PLOS ONE: Nutrientes diferencialmente Regular Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro no estômago Cultivadas Ghrelinoma Cells (MGN3-1) e in vivo em Male Mice

Abstract

Nesfatin-1 é secretado, refeição-responsive anorexígeno péptido codificado no precursor nucleobindin-2 [NUCB2]. Circulando nesfatin-1 aumenta pós-prandialmente, mas os componentes da dieta que modulam NUCB2 /nesfatin-1 permanecem desconhecidos. Nossa hipótese é que carboidratos, gorduras e proteínas diferencialmente regulam tecido expressão específica do nesfatin-1. NUCB2, convertases prohormone e nesfatin-1 foram detectados em rato ghrelinoma estômago [MGN3-1] células. NUCB2 mRNA e proteína também foram detectados no fígado do rato, e intestinos delgado e grosso. MGN3-1 células foram tratadas com glucose, ácidos gordos ou aminoácidos. Do sexo masculino C57BL /6 foram cronicamente alimentado alto teor de gordura, rica em carboidratos e dietas ricas em proteínas durante 17 semanas. Quantitative PCR e ensaios nesfatin-1 foram utilizados para determinar nesfatin-1 nos níveis de ARNm e de proteína. De glucose estimulada a expressão de ARNm em NUCB2 MGN3-1 células. L-triptofano, também aumentou a expressão de ARNm e a expressão de ARNm NUCB2 grelina, e secreção nesfatin-1. O ácido oleico inibiu a expressão de ARNm NUCB2, enquanto que a expressão de ARNm de grelina e a secreção foi melhorada. a expressão de ARNm NUCB2 foi significativamente menor no fígado de ratos alimentados com uma dieta de alto teor de proteína em comparação com ratos alimentados com outras dietas. ingestão crónica de dieta rica em gordura causou uma redução significativa no ARNm NUCB2 no estômago, enquanto a alta proteína e dieta rica em gorduras causou supressão semelhante dos ARNm NUCB2 no intestino grosso. Não houve diferença no soro nesfatin-1 foram encontrados níveis em ratos em 7 a.m, no início da fase de luz. ratos alimentados dieta rica em carboidratos mostraram significativamente elevados nesfatin-1 níveis em 13:00 Serum nesfatin-1 foi significativamente menor nos ratos alimentados com alto teor de gordura, proteína ou carboidrato em comparação com os controles às 7 pm, pouco antes da fase escura. Os ratos que receberam um bolus de elevado teor de gordura tinham significativamente elevados nesfatin-1 /NUCB2 em todos os pontos de tempo testados pós-gavagem, em comparação com ratinhos de controlo e os ratos alimentados com outras dietas. Nossos resultados para o primeiro tempo indicam que nesfatin-1 é modulada por nutrientes

Citation:. Mohan H, Ramesh N, Mortazavi S, Le A, Iwakura H, Unniappan S (2014) Nutrientes diferencialmente Regular Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 In Vitro
no estômago Cultivadas Ghrelinoma (MGN3-1) células e In Vivo
em camundongos machos. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10.1371 /journal.pone.0115102

editor: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de maio de 2014; Aceito: 18 de novembro de 2014; Publicação: 15 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Mohan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento: Esta pesquisa é financiada por um subsídio operacional aberto das Insitutes Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) e um Grant Estabelecimento da Fundação Saskatchewan Pesquisa em Saúde (http://shrf.ca/). SU é um CIHR New Investigator. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os financiadores não têm qualquer papel na investigação ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 saciedade codificado pelo e-fat influenciar proteína-1] é um peptídeo anorexígeno potente implicado na regulação do balanço energético e glicose homeostase [1], [30]. É um péptido de 82 aminoácidos derivado do ácido a partir da proteína precursora, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 é composto por 396 aminoácidos, que consiste em dois motivos EF hand e um domínio de ligação de ADN [1], [3]. o processamento pós-translacional pela prohormona convertases (PC PC 1/3 e 2) faz com que NUCB2 para ser clivado em três péptidos, 1-nesfatin (1-82 aminoácidos), nesfatin-2 (85-163 aminoácidos), e nesfatin- 3 (aminoácidos 166-396). NUCB2 /nesfatin-1 de sequência de aminoácidos é altamente conservado entre os vertebrados [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 é encontrado em vários núcleos hipotalâmicos que estão envolvidas no metabolismo de energia, tais como o núcleo arqueado, núcleo paraventricular, supra-óptico núcleo, área hipotalâmica lateral e increta Zona [8], [9]. Produtoras de insulina de células beta co-expressa nesfatin-1 nos ilhéus pancreáticos de ratos e ratinhos [2], [4], [11], sugerindo que nesfatin-1 pode desempenhar um papel importante na secreção de insulina e homeostase da glicose [4], [29]. A grelina e NUCB /nesfatin-1 são co-localizada nas glândulas mucosas gástricas oxínticas em roedores [13] e seres humanos [16]. a expressão de ARNm em células endócrinas NUCB2 mucosa gástrica purificadas foi encontrada para ser mais elevada do que no cérebro de ratos [13]. A proteína de comprimento completo NUCB2 foi observada nos intestinos grosso e delgado e no fígado de ratos machos, ratinhos ICR e [5]. A ampla distribuição de NUCB2 /nesfatin-1 em tecidos pontos centrais e periféricos para um papel para nesfatin-1 na regulação do metabolismo.

A administração diária de nesfatin-1 causou redução prolongada da ingestão alimentar e do peso corporal [1] . administração intracerebroventricular de NUCB2 suprime a ingestão de alimentos, peso corporal e subcutânea, mesentérica e massa de gordura epididimal de ratos adultos numa forma dependente da dose. Além disso, knockdown NUCB2 em ratos através da infusão de oligonucleótido anti-sentido de morfolino (AS-seg) causou um aumento do apetite e do peso corporal [1]. injecção intra-núcleo paraventricular do nesfatin-1 reduz a ingestão de alimentos cumulativos a 1 e 3 horas [9]. As injecções intraperitoneais de nesfatin-1 resultou numa redução na ingestão de alimentos em leptina resistente db /db
ratinhos e ratos alimentados com a dieta de alta gordura [8]. Nesfatin-1 é composto por 3 fragmentos estruturais e apenas o meio-fragmento (resíduos 24-53) de M30; nesfatin-1 está envolvida na produção de respostas anorexígenos [15], [28]. Juntos, estes resultados fornecem evidências claras de que suportam efeitos de saciedade de nesfatin-1.

Nesfatin-1 é um hormônio refeição responsiva glicoreguladores [12], [13] e ilhotas pancreáticas de ratos liberar NUCB2 em resposta à glicose [14]. Em estudos humanos, glicose indivíduos tratados apresentaram maiores níveis basais nesfatin-1 em comparação com indivíduos de controlo [10]. Em células MIN6, foi observado um aumento de 4 vezes nos níveis de nesfatin-1, quando as células foram incubadas em elevado teor de glucose (16,7 mM) em comparação com baixo teor de glucose (2,0 mM) [4]. Nesfatin-1 aumentada de glucose estimulada a secreção de insulina a partir de células cultivadas MIN6 que foram incubadas em glucose elevada do que em baixo teor de glucose de um modo dose-dependente [4]. No pâncreas de estreptozotocina (STZ) com ratinhos -injected Diabetes Tipo 1, verificou-se que tanto NUCB2 e a expressão do mRNA da preproinsulina foram significativamente inferior [4]. Em contraste, o reforço de co-localização nesfatin-1 com a insulina foi encontrada nas células dos ilhéus beta de ratinhos com obesidade induzida por dieta rica em gorduras com diabetes tipo 2. Nesfatin-1 tem efeitos específicos de tecido sobre a absorção de glucose em adipócitos de rato e do músculo [30]. No geral, nesfatin-1 exerce um papel importante na regulação da glicose no corpo inteiro e homeostase energética.

Enquanto nesfatin-1 está a emergir como um peptídeo responsiva refeição importante [1], [12], [13], [30] , o que desencadeia a sua secreção permanece obscuro. Quais são os componentes da dieta desencadear a secreção pós-refeição de nesfatin-1? Esta questão permanece sem solução. O foco principal deste estudo é determinar como os diferentes nutrientes podem modular as células NUCB2 /nesfatin-1 in vitro
em ghrelinoma estômago cultivadas (MGN3-1) de camundongos e in vivo
no sexo masculino ratos. Os resultados do nosso in vitro
estudos indicam que MGN3-1 células respondem de forma diferente aos nutrientes em secretoras NUCB2 /nesfatin-1 e grelina. Da mesma forma, a ingestão aguda ou crônica de nutrientes faz a expressão do mRNA influência NUCB2 e NUCB2 /nesfatin 1-release de uma forma específica dieta.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

Todos estudos que utilizem animais cumpriu com o Conselho canadense de diretrizes cuidados animais, e foram aprovados pelo Conselho de Ética em Pesquisa animal da Universidade de Saskatchewan (número de protocolo 2012-0033).

os estudos in vitro

rato estômago ghrelinoma (MGN3-1 células) [17] foram cultivadas em DMEM (Invitrogen, Ontário, Canadá; catálogow95-040) que foi suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen; catálogo|84 ) e 1% de penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /mL) (Invitrogen; catálogo—40-122) a 37 ° C em 10% de CO _{2. A 80% de confluência, MGN3-1 células foram semeadas a 6 x 10 ^{6 células /poço numa placa de 12 poços e os exames foram realizados quando as células eram 80-90% confluentes. Cada estudo foi repetido três vezes e os dados de três ensaios foram reunidas para se obter uma N = 9-12 poços /tratamento. Para determinar se a glicose teve um efeito na dose e forma dependente do tempo, as células foram incubadas durante 1 hora e 2 horas com 5,6, 25, 50, e 100 mM de meio DMEM de glicose. O meio de crescimento completo de células MGN3-1 os obriga a estar crescendo a um nível elevado de glicose, que é de 25 mm. Em relação com os estudos realizados com os ácidos gordos e aminoácidos, foram realizados estes estudos utilizando DMEM a níveis baixos de glucose (5,6 mM), uma vez que utilizando um meio de glucose elevada (25 mM) poderia mascarar o efeito dos respectivos nutrientes em NUCB2 /nesfatin secreção -1 e síntese. No que diz respeito aos ácidos gordos de cadeia longa, testou-se o efeito de três ácidos gordos diferentes, utilizando ácido linolénico (Sigma-Aldrich, Ontário, Canadá; Produto # L2376), ácido octanóico (Sigma-Aldrich; Produto # C2875) e ácido oleico (Sigma -Aldrich; Produto # O1383). As células foram incubadas durante 4 horas com cada ácidos gordos a 0, 1, 10, 100 uM. Utilizou-se L-Triptofano (Sigma-Aldrich; Produto # T8941) para testar o efeito de um aminoácido na secreção e síntese NUCB2. As células foram incubadas durante 4 horas com L-triptofano a 0,7, 1, 10 mM. L-triptofano está presente no meio controle (5,6 mM DMEM glucose) a uma dose mínima de 0,7 mm, o que é essencial para a sua condição de crescimento.}}

In Vivo
Estudos

para a alimentação crônica de dietas contendo quantidades variadas de nutrientes, idade e combinados com peso específico (5 semanas de idade, peso corporal médio: 20 gramas) do sexo masculino C57BL /6 (Charles River Laboratories, Quebec, Canadá) foram alojados individualmente para 17 semanas em um 12 horas de luz: 12 horas ciclo escuro (luzes apagadas às 19:00 e em pelo 07:00), temperatura e humidade controlada biotério. Os ratinhos foram divididos em quatro grupos alimentados com um controlo (n = 6), hidratos de carbono elevado (n = 7), alto teor de proteína (N = 7), e alto teor de gordura (n = 7) com dieta ad libitum
acesso à água e sua dieta específica. Todas as dietas foram adquiridos a Research Diets (New Brunswick, NJ). O teor calórico das dietas foram: controle (Produto # D12451): 4,73 kcal /g com 20% de energia derivada de proteína, energia 35% derivado de hidrato de carbono e 45% de energia proveniente de gordura; rica em carboidratos (Produto # D12450J) teve 3,8 kcal /g com 20% de energia derivada de proteína, 70% de energia derivada de carboidratos e 10% de energia proveniente de gordura; alta proteína (Produto # D08091802) teve 3,8 kcal /g com a energia 60% derivados de proteína, 30% de energia proveniente de carboidratos e 10% de energia proveniente de gordura e alto teor de gordura (Produto # D12492) teve 5,2 kcal /g com 20% energia proveniente de proteínas, 20% de energia proveniente de carboidratos e 60% de energia proveniente de gordura. Todos os ratos foram alimentados com a dieta controlo durante uma semana antes de iniciar as suas dietas específicas. ingestão alimentar, peso corporal, e de glicose no sangue leituras postar 4 horas rápido foram medidos uma vez por semana durante 17 semanas

Para a administração aguda de nutrientes, idade e (5 semanas de idade, peso corporal médio combinado de peso.: 20 gramas) do sexo masculino C57BL /6 (Charles River Laboratories, St Constant, QU, Canadá) foram alojados individualmente durante 1 semana e 2 dias em um 12 h de luz: 12 h ciclo escuro (luzes apagadas às 19:00 e em pelo 07:00 ), temperatura e humidade controlada biotério. Os ratos foram aclimatados por 1 semana na chegada e tiveram acesso ad libitum à água e ração normal do mouse por 11 dias. Uma vez que estamos realizando um estudo de dieta aguda, precisávamos de os animais para se acostumar com o procedimento sonda oral. Nós aclimatada a ratinhos para este procedimento através gavaging-los com água da torneira durante 2 dias antes do dia experimental. No 12 ^{° dia, os ratinhos foram mantidos em jejum durante 4 horas e foram tratadas por gavage com uma dieta líquida específica. Os ratos foram divididos em 4 grupos: alta proteína (Isopure bebida de proteína, Zero Carb - Mango sabor pêssego; de Best Nature, Clifton Park, New York; n = 7), alta de gordura (Splendido; prensado a frio azeite virgem extra; do presidente Escolha , Canadá; n = 7), alta de carboidratos (D-Glucose; BioShop; Catlogue # GLU501.500; n = 7) e água (água da torneira; n = 7). No dia do estudo, a 200 microlitros da nutrientes acima /água foi administrado aos ratinhos por gavagem oral. as leituras de glucose no sangue foi tirado nos tempos 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 e 120 minutos, e recolheu-se sangue aos 15, 30, 60, e 120 minutos para análise por ELISA para determinar os níveis de NUCB2 /nesfatin circulante -1. Tecidos (estômago, intestino delgado [duodeno], intestino grosso e fígado) foram coletadas de cada rato após o término do estudo (eutanásia isoflurano profundo seguido por deslocamento cervical). Para manter a consistência, o momento ea duração de cada experimento, cirurgias e coleta de amostras foram mantidas constantes para todos os estudos.}

Total de RNA Extração e cDNA síntese |

As células ou tecidos foram coletadas de cada estudo para comparar a expressão de ARNm NUCB2. A partir da os ratinhos que foram submetidos ao estudo dieta crónica, tecidos (estômago, intestino delgado, intestino grosso e do fígado) foram colhidas imediatamente após a eutanásia. O ARN total foi extraído das células MGN3-1 e tecidos, utilizando o reagente de isolamento de ARN de TRIzol (Invitrogen). pureza ARN foi validado pela densidade óptica (OD) proporção de absorção (OD 260 nm /280 nm) usando uma 2000c NanoDrop (Thermo, Vantaa, Finlândia). Somente as amostras com uma taxa de absorção maior do que 1,8 foram utilizados para a síntese de cDNA. Síntese de ADNc foi realizada utilizando o kit de síntese de ADNc iScript como indicado pelo fabricante (BioRad, Canadá).

RT-PCR quantitativa e em Tempo Real-PCR

RT-PCR e para qRT-PCR NUCB2, grelina, e RT-PCR para PC PC 1/3 e 2 foram realizados de acordo com as condições descritas na Tabela 1, utilizando o real-Time PCR Detection System CFX Ligação (Bio-Rad). Para a análise de qRT-PCR, a expressão de ARNm de NUCB2 foram normalizados utilizando actina-beta como um gene de manutenção. Os produtos de PCR para NUCB2 no estômago, do fígado e do intestino grosso e estes genes (NUCB2, grelina, PC e PC 1/3 2) nas células MGN3-1 foram sujeitas a electroforese em gel de agarose a 1% para verificar transcritos amplificados. Com base em estudos anteriores [4], utilizou-se a beta-actina como controlo interno para normalizar o sinal de ARNm NUCB2. Ao usar RNA total, onde mRNA quantificação foi muito preciso, os valores limiares críticos para beta-actina não mostrou variabilidade. Relativa expressão de mRNA NUCB2 foi normalizada com beta-actina da mesma amostra de acordo com o método Livak [31].

MGN3-1 células imunocitoquímica e microscopia
foram cultivadas em um slide do Sistema LabTek Câmara (Nalge Nunc International, Rochester, NY) e foram deixadas a crescer até à confluência próximo. As células foram lavadas com 1 X solução de tampão fosfato (PBS; 2 × 5 minutos, 25 ° C) e fixadas em solução (PFA) em 1X PBS durante 10 minutos, paraformaldeído a 4% a 25 ° C, seguido por outra lavagem com 1X PBS ( 3 × 5 minutos, 25 ° C). As células fixadas foram permeabilizadas em uma solução de 0,3% de Triton-X (Bioshop, Burlington, Ontário, Canadá) em 1X PBS durante 5 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram incubadas em tampão de bloqueio contendo soro de cabra a 10% em 1X PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. As células foram em seguida incubadas em anticorpo primário (Tabela 2), a 4 ° C durante a noite. As lâminas foram lavadas com PBS (3 × 5 minutos, 25 ° C) e incubou-se com anticorpo secundário (Tabela 2; o anticorpo PC1 /3 foi uma oferta generosa do Dr. Iris Lindberg, Universidade de Maryland School of Medicine) durante 4 horas a temperatura do quarto. Finalmente, as lâminas foram lavadas com PBS (3 × 5 minutos, 25 ° C) e montados com Vectashield meio contendo 4 'de montagem, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontário, Canadá).

As células foram vistos usando uma Nikon Eclipse-Ti microscópio de fluorescência invertido (Nikon, Mississauga, Ontário, Canadá) e as imagens foram captadas com uma câmara Nikon DS-Qi1 MC (Nikon). As imagens foram analisadas usando software de pesquisa básica NIS-Elements (Nikon) em um Dell HP Workstation. As imagens mostradas são células representativas coradas para a grelina, NUCB2, PC 1/3 e PC2. Para imagens de alta resolução, as células foram vistos, analisados ​​e imagens captadas com uma Leica TCS SP5 microscópio confocal.

Western Blot Analysis, imuno-histoquímica e microscopia de fluorescência

Para confirmar a presença de nucleobindin-2 (NUCB2) no intestino e no fígado, três, 3 meses de idade foram utilizados ratos C57BL /6 machos. Resumidamente, fígado e intestinos delgado e grosso foram recolhidos e separados por análise de Western ou imuno-histoquímica. Tecidos para Western blot homogeneizado em T-PER proteína do tecido do reagente de extração (Thermo Scientific,̑10), seguido determinação da concentração de proteína pelo ensaio de Bradford. As amostras foram preparadas em tampão de Laemmli 1X contendo 0,2% de 2-mercaptoetanol (Bio-Rad,¡-0737 e -0710) e subsequentemente foram cozidos a 95 ° C durante 5 min, seguido por agitação em vórtex. O volume da amostra inteira (20 uL), contendo cada um 50 ug de proteína ou sintética rato nesfatin-1 (ABGENT, 1 ug /mL; utilizado anteriormente em 4, 29) foi carregado num gel, e executado em um Mini-PROTEAN TGX 16/08 % de gel de gradiente (Bio-Rad,Lj-1104). Após separação, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose de 0,2 um BioTrace (Pall Life Sciences,đ77-000) e depois membrana foi bloqueada em solução 1X RapidBlock (Amresco, # M325). detecção de proteína NUCB2 foi realizada usando anticorpo de coelho anti-nesfatin-1 (número de catálogo H-003-22; 1:500 diluição; Phoenix Pharmaceuticals, Califórnia) e GAPDH proteína foi detectada por utilização de anti-soro de coelho dirigido contra a GAPDH do rato (AbDSerotec, # AHP1628 ) diluída 1:1000. Como anticorpo secundário, IgG de cabra anti-coelho (H + L) conjugado com HRP (Bio-Rad,ª-6515) diluído 1:3000 foi usada. Para visualização da proteína da membrana foi incubada durante 5 min em Clareza Ocidental substrato ECL (Bio-Rad,ª-5061) e fotografada utilizando sistema de imagem ChemiDoc MP (Bio-Rad,ª-8280) com detecção por quimioluminescência. Membrana de separação entre a detecção da proteína foi realizada usando a Restauração PLUS tampão blot descascar ocidental (Thermo Scientific,ǐ30). duais padrões xtra Precision Plus de proteína (Bio-Rad,¡-0377) foram utilizados como marcadores de peso molecular.

Para os estudos de imuno-histoquímica, os tecidos colhidos foram fixadas em formaldeído a 4% durante 24 horas a 4 ° C. Fixador foi substituído com etanol (três 70% de etanol), cada uma seguida por uma incubação de 10 minutos a 4 ° C. Os tecidos foram então armazenadas em etanol 70% a 4 ° C e foram processados ​​e seccionada em Prairie Diagnostic Services Inc. (PDS Inc., faculdade ocidental de Medicina Veterinária da Universidade de Saskatchewan). Prepararam-se secções de parafina de 4 mm de espessura para a imunocoloração. Estas secções foram desparafinadas com xileno (incubadas duas vezes em 100% de xileno, 5 minutos, 25 ° C) e re-hidratadas numa série de etanol graduada (incubado por duas vezes em etanol a 100%, e uma vez em cada de etanol a 95%, etanol a 70%, 50% etanol; 2 minutos cada, a 25 ° C). As secções foram então incubadas com peróxido de hidrogénio a 3% em água destilada para bloquear a actividade da peroxidase endógena (30 minutos à temperatura ambiente). As secções foram então bloqueadas com reagente de bloqueio de proteína livre de soro (Dako Corporation, Califórnia) durante 10 minutos antes de serem incubadas com anticorpos primários. Estas secções foram então incubadas com anticorpo de coelho anti-nesfatin-1 (número de catálogo H-003-22; diluição 1:500; Phoenix Pharmaceuticals, Califórnia) durante 24 horas à temperatura ambiente. Todas as lâminas foram subsequentemente lavadas três vezes com 1x PBS e incubadas com anticorpo de cabra anti-coelho IgG de Texas Red (Vermelho-Nesfatin-1; número de catálogo: TI-1000; 1:100 diluição; Vector Laboratories, Califórnia) anticorpo secundário durante 1 hora a sala temperatura. Todos os anticorpos primário e secundário foram diluídos em diluente de reagente de anticorpo (DakoCytomation, Mississauga, Ontario). As lâminas foram lavadas três vezes com PBS 1x e sete vezes com água destilada. Finalmente, as lâminas foram montadas com meio Vectashield que contêm corante nuclear DAPI (azul; Vector Laboratories, Burlingame, Califórnia). As secções foram observadas ao microscópio de fluorescência Nikon Eclipse Ti-E invertido (Nikon Canada, Mississauga, Canadá). As imagens foram capturadas usando uma Nikon DS-QI1 MC arrefecida câmera monocromática conectado a um computador Dell HP Workstation e os elementos NIS software de imagem pesquisa básica (Nikon Canadá, Mississauga, Canadá). Apenas as imagens representativas de coloração intestino pequeno e grande para NUCB2 /nesfatin-1 com DAPI são mostrados na seção de resultados.

Nesfatin-1 /NUCB2 no soro e Mídia

Para investigar dependente de nutrientes mudanças na /secreção NUCB2 nesfatin-1 de MGN3-1 células, o meio foi recolhido após períodos de incubação específicos. A fim de impedir que os detritos celulares, as amostras foram centrifugadas (13000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C) e o topo 700 mL foi armazenado a -20 ° C até à medição nesfatin-1. Para a medição de circulação NUCB2 /nesfatin-1, o sangue foi recolhido em 7 a.m (logo após a fase de luz começa), 13:00 (no meio da fase leve) e em 7 p.m (antes do início da fase escura). As amostras de sangue foram deixadas a coagular em gelo, e o soro foi separado por centrifugação (7000 rpm durante 9 minutos, a 4 ° C) e armazenado a -20 ° C, até que os ensaios foram realizados. NUCB2 níveis /secreção Nesfatin-1 nos meios de comunicação foram medidos usando o Nesfatin-1 (1-82) kit (Rat) ELISA (Número de catálogo EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Califórnia). O limite de sensibilidade do ensaio foi de 1,2 ng /mL para nesfatin-1, com uma gama detectável 0,1-1000 ng /mL. A quantidade de material imunorreactivo foi determinada utilizando uma regressão não linear da curva de ajuste, o qual foi utilizado para quantificar e comparar a concentração de NUCB2 /nesfatin 1-secreção nas amostras de soro e meios de comunicação.

NUCB2 /Nesfatin- 1 no soro e os níveis dos meios de comunicação e total de grelina em media

Para investigar alterações dependentes de nutrientes na secreção de grelina NUCB2 /nesfatin-1 e total desde MGN3-1 células, o meio foi recolhido após períodos de incubação específicos. A fim de impedir que os detritos celulares, as amostras foram centrifugadas (13000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C) e o topo 700 mL foi armazenado a -20 ° C até NUCB2 /Nesfatin-1 e de medição total grelina. As amostras de sangue foram deixadas a coagular em gelo, e o soro foi separado por centrifugação (7000 rpm durante 9 minutos, a 4 ° C) e armazenado a -20 ° C, até que os ensaios foram realizados. NUCB2 /Nesfatin-1 níveis de secreção no soro e meios de comunicação foram medidos usando o Nesfatin-1 (1-82) kit (Rat) ELISA (Número de catálogo EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Califórnia). O limite de sensibilidade do ensaio foi de 1,2 ng /mL para nesfatin-1, com uma gama detectável 0,1-1000 ng /mL. Da mesma forma, o total dos níveis de secreção de grelina na mídia foi medida usando a grelina (Rat, Mouse) kit EIA (Número de catálogo EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc, Califórnia). O limite de sensibilidade do ensaio foi de 1,16 ng /mL para a grelina total, sendo detectável gama de 0-100 ng /mL. A quantidade de material imunorreactivo foi determinada utilizando uma regressão não linear da curva de ajuste, o qual foi utilizado para quantificar e comparar a concentração de NUCB2 /nesfatin 1-secreção nas amostras de soro e meios de comunicação.

Análise estatística

a análise dos dados qRT-PCR e ELISA quantificados foram conduzidos utilizando One-Way ANOVA seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey. GraphPad Prism versão 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, EUA) foi utilizado para análises estatísticas e gráficos. A significância foi atribuído quando p < 0,05. Os dados são expressos como média ± SEM.

Resultados

NUCB2, PC e PC 2 1/3 mRNAs são expressas em células e MGN3-1 NUCB2 ARNm é expresso no estômago, fígado, pequeno intestino e intestino grosso de ratos macho

Foram identificados expressão de NUCB2 (202 pb), hormônio convertase 1/3 (400 pb) e hormônio convertase 2 (406 bp) mRNAs em MGN3-1 células (Fig. 1A). NUCB2 (202 bp) de expressão de mRNA também foi detectado no estômago, fígado, intestino delgado e intestino grosso de ratos machos C57 /BL6 (Fig. 1B). Os níveis absolutos de expressão de ARNm de NUCB2 no estômago eram mais elevados do que a expressão de ARNm NUCB2 no fígado, intestino delgado e intestino grosso (Fig. 1C).

MGN3-1 células imunopositivas são de grelina, NUCB2 /Nesfatin-1 , PC 1/3 e PC 2

a microscopia de fluorescência exibida MGN3-1 células coradas com anti-nesfatin-1 anticorpo (Texas-Red; a Fig. 2B) e anticorpo anti-grelina (FITC-Green; Fig. 2A) mostrou co-localização clara (amarelo; A Fig. 2C) de imuno nesfatin-1 e grelina. No entanto, algumas células positivas grelina não eram imunorreactivos para nesfatin-1 (Fig. 2C). células PC MGN3-1 mostrou 1/3 imunorreactividade (vermelho do Texas; A Fig. 2D) e o PC 2 imunorreactividade (vermelho do Texas, a Fig 2E.). DAPI (azul) manchado o núcleo de todas as células, incluindo as células não positivos para as proteínas estudadas. As lâminas de controlo coradas com anticorpo secundário sozinho (Fig. 2F) não teve qualquer imunorreactividade. imagem confocal mostrou MGN3-1 células marcadas com-1 anti-nesfatin anticorpo (Texas-Red; Fig 3A.) e anticorpo anti-grelina (FITC-Green; A Fig. 3B) mostrou co-localização clara (amarelo; A Fig. 3C) de imunorreactividade nesfatin-1 e grelina. O controlo negativo é apenas coradas com anticorpos secundários sozinho (Fig. 3D).

expressão da proteína NUCB2 no intestino grosso, intestino delgado e no fígado de ratos machos

NUCB2 proteína é expresso no intestino grosso, intestino delgado e no fígado de ratos machos que mostram banda distinta para NUCB2 correspondente a aproximadamente 50 kDa. Rato péptido nesfatin-1 utilizada como controlo positivo é mostrado como uma banda distinta correspondendo a, aproximadamente, 10 kDa (Fig 4A;. Imagem esquerda). No entanto, não há bandas que mostram o completamente processada nesfatin-1 eram visíveis a 10 kDa nas amostras de tecido (figura 4A;. Imagem esquerda). Nós também descobrimos bandas de aproximadamente 47 kDa por baixo da banda de 50 kDa no intestino delgado e no fígado, mas não no intestino grosso (Fig 4A;. Imagem esquerda). Uma banda distinta para GAPDH utilizado como o gene controle das tarefas domésticas é observada a 37 kDa mostrado em todos os tecidos (Fig 4A;. Imagem à direita). NUCB2 /nesfatin-1 imunorreactividade é encontrada nas células da mucosa do intestino delgado (Figura 4B;. Imagem para a esquerda) e no intestino grosso (Figura 4B;. Imagem direita).

Efeitos da glucose e L-triptofano em NUCB2 a expressão de ARNm em, e NUCB2 /nesfatin 1-secreção de células MGN3-1

As células incubadas em DMEM de glucose 100 mM teve uma maior expressão de ARNm NUCB2 do que as células incubadas em 5,6, 25 e 50 as concentrações de glucose DMEM mM a 1 horas pós-incubação (Fig. 5A). Às 2 horas após a incubação, as células foram incubadas a 100 mM de DMEM foram significativamente maiores na expressão de ARNm NUCB2 do que as células incubadas em 5,6 e 50 mM de glucose DMEM (Fig. 5C). Após 1 hora (Fig. 5B) e 2 horas (Fig. 5D), não houve diferenças significativas na NUCB2 /nesfatin-1 secreção. a expressão de ARNm NUCB2 foi significativamente maior em células incubadas a 10 mM de L-triptofano (Fig. 5E), em comparação com células incubadas em 0,07 e 1,0 mM de L-triptofano. NUCB2 /nesfatin 1-secreção a partir de células incubadas em 1,0 e 10,0 mM de L-triptofano foram significativamente maiores do que as células incubadas em 0,7 mM de L-triptofano (Fig. 5F).

Efeito do ácido linolénico, ácido octanóico e oleico ácido sobre a expressão de ARNm em NUCB2, e NUCB2 /nesfatin-1 secreção de células MGN3-1

encontrados expressão de ARNm NUCB2 significativamente reduzida nas células tratadas com 1, 10, e 100 uM de ácido oleico (Fig. 6E) em comparação com o controlo. Não houve mudanças nos ARNm NUCB2 foram observadas em células tratadas com linolénico (Fig. 6A) e ácido octanóico (Fig. 6C). Além disso, NUCB2 /secreção nesfatin-1 estava inalterado em células tratadas com diferentes doses de ácido linolénico (Fig. 6B), ácido octanóico (Fig. 6D), e ácido oleico (Fig. 6F).

Efeito do L-triptofano, ácido linolênico, ácido octanóico e ácido oleico de forma independente na expressão de mRNA grelina, e secreção total de grelina de MGN3-1 células

Não ocorreram alterações em mRNA grelina (S1A Figura) e secreção total de grelina (S1B Figura ) foram observadas quando as células foram tratadas com diferentes doses de glicose pós 1 hora de incubação. a expressão de ARNm A grelina foi significativamente maior em células incubadas em 1 mM de L-triptofano (Fig. 7A), em comparação com células incubadas em 0,07 e 10 mM de L-triptofano. Não houve diferença significativa na secreção total de grelina a partir de células tratadas com diferentes doses de L-triptofano (Fig. 7B). Não foi encontrada nenhuma mudança na expressão de ARNm de grelina (Fig. 7C), mas a secreção total de grelina foi elevada a partir de células incubadas com 100 uM de ácido linolénico (Fig. 7D) em comparação com o controlo, 1 e 10 uM de doses. Não houve mudanças nos ARNm grelina (Fig. 7E) e secreção total de grelina (Fig. 7F) foram observadas quando as células foram tratadas com diferentes doses de ácido octanóico. Enquanto isso, a grelina de ARNm (Fig. 7H), e a secreção total de grelina (Fig. 7I) eram significativamente mais elevados nas células tratadas com 100 uM de ácido oleico, em comparação com o controlo, 1 e 10 uM de ácido oleico.

crónica efeitos dos nutrientes na mRNA NUCB2 expressão e soro NUCB2 /nesfatin-1 em camundongos

O perfil de peso corporal, ingestão de alimentos e de glicose no sangue de ratos alimentados com várias dietas são mostrados na figura S2. Os ratos alimentados com uma dieta de elevado teor de gordura tinham significativamente baixa expressão de ARNm NUCB2 no estômago em comparação com aqueles alimentados com um controle, rica em proteínas ou hidratos de carbono dietas ricas (Fig. 8A). Não houve diferença significativa na expressão de ARNm NUCB2 no intestino delgado entre os ratos alimentados com um controle, rica em proteínas, hidratos de carbono de alta ou dietas ricas em gordura (Fig. 8B). Os ratos alimentados com a alta proteína e dietas ricas em gordura têm comparativamente baixa expressão de mRNA NUCB2 no intestino grosso do que os ratos alimentados com controle ou alto teor de carboidratos dietas (Fig. 8C). Ratos alimentados com uma dieta rica em proteínas teve uma baixa significativa expressão de mRNA NUCB2 no fígado do que os ratos alimentados com as outras dietas (Fig. 8D). Aos 7 a.m, não houve diferenças em soro nesfatin-1 /NUCB2 níveis em ratos alimentados com diferentes dietas (Fig. 9A). Em 1 p.m, os ratos alimentados com dieta rica em carboidratos apresentaram significativamente mais elevado do soro nesfatin-1 /NUCB2 em circulação (Fig. 9B). Serum nesfatin-1 /NUCB2 foi significativamente menor nos ratos alimentados com alto teor de carboidrato, alta proteína ou gordura elevado, em comparação com ratinhos de controlo alimentados com a dieta às 7 horas (Fig. 9C).

Os efeitos agudos dos nutrientes sobre a expressão do mRNA NUCB2 , glicose no sangue e soro NUCB2 /nesfatin-1 em ratinhos

Não houve alterações significativas na expressão de ARNm NUCB2 no estômago (Fig. 10A), intestino delgado (Fig. 10B), intestino grosso (Fig . 10C) e fígado (Fig. 10D) entre ratos alimentados com uma alta proteína, rica em carboidratos, gordura ou água.

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