nesfatin-1 esercita un ruolo importante nella regolazione del glucosio tutto il corpo e l'omeostasi energetica
.

Mentre nesfatin-1 sta emergendo come un peptide reattivo importante pasto [1], [12], [13], [30] , ciò che scatena la sua secrezione rimane poco chiaro. Quali componenti dieta innescare la secrezione post-pasto della nesfatin-1? Questa domanda rimane senza indirizzo. L'obiettivo principale di questo studio è quello di determinare come i diversi elementi nutritivi in ​​grado di modulare in vitro
in coltura ghrelinoma stomaco (MGN3-1), le cellule NUCB2 /nesfatin-1 da topi e in vivo
nel maschio topi. I risultati dei nostri in vitro
studi indicano che MGN3-1 cellule rispondono in modo diverso alle sostanze nutritive a secernere NUCB2 /nesfatin-1 e grelina. Allo stesso modo, l'assunzione acuta o cronica di nutrienti fa espressione di mRNA influenza NUCB2 e NUCB2 /nesfatin-1 rilascio in maniera specifica dieta.

Materiali e Metodi

Etica Dichiarazione

Tutto studi su animali rispettate il Consiglio canadese delle linee guida per la cura degli animali, e sono state approvate dal Consiglio Etico Research animali dell'Università di Saskatchewan (protocollo numero 2012-0033).

in vitro
studi

mouse stomaco ghrelinoma (MGN3-1), le cellule [17] sono state coltivate in DMEM (Invitrogen, Ontario, Canada; Catalogo.995-040) che è stato integrato con il 10% di siero fetale bovino (Invitrogen; Catalogo|84 ) e 1% di penicillina (100 U /mL) e streptomicina (100 ug /mL) (Invitrogen; Catalogo.140-122) a 37 ° C in 10% CO _{2. A 80% di confluenza, MGN3-1 cellule sono state seminate a 6 × 10 ^{6 celle /bene in un 12-pozzetti e gli studi sono stati effettuati quando le cellule erano 80-90% confluenti. Ogni studio è stato ripetuto tre volte ed i dati provenienti da tre studi sono stati raggruppati per ottenere un n = 9-12 pozzo /trattamento. Per determinare se il glucosio ha un effetto in una dose e tempo modo dipendente, le cellule sono state incubate per 1 ora e 2 ore con 5,6, 25, 50, e 100 mM di glucosio supporti DMEM. Il mezzo di crescita completo delle cellule MGN3-1 richiede che siano crescono ad un elevato livello di glucosio, che è di 25 mM. In relazione agli studi condotti con acidi grassi e aminoacidi, abbiamo eseguito questi studi utilizzando DMEM a bassi livelli di glucosio (5,6 mM), poiché utilizzando un terreno glucosio (25 mM) potrebbero mascherare l'effetto dei rispettivi nutrienti sulla NUCB2 /nesfatin secrezione -1 e la sintesi. Per quanto riguarda gli acidi grassi a catena lunga, abbiamo testato l'effetto di tre acidi grassi diversi utilizzando acido linolenico (Sigma-Aldrich, Ontario, Canada; Prodotto # L2376), acido ottanoico (Sigma-Aldrich; Prodotto # C2875) e l'acido oleico (Sigma -Aldrich; prodotto # O1383). Le cellule sono state incubate per 4 ore con ogni acidi grassi a 0, 1, 10, 100 pM. Abbiamo usato L-triptofano (Sigma-Aldrich; Articolo # T8941) per testare l'effetto di un amminoacido sulla secrezione NUCB2 e sintesi. Le cellule sono state incubate per 4 ore con L-triptofano a 0.7, 1, 10 mM. L-triptofano è presente nel mezzo di controllo (5,6 mm DMEM glucosio) alla dose minima di 0,7 mm, che è essenziale per la loro condizione di crescita.}}

In vivo
Studi

per l'alimentazione cronica di diete contenenti quantità variabili di specifici nutrienti, età e peso-abbinato (5 settimane di vita, il peso corporeo medio: 20 grammi) maschi C57BL /6 topi (Charles River Laboratories, Quebec, Canada) sono stati alloggiati individualmente per 17 settimane in una luce 12 ore: 12 ore ciclo di buio (luci fuori a 19:00 e su alle 7 del mattino), temperatura e umidità controllate Vivarium. I topi sono stati divisi in quattro gruppi alimentati su un controllo (n = 6), carboidrati alto (n = 7), ad alto contenuto proteico (n = 7), e alto contenuto di grassi (n = 7) dieta con ad libitum
l'accesso all'acqua e la loro dieta specifica. Tutte le diete sono stati acquistati da diete di ricerca (New Brunswick, NJ). Il contenuto calorico delle diete sono stati: controllo (Product # D12451): 4.73 kcal /gm con l'energia del 20% derivato da proteine, il 35% di energia derivata da carboidrati e il 45% di energia derivata dai grassi; alto contenuto di carboidrati (Product # D12450J) aveva 3,8 kcal /g con il 20% di energia derivate dalle proteine, il 70% di energia derivata da carboidrati e il 10% di energia derivata dai grassi; ad alto contenuto proteico (Product # D08091802) aveva 3,8 kcal /g con l'energia il 60% derivato da proteine, il 30% di energia derivata da carboidrati e il 10% di energia derivata dai grassi e alto contenuto di grassi (Product # D12492) ha avuto 5,2 kcal /g con il 20% energia derivata da proteine, 20% di energia derivata da carboidrati e 60% di energia derivata dai grassi. Tutti i topi sono stati alimentati con dieta di controllo per una settimana prima di iniziare le diete specifiche. assunzione di cibo, peso corporeo, e di glucosio nel sangue letture Post 4 ore veloce sono stati misurati una volta alla settimana per 17 settimane

Per la somministrazione acuta di sostanze nutritive, l'età e il peso-abbinato (5 settimane di vita, il peso corporeo medio.: 20 grammi) di sesso maschile topi C57BL /6 (Charles River Laboratories, St Constant, QU, Canada) sono stati alloggiati individualmente per 1 settimana e 2 giorni in una luce 12 h: 12 h ciclo scuro (si spegne alle 19:00 e alle 07:00 ), temperatura e umidità controllate Vivarium. I topi sono stati acclimatati per 1 settimana all'arrivo e ha avuto ad libitum l'accesso all'acqua e chow regolare il mouse per 11 giorni. Dal momento che stiamo eseguendo uno studio di dieta acuta, ci serviva agli animali di acclimatarsi alla procedura sonda gastrica. Abbiamo acclimatati i topi a questa procedura da loro gavaging con acqua di rubinetto per 2 giorni prima del giorno sperimentale. Il 12 ^{° giorno, i topi sono stati tenuti a digiuno per 4 ore e sono stati gavaged con una determinata dieta liquida. I topi sono stati divisi in 4 gruppi: ad alta percentuale proteica (Isopure Protein Drink, Zero Carb - Mango gusto di pesca; Natura di Best, Clifton Park, New York; n = 7), alto contenuto di grassi (Splendido, spremuto a freddo Olio extra vergine di oliva; Scelta del Presidente , Canada; n = 7), alto contenuto di carboidrati (D-glucosio; BioShop; Catlogue # GLU501.500; n = 7) e acqua (l'acqua del rubinetto; n = 7). Il giorno dello studio, 200 microlitri di nutrienti sopra /acqua è stata somministrata a topi mediante sonda gastrica. letture di glucosio nel sangue è stata presa a 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 e 120 minuti, e il sangue sono stati raccolti a 15, 30, 60, e 120 minuti per l'analisi ELISA per determinare i livelli di NUCB2 /nesfatin circolazione -1. Tessuti (stomaco, intestino tenue [duodeno], intestino crasso e fegato) sono stati raccolti da ogni mouse al momento della cessazione dello studio (in profondità l'eutanasia isoflurano seguita da dislocazione cervicale). Per mantenere la coerenza, la tempistica e la durata di ogni esperimento, interventi chirurgici e la raccolta dei campioni sono stati mantenuti costanti per tutti gli studi.}

L'RNA totale Estrazione e cDNA Synthesis

Le cellule o tessuti sono stati raccolti da ogni studio per confrontare l'espressione di mRNA NUCB2. Dal topi che ha subito lo studio dieta cronica, tessuti (stomaco, intestino tenue, intestino crasso e fegato) sono state raccolte subito dopo l'eutanasia. RNA totale è stato estratto dalle MGN3-1 cellule e tessuti, utilizzando l'isolamento reagente TRIzol RNA (Invitrogen). RNA purezza è stato convalidato dal rapporto di assorbimento ottico densità (OD) (OD 260 nm /OD 280 nm) utilizzando un 2000c NanoDrop (Thermo, Vantaa, Finlandia). Solo campioni con un rapporto di assorbimento superiore a 1,8 sono stati usati per la sintesi di cDNA. Sintesi di cDNA è stata condotta utilizzando kit di sintesi iScript cDNA come indicato dal costruttore (BioRad, Canada).

RT-PCR quantitativa e Real-Time PCR

RT-PCR e qRT-PCR per NUCB2, la grelina, e RT-PCR per PC 1/3 e PC 2 sono state condotte secondo le condizioni indicate nella Tabella 1, utilizzando il CFX Connect Real-time PCR Detection System (Bio-Rad). Per l'analisi qRT-PCR, mRNA espressione di NUCB2 è stata normalizzata con la beta-actina come un gene housekeeping. I prodotti di PCR per NUCB2 nello stomaco, fegato e intestino crasso e questi geni (NUCB2, grelina, PC e PC 1/3 2) nelle cellule sono state MGN3-1 elettroforesi in gel di agarosio 1% per verificare le trascrizioni amplificati. Sulla base di studi precedenti [4], abbiamo usato beta-actina come controllo interno per normalizzare il segnale di NUCB2 mRNA. Quando si utilizza l'RNA totale in cui mRNA quantificazione è stato molto preciso, i valori di soglia critici per la beta-actina non hanno mostrato variabilità. Relativa espressione di mRNA NUCB2 è stata normalizzata con la beta-actina dallo stesso campione secondo il metodo Livak [31].

Immunocitochimica e Microscopia

MGN3-1 cellule sono state coltivate in una presentazione del sistema Labtek Camera (Nalge Nunc internazionale, Rochester, NY) e sono stati autorizzati a crescere fino nei pressi di confluenza. Le cellule sono state lavate con tampone fosfato 1X (PBS; 2 × 5 minuti, 25 ° C) e fissati in una soluzione (PFA) in 1X PBS per 10 minuti paraformaldeide 4% a 25 ° C, seguito da un altro lavaggio con 1X PBS ( 3 × 5 minuti, 25 ° C). Le cellule sono state fissate permeabilizzate in una soluzione di 0,3% Triton-X (Bioshop, Burlington, Ontario, Canada) in 1X PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. I vetrini sono stati incubati in tampone di bloccaggio contenente 10% siero di capra in 1X PBS per 1 ora a temperatura ambiente. Le cellule sono state poi incubate in anticorpo primario (Tabella 2) a 4 ° C durante la notte. I vetrini sono stati lavati con PBS (3 × 5 minuti, 25 ° C) e incubato con l'anticorpo secondario (Tabella 2, l'anticorpo PC1 /3 è stato un dono generoso da Dr. Iris Lindberg, Università del Maryland School of Medicine) per 4 ore a temperatura ambiente. Infine, i vetrini sono stati lavati con PBS (3 × 5 minuti, 25 ° C) e montati con terreno contenente 4 'di montaggio Vectashield, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada).

Le cellule sono state visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito Nikon Eclipse-Ti (Nikon, Mississauga, Ontario, Canada) e le immagini sono state catturate con una fotocamera Nikon DS-Qi1 MC (Nikon). Le immagini sono state analizzate usando NIS-Elements ricerca di base (Nikon) su un Dell workstation HP. Le immagini mostrate sono cellule rappresentativi colorate per la grelina, NUCB2, PC 1/3 e PC2. Per l'imaging ad alta risoluzione, le cellule sono state viste, analizzate e le immagini acquisite utilizzando una Leica TCS SP5 microscopio confocale.

Analisi Western Blot, immunoistochimica e microscopia a fluorescenza

Per confermare la presenza di nucleobindin-2 (NUCB2) nell'intestino e nel fegato, tre, 3 mesi C57BL /6 topi maschi sono stati usati. In breve, fegato e intestino tenue e crasso sono stati raccolti e separati per l'analisi occidentale o immunoistochimica. I tessuti per Western Blot omogeneizzati in T-PER proteina del tessuto estrazione reagente (Thermo Scientific,̑10) hanno seguito la determinazione della concentrazione delle proteine ​​mediante saggio Bradford. I campioni sono stati preparati in 1X tampone di Laemmli contenente 0,2% 2-mercaptoetanolo (Bio-Rad,¡-0737 e -0710) e successivamente sono stati cotti a 95 ° C per 5 min seguita da vortex. Il volume del campione intero (20 mL) contenenti ciascuna 50 mg di proteine ​​o sintetica rat nesfatin-1 (ABGENT, 1 ug /ml; precedentemente utilizzato in 4, 29) è stato caricato su un gel, e operare in un mini-PROTEAN TGX 8-16 % gel di pendenza (Bio-Rad,Lj-1104). Dopo la separazione, le proteine ​​sono state trasferite ad un 0,2 micron Biotrace nitrocellulosa membrana (Pall Life Sciences,.377-000) e poi membrana è stata bloccata in soluzione 1X RapidBlock (AMRESCO, # M325). individuazione di proteine ​​NUCB2 è stata effettuata utilizzando coniglio anti-nesfatin-1 (Numero di catalogo H-003-22; 1:500 diluizione; Phoenix Pharmaceuticals, California) e GAPDH proteina è stata rilevata mediante l'uso di antisiero di coniglio diretto contro GAPDH mouse (AbDSerotec, # AHP1628 ) diluito 1:1000. Come anticorpo secondario, di capra anti-coniglio IgG (H + L) HRP (Bio-Rad,ª-6515) diluito 1:3000 è stato utilizzato. Per la visualizzazione di proteine ​​della membrana è stata incubata per 5 minuti in chiarezza occidentale ECL substrato (Bio-Rad,ª-5061) e ripreso con ChemiDoc MP sistema di imaging (Bio-Rad,ª-8280) con rivelazione chemiluminescenza. Membrana stripping in tra il rilevamento di proteine ​​è stata condotta utilizzando Restore Plus strippaggio Blot tampone occidentale (Thermo Scientific,ǐ30). Precision Plus proteine ​​standard dual Xtra (Bio-Rad,¡-0377) sono stati utilizzati come marcatori di peso molecolare.

Per gli studi di immunoistochimica, i tessuti raccolti sono stati fissati in 4% di formaldeide per 24 ore a 4 ° C. Fissativo è stato sostituito con etanolo (tre 70% etanolo), ciascuno seguito da 10 minuti di incubazione a 4 ° C. I tessuti sono stati poi archiviati in etanolo al 70% a 4 ° C e sono stati elaborati e sezionati al Prairie Diagnostic Services Inc. (PDS Inc., Western College di Medicina Veterinaria, Università di Saskatchewan). Sezioni in paraffina di 4 micron di spessore sono stati preparati per immunocolorazione. Queste sezioni sono state deparaffinate con xilene (incubate due volte in 100% xilene, 5 minuti, 25 ° C) e reidratate in una serie graduata di etanolo (incubate due volte in 100% di etanolo, e una volta in ogni etanolo 95%, 70% di etanolo, 50% etanolo, 2 minuti ciascuno, 25 ° C). Le sezioni sono state poi incubate con perossido di idrogeno al 3% in acqua distillata per bloccare l'attività perossidasica endogena (30 minuti a temperatura ambiente). Le sezioni sono state poi bloccate con siero proteine ​​blocco reagente (DAKO Corporation, California) per 10 minuti prima di essere incubate con anticorpi primari. Queste sezioni sono state poi incubate con coniglio anti-nesfatin-1 (Numero di catalogo H-003-22; 1:500 diluizione; Phoenix Pharmaceuticals, California) per 24 ore a temperatura ambiente. Tutti i vetrini sono stati successivamente lavati tre volte con PBS 1x e incubate con capra anti-coniglio Texas Red IgG (Red-nesfatin-1; Numero di catalogo TI-1000; 1:100 diluizione; Vector Laboratories, California) anticorpo secondario per 1 ora a camera temperatura. Tutti gli anticorpi primari e secondari sono stati diluiti nel diluente reattivo (DakoCytomation, Mississauga, Ontario). I vetrini sono stati lavati tre volte con PBS 1x e sette volte con acqua distillata. Infine, i vetrini sono stati montati con media Vectashield che contengono DAPI colorante nucleare (Blu; Vector Laboratories, Burlingame, California). Le sezioni sono state viste con un microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse Ti-E invertito (Nikon Canada, Mississauga, Canada). Le immagini sono state catturate con una macchina fotografica in bianco e nero raffreddato Nikon DS-Qi1 MC collegato ad un computer Dell HP Workstation e elementi NIS software di imaging la ricerca di base (Nikon Canada, Mississauga, Canada). Solo le immagini rappresentative di piccole e grandi macchie intestino per NUCB2 /nesfatin-1 con DAPI sono riportate nella sezione risultati.

nesfatin-1 /NUCB2 livelli nel siero e Media

Per indagare nutrienti dipendente cambiamenti nella NUCB2 /nesfatin-1 della secrezione da MGN3-1 cellule, i media sono stati raccolti dopo periodi di incubazione specifici. Per evitare detriti cellulari, i campioni sono stati centrifugati (13000 rpm per 10 minuti a 4 ° C) e la parte superiore 700 microlitri è stato conservato a -20 ° C fino-1 nesfatin misura. Per misurare circolanti NUCB2 /nesfatin-1, sangue è stato prelevato a 7 a.m (subito dopo inizia la fase leggera), 1:00 (metà della fase di luce) e alle 7 pm (prima dell'inizio della fase di buio). I campioni di sangue sono stati lasciati coagulare su ghiaccio, e siero è stato separato per centrifugazione (7000 rpm per 9 minuti a 4 ° C) e conservati a -20 ° C, fino stati condotti saggi. livelli /nesfatin-1 secrezione NUCB2 nei media sono stati misurati utilizzando il nesfatin-1 (1-82) Kit (Rat) ELISA (Numero di catalogo EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Il limite di sensibilità del test era di 1,2 ng /mL per nesfatin-1, con la gamma rilevabile ,1-1.000 ng /mL. La quantità di materiale immunoreactive è stato determinato utilizzando una regressione non lineare della curva-fit, che è stato utilizzato per quantificare e confrontare la concentrazione di NUCB2 /nesfatin-1 della secrezione nei campioni di siero e dei media.

NUCB2 /Nesfatin- 1 livelli nel siero e livelli di supporti e Total grelina nei media

Per indagare i cambiamenti nutrizionali dipendenti in NUCB2 /nesfatin-1 e totale la secrezione di grelina da MGN3-1 cellule, i media è stato raccolto dopo periodi di incubazione specifici. Per evitare detriti cellulari, i campioni sono stati centrifugati (13000 rpm per 10 minuti a 4 ° C) e la parte superiore 700 microlitri è stato conservato a -20 ° C fino NUCB2 /nesfatin-1 e totale misura grelina. I campioni di sangue sono stati lasciati coagulare su ghiaccio, e siero è stato separato per centrifugazione (7000 rpm per 9 minuti a 4 ° C) e conservati a -20 ° C, fino stati condotti saggi. NUCB2 /nesfatin-1 livelli di secrezione nel siero e dei media sono stati misurati utilizzando il nesfatin-1 (1-82) Kit (Rat) ELISA (Numero di catalogo EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Il limite di sensibilità del test era di 1,2 ng /mL per nesfatin-1, con la gamma rilevabile ,1-1.000 ng /mL. Allo stesso modo, i livelli totali di secrezione di grelina nei media è stata misurata utilizzando la grelina (Ratto, Mouse) Kit EIA (Numero di catalogo EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc, California). Il limite di sensibilità del test era 1.16 ng /mL per ghrelin totale, con la gamma rilevabile da 0-100 ng /mL. La quantità di materiale immunoreactive è stato determinato utilizzando una regressione non lineare della curva-fit, che è stato utilizzato per quantificare e confrontare la concentrazione di NUCB2 /nesfatin-1 della secrezione nei campioni di siero e dei media.

Analisi statistica

L'analisi dei dati quantificati qRT-PCR ed ELISA sono stati condotti utilizzando One-Way ANOVA seguito dal test di confronto multiplo di Tukey. GraphPad Prism versione 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, USA) è stato utilizzato per le analisi statistiche e grafici. La significatività è stata assegnata quando p < 0.05. I dati sono espressi come media ± SEM.

Risultati

NUCB2, PC 1/3 e PC 2 mRNA sono espressi in MGN3-1 cellule e NUCB2 mRNA è espresso nello stomaco, fegato, piccolo intestino e intestino crasso del maschio topi

Abbiamo identificato espressione di NUCB2 (202 bp), pro-ormone convertasi 1/3 (400 bp), e pro-ormone convertasi 2 (406 bp) mRNA in MGN3-1 cellule (Fig. 1A). NUCB2 (202 bp) espressione di mRNA è stato anche rilevato nello stomaco, fegato, intestino tenue e crasso di topi maschi C57 /BL6 (Fig. 1B). i livelli assoluti di espressione dell'mRNA NUCB2 nello stomaco erano superiori espressione NUCB2 mRNA nel fegato, intestino tenue e crasso (Fig. 1C).

MGN3-1 cellule sono immunopositive per grelina, NUCB2 /nesfatin-1 , PC 1/3 e PC 2

microscopia a fluorescenza visualizzato MGN3-1 cellule colorate con anti-nesfatin-1 anticorpi (Texas-Red; Fig. 2B) e anticorpo anti-grelina (FITC-verde; fig. 2A) ha mostrato chiari co-localizzazione (giallo; Fig. 2C) di immunoreattività nesfatin-1 e grelina. Tuttavia, alcune cellule positive grelina non erano immunoreattive per nesfatin-1 (Fig. 2C). le cellule hanno mostrato MGN3-1 PC 1/3 immunoreattività (Texas Red; Fig. 2D) e PC 2 immunoreattività (Texas Red, figura 2E.). DAPI (blu) macchiato il nucleo di tutte le cellule, tra cui quelle cellule non positive per le proteine ​​studiate. vetrini di controllo colorati con anticorpo secondario da solo (Fig. 2F) non avevano immunoreattività. confocale ha mostrato MGN3-1 cellule colorate con anti-nesfatin-1 anticorpi (Texas-Red; Fig 3A.) e di anticorpi anti-grelina (FITC-verde; Fig. 3B) hanno mostrato chiari co-localizzazione (giallo; Fig. 3C) di immunoreattività nesfatin-1 e grelina. Controllo negativo è macchiato solo con anticorpi secondari da solo (Fig. 3D).

l'espressione della proteina NUCB2 nel crasso, intestino tenue e nel fegato di topi maschi

proteine ​​NUCB2 si esprime nel grande intestino, piccolo intestino e fegato da topi maschi che mostrano delle bande per NUCB2 corrispondente a circa 50 KDa. Rat peptide nesfatin-1 utilizzato come controllo positivo viene mostrata come una banda distinta corrispondente a circa 10 kDa (Fig 4A;. Immagine di sinistra). Tuttavia, nessuna banda che mostrano il completamente elaborati nesfatin-1 erano visibili a 10 kDa nei campioni di tessuto (Fig 4A;. Immagine a sinistra). Abbiamo anche trovato bande di circa 47 kDa sotto la kDa banda 50 nell'intestino tenue e nel fegato, ma non nel crasso (Fig 4A;. Immagine di sinistra). Una banda distinta per GAPDH utilizzato come gene di controllo di pulizia è osservata a 37 kDa mostrato in tutti i tessuti (Fig 4A;. Immagine a destra). NUCB2 /nesfatin-1 immunoreattività si trova nelle cellule della mucosa del piccolo intestino (Fig 4B;. Immagine a sinistra) e crasso (Fig 4B;. Immagine a destra).

Effetti di glucosio e di L-triptofano sul NUCB2 espressione di mRNA in, e NUCB2 /nesfatin-1 secrezione dalle cellule MGN3-1

Le cellule incubate a DMEM 100 mm glucosio avevano una più alta espressione NUCB2 mRNA rispetto alle cellule incubate a 5,6, 25 e 50 la concentrazione di glucosio mM DMEM a 1 ora post-incubazione (Fig. 5A). A 2 ore di post-incubazione, le cellule incubate 100 mm DMEM erano significativamente più alti di espressione NUCB2 mRNA rispetto alle cellule incubate a 5,6 e 50 mm di glucosio DMEM (Fig. 5c). A 1 ora (Fig. 5B) e 2 ore (Fig. 5D), non c'erano differenze significative nella NUCB2 /nesfatin-1 della secrezione. espressione mRNA NUCB2 era significativamente maggiore nelle cellule incubate a 10 mM L-triptofano (Fig. 5E) rispetto alle cellule incubate a 0,07 e 1,0 mM L-triptofano. NUCB2 /nesfatin-1 della secrezione dalle cellule incubate a 1,0 e 10,0 mm L-triptofano erano significativamente più alti rispetto alle cellule incubate a 0,7 mm L-triptofano (Fig. 5F).

Effetto di acido linolenico, acido ottanoico e oleico L'acido sull'espressione NUCB2 mRNA in, e NUCB2 /nesfatin-1 secrezione dalle cellule MGN3-1

Abbiamo trovato espressione NUCB2 mRNA significativamente ridotta nelle cellule trattate con 1, 10, e 100 micron acido oleico (Fig. 6 sexies) in confronto al controllo. Non sono state osservate variazioni NUCB2 mRNA in cellule trattate con linolenico (Fig. 6A) e acido ottanoico (Fig. 6C). Inoltre, NUCB2 /nesfatin-1 secrezione era inalterato in cellule trattate con differenti dosi di acido linolenico (Fig. 6B), acido ottanoico (Fig. 6D) e acido oleico (Fig. 6F).

Effetto L-triptofano, acido linolenico, acido ottanoico e acido oleico indipendentemente sull'espressione grelina mRNA, e la secrezione di grelina totale da MGN3-1 cellule

Non ci sono cambiamenti di grelina mRNA (S1A figura) e la secrezione di grelina totale (Figura S1B ) sono stati trovati quando le cellule sono state trattate con diverse dosi di glucosio dopo 1 ora di incubazione. espressione grelina mRNA era significativamente maggiore nelle cellule incubate a 1 mM L-triptofano (Fig. 7A) rispetto alle cellule incubate a 0,07 e 10 mM L-triptofano. Nessuna differenza significativa in totale secrezione di grelina da cellule trattate con diverse dosi di L-triptofano (Fig. 7B). Abbiamo trovato nessun cambiamento nell'espressione ghrelin mRNA (Fig. 7C), ma totale secrezione di grelina era alto da cellule incubate con 100 mM di acido linolenico (Fig. 7D) rispetto al controllo, 1 e 10 pM dosi. Nessuna modifica in grelina mRNA (Fig. 7E) e totale secrezione di grelina (Fig. 7F) sono stati trovati quando le cellule sono state trattate con diverse dosi di acido ottanoico. Nel frattempo, la grelina mRNA (Fig. 7H), e totale secrezione di grelina (Fig. 7I) erano significativamente maggiore nelle cellule trattate con 100 mM di acido oleico, rispetto al controllo, 1 e 10 mM di acido oleico.

Chronic effetti delle sostanze nutritive sulla NUCB2 mRNA espressione e siero NUCB2 /nesfatin-1 nei topi

Il profilo del peso corporeo, l'assunzione di cibo e di glucosio nel sangue dei topi nutriti con varie diete sono mostrati in figura S2. I topi alimentati con una dieta ricca di grassi era significativamente bassa espressione di mRNA NUCB2 nello stomaco rispetto a quelli nutriti con un controllo, alto contenuto di proteine ​​o di carboidrati diete ad alto (Fig. 8A). Non vi era alcuna differenza significativa nella espressione di mRNA NUCB2 nell'intestino tenue tra i topi nutriti con un controllo, ad alto contenuto proteico, alto contenuto di carboidrati o alto diete ricche di grassi (Fig. 8b). I topi nutriti con il alto contenuto di proteine ​​e le diete alto contenuto di grassi ha relativamente bassa espressione di mRNA NUCB2 nell'intestino crasso rispetto ai topi nutriti con controllo o di alto contenuto di carboidrati diete (Fig. 8c). I topi nutriti con una dieta ad alto contenuto proteico avevano una significativa bassa espressione di mRNA NUCB2 nel fegato rispetto ai topi nutriti con le altre diete (Fig. 8D). Alle 7 a.m, non vi erano differenze nel siero nesfatin-1 /NUCB2 livelli in topi alimentati con diete diverse (Fig. 9A). A 1 pm, i topi alto contenuto di carboidrati dieta nutriti aveva significativamente più alto nel siero nesfatin-1 /NUCB2 in circolazione (Fig. 9B). Siero nesfatin-1 /NUCB2 era significativamente più bassa nei topi alimentati ad alto contenuto di carboidrati, proteine ​​ad alto o alto contenuto di grassi, rispetto alla dieta di controllo topi nutriti alle 7 di sera (Fig. 9C).

Effetti acuti di nutrienti sull'espressione NUCB2 mRNA , di glucosio nel sangue e siero NUCB2 /nesfatin-1 nei topi

non ci sono stati cambiamenti significativi nell'espressione di mRNA NUCB2 nello stomaco (Fig. 10A), piccolo intestino (Fig. 10B), intestino crasso (fig . 10C) e del fegato (Fig. 10D) tra i topi nutriti con un alto contenuto di proteine, di carboidrati, alto contenuto di grassi o acqua.

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