PLOS ONE: Nutriments Réglementer Différentiellement Nucleobindin-2 /nesfatine-1 in vitro dans l'estomac Cultured Ghrelinoma (MGN3-1) Cellules et in vivo chez les souris mâles

Résumé

nesfatine-1 est sécrétée, peptide anorexigène repas sensible codé dans le précurseur nucleobindin-2 [NUCB2]. Circulant augmente nesfatine-1 postprandiale, mais les composants alimentaires qui modulent NUCB2 /nesfatine-1 restent inconnues. Nous avons supposé que les glucides, les graisses et les protéines régulent différentiellement tissu expression spécifique de nesfatine-1. NUCB2, prohormone convertases et nesfatine-1 ont été détectés dans la souris estomac ghrelinoma [MGN3-1] cellules. NUCB2 ARNm et la protéine ont également été détectés dans le foie de souris, et petits et grands intestins. MGN3-1 cellules ont été traitées avec du glucose, des acides gras ou des acides aminés. Homme C57BL /6 ont été chroniquement nourris haute teneur en graisses, riche en glucides et les régimes alimentaires riches en protéines pendant 17 semaines. PCR quantitative et nesfatine-1 tests ont été utilisés pour déterminer nesfatine-1 à des niveaux d'ARNm et de protéines. Stimulée par le glucose NUCB2 l'expression de l'ARNm dans les cellules MGN3-1. L-tryptophane a également augmenté l'expression NUCB2 ARNm et la ghréline expression de l'ARNm, et nesfatine-1 sécrétion. L'acide oléique a inhibé l'expression NUCB2 ARNm, tandis que l'expression de l'ARNm de la ghréline et la sécrétion a été renforcée. expression de l'ARNm NUCB2 était significativement plus faible dans le foie des souris nourries avec un régime riche en protéines par rapport aux souris nourries d'autres régimes. apport chronique du régime alimentaire riche en matières grasses a entraîné une réduction significative de NUCB2 ARNm dans l'estomac, tandis que riche en protéines et régime riche en graisses ont provoqué une suppression similaire de NUCB2 ARNm dans le gros intestin. Aucune différence dans le sérum nesfatine-1 niveaux ont été trouvés chez la souris à 7h, au début de la phase légère. souris nourries haut de régime d'hydrate de carbone ont montré significativement élevés nesfatine-1 au niveau 13 heures Sérum nesfatine-1 était significativement plus faible chez les souris nourris haute teneur en graisses, protéines ou de glucides par rapport aux témoins à 7 h, heure, juste avant la phase d'obscurité. Les souris qui ont reçu un bolus de haute teneur en graisses était significativement élevé nesfatine-1 /NUCB2 à tous les points de temps testés post-gavage, par rapport aux souris témoins et les souris nourries d'autres régimes. Nos résultats pour la première fois indiquent que nesfatine-1 est modulée par des nutriments

Citation:. Mohan H, Ramesh N, Mortazavi S, Le A, Iwakura H, Unniappan S (2014) Nutriments Réglementer Différentiellement Nucleobindin-2 /nesfatine-1 In vitro
dans l'estomac Cultured Ghrelinoma (MGN3-1) cellules et In Vivo
chez les souris mâles. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10.1371 /journal.pone.0115102

Editeur: Yvette Tache, Université de Californie, Los Angeles, États-Unis d'Amérique

Reçu: 1 mai 2014; Accepté le 18 Novembre 2014; Publié 15 Décembre, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Mohan et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. La auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

Financement: Cette recherche est financée par une subvention d'exploitation open des Insitutes canadiens de recherche en santé (IRSC; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) et une subvention d'établissement de la Saskatchewan Health Research Foundation (http://shrf.ca/). SU est un nouveau chercheur des IRSC. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Les bailleurs de fonds ne jouent aucun rôle dans la recherche ou la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré qu'il n'y a pas des intérêts divergents existent

Introduction

nesfatine-1 [NEFA /NUCB2 satiété encodée et la graisse influençant la protéine-1] est un peptide anorexigène puissant impliquée dans la régulation de l'équilibre énergétique et de l'homéostasie du glucose [1], [30]. Il est un peptide d'acides 82 aminés dérivée de la protéine précurseur, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 est composée de 396 acides aminés, constituée de deux motifs de la main EF et un domaine de liaison à l'ADN [1], [3]. maturation post-traductionnelle par prohormone convertases (PC 1/3 et PC 2) provoque NUCB2 devant être clivée en trois peptides, nesfatine-1 (1-82 acides aminés), nesfatine-2 (85-163 acides aminés), et nesfatin- 3 (acides aminés 166-396). /Nesfatine-1 séquence d'acides aminés NUCB2 est hautement conservée entre les vertébrés [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatine-1 se trouve dans divers noyaux hypothalamiques qui sont impliqués dans le métabolisme énergétique, telles que le noyau arqué, le noyau paraventriculaire, noyau supraoptique, la zone hypothalamique latérale et increta zona [8], [9]. les cellules bêta productrices d'insuline co-expriment nesfatine-1 dans les îlots pancréatiques de rats et de souris [2], [4], [11], ce qui suggère que nesfatine-1 peut jouer un rôle important dans la sécrétion d'insuline et de l'homéostasie du glucose [4], [29]. Ghréline et NUCB /nesfatine-1 sont colocalisés dans les glandes muqueuses gastriques pariétales chez les rongeurs [13] et les humains [16]. L'expression d'ARNm NUCB2 dans les cellules endocrines de la muqueuse gastrique purifiée a été jugée être plus élevée que dans le cerveau des rats [13]. La protéine pleine longueur NUCB2 a été observée dans les petits et grands intestins et le foie des rats mâles et des souris ICR [5]. La large diffusion de NUCB2 /nesfatine-1 dans les tissus centraux et périphériques des points à un rôle pour nesfatine-1 dans la régulation du métabolisme.

L'administration quotidienne de nesfatine-1 a provoqué une réduction prolongée de la prise alimentaire et le poids corporel [1] . l'administration intracérébroventriculaire de NUCB2 supprime la prise alimentaire, le poids corporel et sous-cutanée, mésentériques et la masse de graisse épididymaire chez des rats adultes, d'une manière dépendante de la dose. En outre, NUCB2 effet de choc chez des rats en insufflant un morpholino oligonucléotide anti-sens (AS-MON) a provoqué une augmentation de l'appétit et le poids corporel [1]. Intra-paraventriculaire injection de noyau de nesfatine-1 réduit la prise alimentaire cumulée à 1 et 3 heures [9]. injections intra-péritonéales de nesfatine-1 a entraîné une réduction de l'apport alimentaire en résistant à la leptine db /db
souris et des souris de régime alimenté riches en matières grasses [8]. Nesfatine-1 est composé de 3 fragments structurels et que le milieu du fragment (résidus 24-53, M30) de nesfatine-1 est impliqué dans la production de réponses anorexigènes [15], [28]. Ensemble, ces résultats montrent clairement que le soutien des effets de satiété de nesfatine-1.

nesfatine-1 est une hormone de repas sensible glucorégulateur [12], [13], et les îlots pancréatiques de rats libérer NUCB2 en réponse au glucose [14]. Dans les études humaines, les sujets de glucose traités avaient basales nesfatine-1 des niveaux plus élevés par rapport à des sujets témoins [10]. Dans les cellules MIN6, on a observé une augmentation de 4 fois le niveau nesfatine-1 lorsque les cellules ont été incubées en glucose élevé (16,7 mM) par rapport à faible taux de glucose (2,0 mM) [4]. Nesfatine-1 de glucose améliorée sécrétion d'insuline stimulée par les cellules MIN6 cultivées qui ont été incubées en glucose élevé qu'en bas glucose de manière dépendante de la dose [4]. Dans le pancréas de streptozotocine (STZ) chez la souris -injected diabète de type 1, il a été constaté que les deux NUCB2 et l'expression d'ARNm de prépro étaient significativement plus faibles [4]. En revanche, améliorée nesfatine-1 co-localisation avec de l'insuline a été trouvé dans les cellules bêta des îlots de souris obèses induite par l'alimentation riche en graisses avec diabète de type 2. Nesfatine-1 a des effets spécifiques de tissus sur l'absorption du glucose dans les adipocytes de rat et musculaire [30]. Dans l'ensemble, nesfatine-1 exerce un rôle important dans la régulation du glucose du corps entier et de l'homéostasie énergétique
.

Alors que nesfatine-1 est en train de devenir un peptide sensible repas important [1], [12], [13], [30] , ce qui déclenche sa sécrétion reste incertaine. Quels composants alimentation déclenchent la sécrétion post-repas de nesfatine-1? Cette question reste sans réponse. L'objectif principal de cette étude est de déterminer comment les différents éléments nutritifs peuvent moduler NUCB2 /nesfatine-1 cellules in vitro
en culture ghrelinoma de l'estomac (MGN3-1) de souris et in vivo chez le mâle
les souris. Nos résultats de nos in vitro
études indiquent que MGN3-1 cellules réagissent différemment aux nutriments en sécrétant NUCB2 /nesfatine-1 et la ghréline. De même, la prise aiguë ou chronique de nutriments ne influence NUCB2 expression de l'ARNm et de NUCB2 /nesfatine-1 libération d'une manière spécifique de l'alimentation.

Matériel et méthodes de

Déclaration
éthique

Tous des études utilisant des animaux respectées du Conseil canadien des directives de protection des animaux, et ont été approuvés par le Comité d'éthique de la recherche animale de l'Université de la Saskatchewan (Numéro Protocole de 2012 à 0033).

Dans les études in vitro de

Souris ghrelinoma estomac (MGN3-1) cellules [17] ont été cultivées dans DMEM (Invitrogen, Ontario, Canada; Cataloguew95-040) qui a été complété avec 10% de sérum fœtal bovin (Invitrogen; Catalogue|84 ) et 1% de pénicilline (100 U /ml) et de streptomycine (100 ug /ml) (Invitrogen, catalogue—40-122) à 37 ° C dans 10% de CO _{2. A 80% de confluence, MGN3-1 cellules ont été ensemencées à 6 × 10 ^{6 cellules /puits dans une plaque de 12 puits et les études ont été réalisées lorsque les cellules étaient de 80-90% confluentes. Chaque étude a été répétée trois fois et les données provenant de trois études ont été regroupées afin d'obtenir un puits n = 9-12 /traitement. Pour déterminer si le glucose avait un effet à une dose et d'une manière dépendante du temps, les cellules ont été incubées pendant 1 heure et 2 heures avec 5,6, 25, 50 et 100 mM de glucose dans le milieu DMEM. Le milieu de croissance complet des cellules MGN3-1 les oblige à être de plus en plus à un niveau élevé de glucose, qui est de 25 mM. En ce qui concerne les études menées avec des acides gras et des acides aminés, nous avons effectué ces études en utilisant DMEM à des niveaux de glucose faible (5,6 mM), puisque l'utilisation d'un milieu de glucose élevé (25 mM) pourrait masquer l'effet des nutriments respectifs sur NUCB2 /nesfatine sécrétion -1 et la synthèse. En ce qui concerne les acides gras à longue chaîne, nous avons testé l'effet de trois acides gras différents en utilisant l'acide linolénique (Sigma-Aldrich, Ontario, Canada; Produit # L2376), l'acide octanoïque (Sigma-Aldrich; # Produit C2875) et de l'acide oléique (Sigma ALDRICH; produit # O1383). Les cellules ont été incubées pendant 4 heures avec chacun des acides gras à 0, 1, 10, 100 uM. Nous avons utilisé des L-Tryptophane (Sigma-Aldrich; # Produit T8941) pour tester l'effet d'un acide aminé sur la sécrétion et la synthèse NUCB2. Les cellules ont été incubées pendant 4 heures avec du L-tryptophane à 0,7, 1, 10 mM. L-tryptophane est présent dans le milieu de contrôle (5,6 mM de glucose DMEM) à une dose minimale de 0,7 mm, ce qui est essentiel pour leur état de croissance.}}

In Vivo Studies

pour l'alimentation chronique des régimes alimentaires contenant des quantités variables de nutriments, l'âge et le poids appariés spécifique (5 semaines poids corporel moyen: 20 grammes) C57BL /6 souris mâles (Charles River Laboratories, Québec, Canada) ont été logés individuellement pour 17 semaines dans une lumière de 12 heures: 12 heures cycle d'obscurité (lumières à 19 heures et sur à 7 heures), température et humidité contrôlées vivarium. Les souris ont été divisées en quatre groupes nourris avec un contrôle (n = 6), riche en glucides (n = 7), riche en protéines (n = 7), et riche en matières grasses (n = 7) régime avec ad libitum
l'accès à l'eau et leur régime alimentaire spécifique. Tous les régimes ont été achetés chez Research Diets (Nouveau-Brunswick, NJ). La teneur en calories des régimes étaient les suivants: le contrôle (produit # D12451): 4,73 kcal /g avec de l'énergie de 20% provenant de protéines, 35% de l'énergie provenant de glucides et 45% de l'énergie provenant des matières grasses; riche en glucides (Product # D12450J) avait 3,8 kcal /g avec de l'énergie de 20% provenant de protéines, 70% de l'énergie dérivée de glucides et 10% de l'énergie provenant des matières grasses; haute teneur en protéines (produit # D08091802) avait 3,8 kcal /g avec de l'énergie de 60% provenant de protéines, 30% de l'énergie provenant de glucides et 10% de l'énergie provenant des matières grasses et riche en matières grasses (Produit # D12492) avait 5,2 kcal /g avec 20% l'énergie dérivée de la protéine, 20% d'énergie dérivée de glucides et 60% de l'énergie provenant des matières grasses. Toutes les souris ont été nourries avec le régime de contrôle pendant une semaine avant de commencer leurs régimes spécifiques. apport alimentaire, le poids du corps, et la glycémie lectures affichent 4 heures rapide ont été mesurés une fois par semaine pendant 17 semaines

Pour l'administration aiguë de nutriments, l'âge et (5 semaines poids corporel de poids appariés, en moyenne.: 20 grammes) mâle C57BL /6 souris (Charles River Laboratories, St Constant, QU, Canada) ont été logés individuellement pour 1 semaine et 2 jours dans un 12 h de lumière: 12 h cycle d'obscurité (lumières à 19 heures et à 7 heures ), température et humidité contrôlées vivarium. Les souris ont été acclimatés pour 1 semaine à l'arrivée et avait accès ad libitum à l'eau et chow régulière de la souris pendant 11 jours. Étant donné que nous effectuons une étude de régime alimentaire aiguë, nous avions besoin des animaux pour s'acclimater à la procédure de gavage oral. Nous acclimatés les souris à cette procédure en leur gavage avec de l'eau du robinet pendant 2 jours avant le jour expérimental. Le 12 ^{e jour, les souris ont été mis à jeun pendant 4 heures et ont été gavés avec un régime liquide spécifique. Les souris ont été divisés en 4 groupes: riche en protéines (Isopure Protein Drink, Zero Carb - Mango saveur de pêche; Nature de Best, Clifton Park, New York; n = 7), riche en graisses (Splendido, pressée à froid Huile d'olive vierge, le Choix du Président , Canada; n = 7), riche en glucides (D-glucose; BioShop; Catlogue # GLU501.500; n = 7), et de l'eau (l'eau du robinet; n = 7). Le jour de l'étude, 200 microlitres de nutriments ci-dessus /eau, on a administré aux souris par gavage oral. Le sang de glycémie ont été prélevés à 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 et 120 minutes, et le sang a été recueilli à 15, 30, 60 et 120 minutes pour une analyse ELISA pour déterminer les taux circulants de NUCB2 /nesfatine -1. Tissues (estomac, l'intestin grêle [duodénum], gros intestin et du foie) ont été prélevés de chaque souris à la fin de l'étude (de l'euthanasie isoflurane profonde suivie par dislocation cervicale). Pour assurer la cohérence, la synchronisation et la durée de chaque expérience, les chirurgies et la collecte de l'échantillon ont été maintenues constantes pour toutes les études.}

Extraction de l'ARN total et de synthèse d'ADNc

Les cellules ou tissus ont été prélevés dans chaque étude pour comparer l'expression NUCB2 ARNm. Chez les souris ayant subi l'étude de l'alimentation chronique, les tissus (estomac, intestin grêle, gros intestin et foie) ont été prélevés immédiatement après l'euthanasie. L'ARN total a été extrait des cellules et des tissus MGN3-1, en utilisant le réactif d'isolement de l'ARN Trizol (Invitrogen). la pureté de l'ARN a été validé par la densité optique (DO) Rapport d'absorption (DO 260 nm /DO 280 nm) en utilisant un NanoDrop 2000c (Thermo, Vantaa, Finlande). Seuls les échantillons ayant un taux d'absorption supérieur à 1,8 ont été utilisés pour la synthèse d'ADNc. Synthèse de l'ADNc a été réalisée en utilisant le kit de synthèse d'ADNc iScript comme indiqué par le fabricant (BioRad, Canada).

RT-PCR et

RT-PCR quantitative de PCR en temps réel et de qRT-PCR pour NUCB2, ghréline, et RT-PCR pour PC 1/3 et PC 2 ont été réalisés selon les conditions décrites dans le tableau 1, en utilisant le système CFX Connect Real-Time PCR Detection (Bio-Rad). Pour l'analyse qRT-PCR, expression de l'ARNm de NUCB2 a été normalisé en utilisant la bêta-actine comme un gène de ménage. Les produits de PCR pour NUCB2 dans l'estomac, le foie et le gros intestin et ces gènes (NUCB2, la ghréline, CP 1/3 et PC 2) dans les cellules MGN3-1 ont été soumis à une électrophorèse dans un gel d'agarose à 1% afin de vérifier transcrits amplifiés. Basé sur des études antérieures [4], on a utilisé la bêta-actine comme témoin interne pour normaliser le signal de NUCB2 ARNm. Lors de l'utilisation de l'ARN total, où la quantification de l'ARNm a été très précis, les valeurs de seuil critique pour la bêta-actine ont montré aucune variabilité. Relative expression NUCB2 d'ARNm a été normalisée avec la bêta-actine du même échantillon selon la méthode Livak [31].

MGN3-1 cellules immunocytochimie et Microscopie ont été cultivées dans un système de diapositives Labtek Chambre (Nalge Nunc international, Rochester, NY) et ont été autorisés à se développer à proximité de la confluence. Les cellules ont été lavées avec une solution de tampon phosphate 1X (PBS; 2 x 5 minutes, 25 ° C) et fixées dans 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS 1X pendant 10 minutes à 25 ° C, suivi d'un autre lavage avec du PBS 1X ( 3 x 5 minutes, 25 ° C). Les cellules fixées ont été perméabilisées dans une solution de 0,3% de Triton-X (Bioshop, Burlington, Ontario, Canada) dans du PBS 1X pendant 5 minutes à température ambiante. Les lamelles ont été incubées dans un tampon de blocage contenant du sérum de chèvre à 10% dans du PBS 1X pendant 1 heure à température ambiante. Les cellules ont été ensuite mises en incubation dans l'anticorps primaire (tableau 2) à 4 ° C pendant une nuit. Les lames ont été lavées avec du PBS (3 x 5 minutes, 25 ° C) et incubée avec l'anticorps secondaire (tableau 2; l'anticorps PC1 /3 était un don généreux de Dr. Iris Lindberg, Université du Maryland School of Medicine) pendant 4 heures à température ambiante. Enfin, les lames ont été lavées avec du PBS (3 x 5 minutes, 25 ° C) et montées avec un milieu contenant 4 'Vectashield de montage, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada).

Les cellules ont été visualisées à l'aide d'un microscope inversé à fluorescence Nikon Eclipse-Ti (Nikon, Mississauga, Ontario, Canada) et les images ont été capturées à l'aide d'un appareil photo Nikon DS-Qi1 MC (Nikon). Les images ont été analysées en utilisant le logiciel de recherche fondamentale NIS-Elements (Nikon) sur un Dell HP Workstation. Les images présentées sont des cellules représentatives colorées pour la ghréline, NUCB2, PC 1/3 et PC2. Pour l'imagerie haute résolution, les cellules ont été visualisées, analysées et images capturées à l'aide d'un Leica TCS SP5 microscope confocal.

Western Blot Analyse, immunohistochimie et Fluorescence Microscopy

Pour confirmer la présence de nucleobindin-2 (NUCB2) dans l'intestin et le foie, trois, 3 mois C57BL /6 de souris mâles ont été utilisés. En bref, le foie et les petits et grands intestins ont été collectés, et séparés pour l'analyse Western ou immunohistochimie. Tissues pour Western blot homogénéisé dans T-PER protéine du tissu extraction réactif (Thermo Scientific,̑10) ont suivi la protéine détermination de la concentration par dosage Bradford. On a préparé les échantillons dans un tampon de Laemmli 1X contenant 0,2% de 2-mercaptoéthanol (BioRad,¡-0737 et -0710), puis on fait bouillir à 95 ° C pendant 5 minutes, suivi par tourbillonnement. L'ensemble du volume de l'échantillon (20 pi) contenant chacune protéine de 50 pg ou synthétique rat nesfatine-1 (Abgent, 1 pg /pl, utilisé précédemment en 4, 29) a été chargé sur un gel et exécuté dans un Mini-PROTEAN TGX 16/08 % de gel à gradient (Bio-Rad,Lj-1104). Après séparation, les protéines ont été transférées sur une membrane de 0,2 um BioTrace de nitrocellulose (Pall Life Sciences,đ77-000), puis membrane a été bloquée dans une solution 1X RapidBlock (AMRESCO, # M325). la détection de la protéine NUCB2 a été réalisée à l'aide de lapin anti-nesfatine-1 (numéro de catalogue H-003-22; 1:500 dilution, Phoenix Pharmaceuticals, Californie) et GAPDH protéine a été détectée par utilisation d'un antisérum de lapin dirigé contre la GAPDH de souris (AbDSerotec, # AHP1628 ) dilué 1:1000. Comme anticorps secondaire de chèvre anti-lapin IgG (H + L) conjugué HRP (Bio-Radª-6515) dilué 1:3000 a été utilisé. Visualisation des protéines de la membrane a été incubée pendant 5 min Pureté Western ECL substrat (Bio-Rad,ª-5061) et imagée en utilisant ChemiDoc MP système d'imagerie (Bio-Rad,ª-8280) avec la détection de la chimioluminescence. Membrane stripping entre la détection de la protéine a été réalisée en utilisant Restore PLUS western blot stripping tampon (Thermo Scientific,ǐ30). Précision, plus de protéines doubles standards xtra (Bio-Rad,¡-0377) ont été utilisés comme marqueurs de poids moléculaire.

Pour les études immunohistochimiques, les tissus prélevés ont été fixés à 4% de formaldéhyde pendant 24 heures à 4 ° C. Fixatif a été remplacé par de l'éthanol (trois éthanol à 70%), chacune suivie d'une incubation pendant 10 minutes à 4 ° C. Les tissus ont été ensuite stockés dans 70% d'éthanol à 4 ° C et ont été traitées et sectionnés à la Prairie Diagnostic Services Inc. (PDS Inc., Western College of Veterinary Medicine, Université de la Saskatchewan). sections de paraffine de 4 um d'épaisseur ont été préparés pour immunocoloration. Ces sections ont été déparaffinées avec du xylene (incubées deux fois dans 100% de xylene, 5 minutes, 25 ° C) et réhydratées dans une série d'éthanol à gradient (incubées deux fois dans 100% d'éthanol et une fois par de l'éthanol à 95%, 70% d'éthanol, 50% éthanol; 2 minutes chacun, 25 ° C). Les sections ont été ensuite mises en incubation avec 3% de peroxyde d'hydrogène dans de l'eau distillée pour bloquer l'activité de peroxydase endogène (30 minutes à température ambiante). Les sections ont ensuite été bloquées avec du réactif de bloc de protéine exempt de sérum (DAKO Corporation, Californie) pendant 10 minutes avant d'être incubées avec des anticorps primaires. Ces coupes ont ensuite été incubées avec un anticorps de lapin anti-nesfatine-1 (numéro de catalogue H-003-22; 1:500 dilution, Phoenix Pharmaceuticals, Californie) pendant 24 heures à température ambiante. Toutes les lames ont ensuite été lavées trois fois avec PBS 1x et incubées avec un anticorps de chèvre anti-lapin IgG rouge Texas (rouge-nesfatine-1; n ° de catalogue TI-1000; 1:100 dilution; Vector Laboratories, Californie), un anticorps secondaire pendant 1 heure à la chambre température. Tous les anticorps primaires et secondaires ont été dilués dans le réactif anticorps diluant (DakoCytomation, Mississauga, Ontario). Les lames ont été lavées trois fois avec PBS 1x et sept fois avec de l'eau distillée. Enfin, les lames ont été montées avec un milieu Vectashield contenant du DAPI colorant nucléaire (bleu; Vector Laboratories, Burlingame, Californie). Les sections ont été examinées sous un microscope à fluorescence Nikon Eclipse Ti-E inversé (Nikon Canada, Mississauga, Canada). Les images ont été capturées à l'aide d'une caméra refroidie monochrome Nikon DS-QI1 MC connecté à un ordinateur Dell HP Workstation et éléments NIS de logiciels d'imagerie de la recherche fondamentale (Nikon Canada, Mississauga, Canada). Seules les images représentatives des petites et grandes taches de l'intestin grêle pour NUCB2 /nesfatine-1 avec DAPI sont présentés dans la section des résultats.

nesfatine-1 /NUCB2 dans le sérum et les médias

Pour étudier dépend des éléments nutritifs changements dans NUCB2 /nesfatine-1 la sécrétion de MGN3-1 cellules, les médias ont été recueillies après des périodes d'incubation spécifiques. Afin d'éviter que les débris cellulaires, les échantillons ont été centrifugés (13 000 tours par minute pendant 10 minutes à 4 ° C) et la partie supérieure 700 ul a été stocké à -20 ° C jusqu'à ce nesfatine-1 mesure. Pour la mesure de circulation NUCB2 /nesfatine-1, le sang a été recueilli à 7h (peu de temps après le début de la phase légère), 13 heures (au milieu de la phase légère) et à 7 h, heure (avant le début de la phase d'obscurité). Des échantillons de sang ont été mis à coaguler sur de la glace, et le sérum a été séparé par centrifugation (7000 tours par minute pendant 9 minutes à 4 ° C) et conservés à -20 ° C, jusqu'à ce que les essais ont été effectués. NUCB2 niveaux /nesfatine-1 sécrétion dans les médias ont été mesurés à l'aide du nesfatine-1 (1-82) Kit (Rat) ELISA (numéro de catalogue EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Californie). La limite de sensibilité du test était de 1,2 ng /mL pour nesfatine-1, avec la gamme détectable 0,1 à 1.000 ng /mL. La quantité de matériau immunoréactif a été déterminée en utilisant un ajustement de courbe de régression non linéaire, qui a été utilisé pour quantifier et comparer la concentration de NUCB2 /nesfatine-1 sécrétion dans les échantillons de sérum et des médias.

NUCB2 /Nesfatin- 1 les niveaux dans les niveaux des médias et total ghréline dans les médias

Sérum et pour étudier les changements dépendants des éléments nutritifs dans NUCB2 /nesfatine-1 et le total ghréline la sécrétion de MGN3-1 cellules, les médias ont été recueillies après des périodes d'incubation spécifiques. Afin d'éviter que les débris cellulaires, les échantillons ont été centrifugés (13 000 tours par minute pendant 10 minutes à 4 ° C) et la partie supérieure 700 ul a été stocké à -20 ° C jusqu'à ce NUCB2 /nesfatine-1 totale et la mesure de la ghréline. Des échantillons de sang ont été mis à coaguler sur de la glace, et le sérum a été séparé par centrifugation (7000 tours par minute pendant 9 minutes à 4 ° C) et conservés à -20 ° C, jusqu'à ce que les essais ont été effectués. NUCB2 /nesfatine-1 niveaux de sécrétion dans le sérum et les médias ont été mesurés à l'aide du nesfatine-1 (1-82) Kit (Rat) ELISA (numéro de catalogue EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., Californie). La limite de sensibilité du test était de 1,2 ng /mL pour nesfatine-1, avec la gamme détectable 0,1 à 1.000 ng /mL. De même, les niveaux totaux de sécrétion de ghréline dans les médias a été mesurée en utilisant la ghréline (Rat, souris) kit EIA (numéro de catalogue EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc, Californie). La limite de sensibilité du test était de 1,16 ng /mL pour la ghréline totale, avec la gamme détectable de 0-100 ng /mL. La quantité de matériau immunoréactif a été déterminée en utilisant un ajustement de courbe de régression non linéaire, qui a été utilisé pour quantifier et comparer la concentration de NUCB2 /nesfatine-1 sécrétion dans les échantillons de sérum et des médias.

Analyse statistique

les analyses des données qRT-PCR et ELISA quantifiés ont été réalisés en utilisant One-Way ANOVA suivie par un test de comparaison multiple de Tukey. GraphPad Prism Version 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, USA) a été utilisé pour les analyses statistiques et graphiques. La signification a été attribué lors de la p < 0,05. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM.

Résultats

NUCB2, PC 1/3 et PC 2 ARNm sont exprimés en MGN3-1 cellules et NUCB2 ARNm est exprimé dans l'estomac, le foie, les petites intestin et le gros intestin des souris mâles

Nous avons identifié l'expression de NUCB2 (202 pb), prohormone convertase 1/3 (400 pb), et prohormone convertase 2 (406 pb) ARNm dans MGN3-1 cellules (Fig. 1A). NUCB2 (202 pb) expression de l'ARNm a également été détectée dans l'estomac, le foie, l'intestin grêle et le gros intestin des souris mâles C57 /BL6 (Fig. 1B). Les niveaux absolus d'expression NUCB2 ARNm dans l'estomac étaient plus élevés que l'expression NUCB2 ARNm dans le foie, l'intestin grêle et le gros intestin (Fig. 1C).

MGN3-1 cellules sont immunopositif pour ghréline, NUCB2 /nesfatine-1 , PC 1/3 et PC 2

la microscopie à fluorescence affichée MGN3-1 cellules colorées avec anti-nesfatine-1 anticorps (Texas-Red;. la figure 2B) et de l'anticorps anti-ghréline (FITC-Green; Fig. 2A) a montré la co-localisation claire (jaune;. la figure 2C) immunoréactivité nesfatine-1 et la ghréline. Cependant, certaines cellules positives ghréline ne sont pas immunoréactives pour nesfatine-1 (Fig. 2C). cellules MGN3-1 ont montré PC 1/3 immunoréactivité (Texas Red;. la figure 2D) et PC 2 immunoréactivité (Texas Red, la figure 2E.). DAPI (bleu) colore le noyau de toutes les cellules y compris les cellules non positives pour les protéines étudiées. diapositives de contrôle colorées avec l'anticorps secondaire seul (Fig. 2F) n'a pas immunoréactivité. L'imagerie confocale a montré MGN3-1 cellules colorées avec-1 anti-nesfatine anticorps (Texas-Rouge; la figure 3A.) et de l'anticorps anti-ghréline (FITC-Green;. la figure 3B) a montré une co-localisation claire (jaune;. Fig 3C) d'immunoréactivité nesfatine-1 et la ghréline. Le contrôle négatif est coloré avec seulement des anticorps secondaires seuls (Fig. 3D).

expression de la protéine NUCB2 dans le gros intestin, l'intestin grêle et le foie de souris mâles

protéine NUCB2 est exprimée dans le gros intestin, l'intestin grêle et le foie de souris mâles montrant bande distincte pour NUCB2 correspondant à environ 50 kDa. Rat nesfatine-1 peptide utilisé comme témoin positif est représenté comme une bande distincte correspondant à environ 10 kDa (figure 4A;. Image de gauche). Cependant, aucune bande montrant la entièrement traitées nesfatine-1 étaient visibles à 10 kDa dans les échantillons de tissus (figure 4A;. L'image de gauche). Nous avons également trouvé que les bandes d'environ 47 kDa au-dessous de la bande de 50 kDa dans l'intestin grêle et le foie, mais pas dans le gros intestin (figure 4A;. L'image de gauche). Une bande distincte pour GAPDH utilisé comme gène de contrôle interne en gardant est observée à 37 kDa montré dans tous les tissus (figure 4A;. Image de droite). NUCB2 /nesfatine-1 immunoréactivité se trouve dans les cellules de la muqueuse de l'intestin grêle (figure 4B;. Image de gauche) et le gros intestin (figure 4B;. Image de droite).

Effets du glucose et de L-tryptophane sur NUCB2 L'expression d'ARNm dans et NUCB2 /nesfatine-1 sécrétion à partir de cellules MGN3-1

cellules mises en incubation à 100 mM de glucose DMEM avaient une expression d'ARNm NUCB2 plus élevé que les cellules ont été incubées à 5,6, 25 et 50 mM DMEM concentrations de glucose à 1 heure post-incubation (Fig. 5A). Au bout de 2 heures après l'incubation, les cellules ont été incubées à 100 mM DMEM étaient significativement plus élevées dans l'expression de l'ARNm NUCB2 que les cellules ont été incubées à 5,6 et 50 mM de glucose DMEM (Fig. 5C). A 1 heure (Fig. 5B) et 2 heures (Fig. 5D), il n'y avait pas de différences significatives dans NUCB2 /nesfatine-1 sécrétion. L'expression d'ARNm NUCB2 était significativement plus élevée dans les cellules ont été incubées à 10 mM de L-tryptophane (fig. 5E) par rapport aux cellules mises en incubation à 0,07 et 1,0 mM de L-tryptophane. NUCB2 /nesfatine-1 sécrétion à partir de cellules ont été incubées à 1,0 et 10,0 mM de L-tryptophane étaient significativement plus élevés que les cellules ont été incubées à 0,7 mM de L-tryptophane (fig. 5F).

Effet de l'acide linolénique, l'acide octanoïque et l'acide oléique l'acide sur l'expression NUCB2 ARNm dans et NUCB2 /nesfatine-1 la sécrétion de MGN3-1 cellules

Nous avons trouvé l'expression de l'ARNm NUCB2 significativement réduite dans les cellules traitées avec 1, 10, et 100 uM d'acide oléique (Fig. 6E) par rapport au témoin. Aucun changement dans NUCB2 ARNm ont été observés dans les cellules traitées avec linolénique (Fig. 6A) et de l'acide octanoïque (Fig. 6C). En outre, NUCB2 /sécrétion nesfatine-1 n'a pas été altérée dans les cellules traitées avec différentes doses d'acide linolénique (Fig. 6B), l'acide octanoïque (Fig. 6D) et l'acide oléique (Fig. 6F).

Effet de L-tryptophane, l'acide linolénique, l'acide octanoïque et l'acide oléique, indépendamment de l'expression de la ghréline d'ARNm et la sécrétion de la ghréline totale de

Pas de changement dans la ghréline ARNm (S1A figure) et la sécrétion de la ghréline totale (S1B la figure de MGN3-1 cellules ) ont été observées lorsque les cellules ont été traitées avec différentes doses de glucose après 1 heure d'incubation. l'expression de l'ARNm de la ghréline était significativement plus élevée dans les cellules ont été incubées à 1 mM de L-tryptophane (fig. 7A) par rapport aux cellules mises en incubation à 0,07 et 10 mM de L-tryptophane. Aucune différence significative dans la sécrétion de la ghréline totale provenant de cellules traitées avec différentes doses de L-tryptophane (fig. 7b). Nous avons trouvé aucun changement dans l'expression de l'ARNm de la ghréline (Fig. 7C), mais la sécrétion de ghréline totale était élevée à partir de cellules incubées à 100 uM d'acide linolénique (Fig. 7D) par rapport à contrôler, 1 et 10 uM doses. Aucun changement dans l'ARNm de la ghréline (fig. 7E) et le total de la sécrétion de la ghréline (fig. 7F) ont été observées lorsque les cellules ont été traitées avec différentes doses d'acide octanoïque. Pendant ce temps, l'ARNm de la ghréline (Fig. 7H), et le total de la sécrétion de la ghréline (fig. 7I) étaient significativement plus élevés dans les cellules traitées avec 100 pM d'acide oléique, par rapport au témoin, l'acide oléique, 1 et 10 uM.

Chronique effets des nutriments sur NUCB2 expression de l'ARNm et le sérum NUCB2 /nesfatine-1 chez des souris

Le profil de poids corporel, la consommation de nourriture et de glucose dans le sang des souris nourries de différents régimes sont présentés dans S2 Figure. Les souris nourries avec un régime riche en matières grasses était significativement faible expression de l'ARNm NUCB2 dans l'estomac par rapport à ceux nourris sur un contrôle, riche en protéines ou régimes riches en glucides (Fig. 8A). Il n'y avait pas de différence significative dans l'expression de l'ARNm NUCB2 dans l'intestin grêle entre les souris nourries sur un contrôle, riche en protéines, riche en glucides ou élevé des régimes de graisse (Fig. 8B). Souris nourries sur la haute teneur en protéines et les régimes alimentaires riches en matières grasses ont relativement faible expression de l'ARNm NUCB2 dans le gros intestin que les souris nourries de contrôle ou de régimes riches en glucides (Fig. 8C). Les souris nourries avec un régime riche en protéines avaient une faible expression significative de NUCB2 ARNm dans le foie que les souris nourries sur les autres régimes (Fig. 8D). A 7h, il n'y avait pas de différence dans le sérum nesfatine-1 /NUCB2 niveaux chez les souris nourris différents régimes alimentaires (Fig. 9A). À 1 h, heure, les souris riche en glucides nourris avait sérum significativement plus élevé nesfatine-1 /NUCB2 en circulation (Fig. 9B). Sérum nesfatine-1 /NUCB2 était significativement plus faible chez les souris nourries riche en glucides, riche en protéines ou riches en matières grasses, par rapport aux souris témoins nourries de régime à 19 heures (Fig. 9C).

Les effets aigus de nutriments sur l'expression de l'ARNm NUCB2 , la glycémie et le sérum NUCB2 /nesfatine-1 dans

Il n'y avait aucun changement significatif dans l'expression de NUCB2 ARNm dans l'estomac (Fig. 10A), petits intestin (Fig. 10B), gros intestin (figure de souris . 10C) et le foie (Fig. 10D) entre les souris nourries sur une haute teneur en protéines, riche en glucides, riche en matières grasses ou de l'eau.

• PLOS ONE: Quel type de Capsule endoscope est adapté pour un Contrôlable automoteur Capsule Endoscope? Etude expérimentale utilisant un ventre Modèle Porcin pour l'application clinique (avec vidéo…
• PLOS ONE: Estomac température enregistrements révèlent le comportement des soins infirmiers et de transition à solide consommation alimentaire dans un Mammifère unweaned, le port de Seal Pup (Pho…