PLoS ONE: nutritijenata različito regulirati Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 in vitro u kulturi Želudac Ghrelinoma (MGN3-1) stanica i in vivo kod muških Mice

Sažetak pregled

Nesfatin-1 izlučuje, obrok reagiraju anoreksična peptid kodiran u preteče nucleobindin-2 [NUCB2]. Cirkulacija nesfatin-1 povećava nakon prandially, ali prehrambene komponente koje moduliraju NUCB2 /nesfatin-1 ostaju nepoznati. Mi smo pretpostavili da je ugljikohidrata, masti i proteina različito reguliraju tkivno specifičnom ekspresijom nesfatin-1. NUCB2, prohormon konvertaze i nesfatin-1 otkrivene su u mišjim želuca ghrelinoma [MGN3-1] stanica. NUCB2 mRNA i proteina također otkrivene su u mišje jetre, i malih i velikih crijeva. MGN3-1 stanice su tretirane s glukoze, masnim kiselinama ili amino kiselinama. Muški C57BL /6 miševi su kronično hranjeni visoke masnoće, visoke ugljikohidrata i visoko proteinske prehrane za 17 tjedana. Kvantitativni PCR i nesfatin-1 testovi su korišteni za određivanje nesfatin-1 u mRNA i proteina razinama. Glukoza stimulira ekspresiju NUCB2 mRNA u MGN3-1 stanica. L-Triptofan je također povećana ekspresija NUCB2 mRNA i ghrelin ekspresiju mRNA i nesfatin-1 sekreciju. Oleinska kiselina inhibirana izraz NUCB2 mRNA, a ekspresija grelin mRNA i sekrecija je poboljšana. NUCB2 mRNA bila je značajno niža u jetri miševa hranjena visoko proteinska dijeta u odnosu na miševe hranili druge dijeta. Kronični unos visoke masnoće dijeta uzrokuje značajno smanjenje NUCB2 mRNA u želucu, dok su visoke proteina i visoke masnoće dijeta dovela do sličnog, supresiju NUCB2 mRNA u debelom crijevu. Nema razlike u serumu nesfatin-1 razine nađene su kod miševa u 7 sati, na početku svjetlosnog faze. Bogata ugljikohidratima dijeta hranjeni miševi su pokazali značajno povišene nesfatin 1-razine na 1 sati prema serum nesfatin-1 bila je značajno niža u miševe hranili visoke masnoće, proteina ili ugljikohidrata u usporedbi s kontrolnom skupinom u 7 sati, neposredno prije faze mraka. Miševi koji su primili bolus visoke masnoće značajno povišene nesfatin-1 /NUCB2 na sve testirane nakon sonde vremenskih točaka u odnosu na kontrolne miševe i miševi hranjeni ostale prehrane. Naši rezultati za prvi put ukazuju na to da nesfatin-1 modulira hranjivih tvari pregled

Izvor:. Mohan H, Ramesh N, Mortazavi S, Le A, Iwakura H, Unniappan S (2014) nutritijenata različito regulirati Nucleobindin-2 /Nesfatin-1 In vitro
u kulturi trbuhu Ghrelinoma (MGN3-1) ćelije i In vivo pregled u mužjaka miševa. PLoS ONE 9 (12): e115102. doi: 10,1371 /journal.pone.0115102 pregled

Urednik: Yvette Tache, University of California, Los Angeles, United States of America pregled

Primljeno: 1. svibanj 2014; Prihvaćeno: 18. studenog 2014; Objavljeno: 15. prosinac 2014 pregled

Copyright: © 2014 Mohan et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Data Dostupnost:. The autori potvrđuju da su svi podaci na kojima se temelji nalaze u potpunosti na raspolaganju bez ograničenja. Svi relevantni podaci u radu i njegove popratne podatke datoteka pregled

Financiranje: Istraživanje financira otvorenom operativnu potporu kanadske Insitutes of Health Research (CIHR; http:. //www.cihr-irsc. gc.ca/e/193.html) i uspostava Grant iz Saskatchewan Zdravlje Research Foundation (http://shrf.ca/). SU je CIHR Novi istraživač. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa. Donatori nemaju nikakvu ulogu u istraživanju i pisanje rada, pregled

suprotstavljenih interesa:.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Nesfatin-1 [NEFA /NUCB2 -encoded sitost i masti utječu na protein-1] je snažan anoreksična peptid uključen u regulaciju energetske ravnoteže i homeostazu glukoze [1], [30]. To je peptid 82 amino kiseline dobivene od prekursora proteina, nucleobindin-2 (NUCB2) [1]. NUCB2 se sastoji od 396 aminokiselina, koji se sastoji od dvije EF ručne motiva i obvezujuće DNA domena [1], [3]. Post-translacijska obrada po prohormon konvertaze (PC 1/3 i PC 2) uzrokuje NUCB2 cijepa u tri peptida nesfatin-1 (1-82 aminokiselina), nesfatin-2 (85-163 amino kiselina), i nesfatin- 3 (166-396 amino kiselina). NUCB2 /nesfatin-1 sekvenca amino kiseline visoko konzerviran preko kralježnjaka [6], [7], [31]. NUCB2 /nesfatin-1 je nađen u različitim jezgre hipotalamusa koji su uključeni u metabolizam energije, kao što je zakrivljenoj jezgru paraventricular jezgru supraoptic jezgru bočnog hipotalamusa područje i zona increta [8], [9]. Inzulin proizvodnju beta stanice koje su ko-express nesfatin-1 u otočićima pankreasa štakora i miševa [2], [4], [11], što ukazuje da nesfatin-1 može igrati važnu ulogu u inzulina i homeostaza glukoze [4], [29]. Grelin i NUCB /nesfatin-1 su colocalized u želučanim oxyntic mukozne žlijezde kod glodavaca [13] i ljudi [16]. NUCB2 mRNA u pročišćenim želučane sluznice endokrinih stanica je utvrđeno da je viši nego u mozgu štakora [13]. Puna dužina NUCB2 protein je uočeno u tankom i debelom crijevu i jetre štakora i miševa ICR [5]. Široka rasprostranjenost NUCB2 /nesfatin-1 u centralnim i perifernim tkivima ukazuje na ulogu nesfatin-1 u reguliranju metabolizma. Pregled

Dnevna primjena nesfatin-1 izazvao prošireni smanjenje unosa hrane i tjelesne težine [1] , Intracerebroventrikularna primjena NUCB2 potiskuje uzimanje hrane, tjelesne težine i potkožni, mezenteričnih i epididimski masni mase u odraslih štakora na način ovisan o dozi. Osim toga, NUCB2 obaranje na štakorima ulijevajući negativna morfolino oligonukleotid (kao-MON) uzrokuje povećanje apetita i tjelesne težine [1]. Intra-paraventricular jezgra injekcija nesfatin-1 smanjuje kumulativni unos hrane u 1 i 3 sata [9]. Intraperitonealne injekcije nesfatin-1 rezultirala smanjenjem unosa hrane u otpornom leptin db /db miševa i
ishranom bogatom mastima dovodi miševa [8]. Nesfatin-1 se sastoji od 3 strukturnih fragmenata i samo sredinom fragment (ostaci 24-53; M30) od nesfatin-1 je uključen u proizvodnju anoreksična odgovora [15], [28]. Zajedno, ovi rezultati pružaju jasne dokaze koji podržavaju sitosti učinke nesfatin-1. Pregled

Nesfatin-1 je obrok osjetljiv glucoregulatory hormoni [12], [13] i otočićima pankreasa štakora puštanje NUCB2 kao odgovor na glukozu [14]. U studijama na ljudima glukoze tretira ispitanici imali više bazalnih nesfatin-1 razine u odnosu na kontrolne skupine [10]. U MIN6 stanicama povećanje 4-struko u nesfatin-1 razina je uočena kada su stanice bile inkubirane u s visokim sadržajem glukoze (16,7 mM) u odnosu na niske razine glukoze (2,0 mM). [4] Nesfatin-1 pojačan izlučivanja inzulina stimulirano glukozom iz kulture MIN6 stanica koje su inkubirane u s visokim sadržajem glukoze u odnosu na niske razine glukoze u ovisno o dozi [4]. U gušterače streptozotocina (STZ) -injected miševa s dijabetesom tipa 1, utvrđeno je da su i NUCB2 i preproinzulin mRNA bile su značajno niže [4]. Za razliku od toga, poboljšane nesfatin-1 ko-lokaliziranje s inzulinom pronađen je u otočić beta stanice visoke masnoće dijeta-inducirana pretilih miševa s dijabetesom tipa 2. Nesfatin-1 ima tkiva specifične učinke na unos glukoze u adipocitima štakora i mišića [30]. Sve u svemu, nesfatin-1 vrši važnu ulogu u regulaciji cijelog glukoze tijelo i energetsku homeostazu. Pregled

Dok nesfatin-1 se pojavljuje kao važan obrok odgovarajući peptid [1], [12], [13], [30] , što izaziva njegovo izlučivanje ostaje nejasno. Što prehrana komponente se aktiviraju nakon obroka izlučivanje nesfatin-1? Ovo pitanje ostaje nezamijećeno. Glavni fokus ovog rada je utvrditi kako različite hranjive tvari mogu modulirati NUCB2 /nesfatin-1 stanica In vitro pregled u kultiviranim želuca ghrelinoma (MGN3-1) iz miševa i in vivo pregled u muških miševa. Naši rezultati naših In vitro
studije pokazuju da MGN3-1 stanice reagiraju različito na hranjivim tvarima u izlučuju NUCB2 /nesfatin-1 i grelin. Slično tome, akutna ili kronična unos hranjivih tvari utječe NUCB2 ekspresiju mRNA i NUCB2 /nesfatin-1 izdanje na specifičan način prehrane. Pregled

materijali i postupci

Izjava Etika pregled

Sve studije na životinjama u skladu s kanadskim Vijeća smjernica za čuvanje životinja, a odobreni su od strane Animal Research etiku odbora Sveučilišta Saskatchewan (Protokol broj 2012-0033). pregled

in vitro pregled studije pregled

miš želuca ghrelinoma (MGN3-1) stanice [17] su uzgojene u DMEM (Invitrogen, Ontario, Kanada, Katalog.995-040), koji je dopunjen s 10% fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen, Katalog|84 ) i 1% penicilin (100 u /mL) i streptomicina (100 ug /ml) (Invitrogen, katalog—40-122) na 37 ° C u 10% CO _{2. Pri 80% konfluencije, MGN3-1 stanice su nasađene u 6 × 10 ^{6 stanica /jažici u 12 jažica i Ispitivanja su provedena kada su stanice bile 80-90% konfluentne. Svako ispitivanje je ponovljeno tri puta i podaci iz tri studije su sakupljene da se dobije n = 9-12 jažica /tretman. Da bi se odredilo da li glukoze ima učinak u dozi i vremenu ovisan način, stanice su inkubirane kroz 1 sat i 2 sata s 5,6, 25, 50 i 100 mM glukoze DMEM medij. Kompletan medij rasta MGN3-1 stanica zahtijeva od njih da se raste na visokoj razini glukoze, što je 25 mm. U odnosu na studija provedenih na masne kiseline i amino kiseline, izveli smo ove studije uzimanja DMEM na niske razine glukoze (5,6 mM), jer koristi medij s velikim sadržajem glukoze (25 mm) prikrivanje učinak odgovarajućih hranjivih tvari na NUCB2 /nesfatin -1 izlučivanje i sintezu. S obzirom na masnih kiselina dugog lanca, mi smo testirali učinak triju različitih masnih kiselina linolenske kiseline (Sigma-Aldrich, Ontario, Canada, Product # L2376) oktanska kiselina (Sigma-Aldrich, Product # C2875) i oleinska kiselina (Sigma -Aldrich, proizvoda # O1383). Stanice su inkubirane 4 sata sa svakim masnim kiselinama, na 0, 1, 10, 100 uM. Koristili smo L-triptofan (Sigma-Aldrich, Product # T8941) testirati efekt aminokiseline na NUCB2 sekreciju i sintezu. Stanice su inkubirane 4 sata s L-triptofan, na 0,7, 1, 10 mM. L-triptofan je prisutan u kontrolnom mediju (5,6 mM DMEM glukoza) na minimalnoj dozi od 0,7 mm, koja je neophodna za njihovo stanje rasta. Pregled}}

In Vivo pregled studije pregled

za kronične hranjenja dijete koje sadrže različite količine specifičnog hranjive tvari, dobi i tjelesnoj težini podudaranja (5 tjedana stari, prosječne tjelesne težine: 20 grama) C57BL /6 miševa (Charles River Laboratories, Quebec, Kanada), smješteni su pojedinačno za 17 tjedana u 12 sati svjetlosti: 12 sati mrak krug (svjetlo se gasi u 7 sati, a na po 7 ujutro), temperatura i vlažnost kontrolirani zvjerinjak. Miševi su bili podijeljeni u četiri skupine hranjene kontrole (n = 6), bogata ugljikohidratima (n = 7), visoko proteinski (n = 7), i visoke masnoće (n = 7) dijeta s ad libitum pregled pristup vodi i njihova specifična dijeta. Sve dijete su kupljeni od tvrtke Research dijeta (New Brunswick, NJ). Sadržaj kalorija u hrani su: kontrola (proizvoda # D12451): 4,73 kcal /g sa 20% energije potječe od bjelančevina, 35% energije potječe od ugljikohidrata, a 45% energije potječe od masti; visoka ugljikohidrate (Product # D12450J) imala 3,8 kcal /g 20% ​​energija iz proteina, 70% energija iz ugljikohidrata i 10% energija iz masti; high protein (proizvoda # D08091802) imala 3,8 kcal /g sa 60% energije potječe od proteina, 30% energija iz ugljikohidrata i 10% energije potječe od masti i visoke masnoće (proizvoda # D12492) imala 5,2 kcal /g 20% energija iz proteina, 20% energija iz ugljikohidrata i 60% energija iz masti. Svi miševi su hranjeni kontrolne ishrane kroz jedan tjedan prije početka njihove specifične dijeta. unos hrane, tjelesna težina i glukoze u krvi čitanja započinjati 4 sata brzo su izmjerene jednom tjedno tijekom 17 tjedana pregled

Za akutnog davanja hranjivih tvari, dobi i težini podudaranja (5 tjedana stari, prosječne tjelesne težine.: 20 grama) mužjaci C57BL /6 miševa (Charles River Laboratories, St. Constant, QU, Kanada), smješteni su pojedinačno za 1 tjedan i 2 dana u 12 sati svjetlosti je: 12 h mrak krug (svjetlo se gasi u 7 sati, a na po 7 ujutro ), temperature i vlažnosti kontrolirana vivarijum. Miševi su prilagođene za 1 tjedan po dolasku i imao slobodan pristup vodi i redovito miša klopu za 11 dana. Budući da smo se obavlja akutni dijeta studiju, morali smo životinje aklimatizirati postupku želučane sonde. udomaćeni smo miševe u ovom postupku ih gavaging s vodom iz slavine za 2 dana prije dana eksperimenta. Na 12 ^{og dana, miševi su izgladnjivani 4 sata te su nakljukani sa specifičnim tekućim prehrani. Miševi su podijeljeni u 4 skupine: visoke protein (Isopure Protein Drink, Zero Carb - Mango breskve arome Priroda je najbolje, Clifton Park, New York; n = 7), visoke masnoće (Splendido, hladno prešani Ekstra djevičansko maslinovo ulje, predsjednikov izbor Kanada, n = 7), High ugljikohidrata (D-glukoza, BioShop; Catlogue # GLU501.500, n = 7), te voda (voda iz vodovoda, n = 7). Na dan ispitivanja, 200 mikrolitara iznad hranjiva /vode je dana na miševima oralnim unosom. Krvne razine glukoze u krvi je uzeti 0, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 i 120 minuta, a krv je sakupljena na 15, 30, 60 i 120 minuta za ELISA analizi za određivanje cirkulirajuće razine NUCB2 /nesfatin -1. Tkiva (želuca, tankog crijeva [duodenuma], debelog crijeva i jetre) prikupljeni su iz svakog miša nakon završetka ispitivanja (duboko izofluran eutanaziji slijedi cervikalnom dislokacijom). Za održavanje dosljednosti, vrijeme i trajanje svakog eksperimenta, operacija i uzimanje uzoraka držane konstantna za sve studije. Pregled}

Ukupna RNA ekstrakcija i cDNA Synthesis pregled

stanice ili tkiva prikupljeni su od svake studije usporediti ekspresiju NUCB2 mRNA. Od miševa koji su podvrgnuti kronične dijeta studiju tkiva (želuca, tankog crijeva, debelog crijeva i jetre) se sakupe odmah nakon eutanazije. Ukupna RNA je ekstrahirana iz MGN3-1 stanica i tkiva, koristeći izolaciju reagensa Trizol RNA (Invitrogen). čistoća RNA je vrednovana optičke gustoće (OD) apsorpcijski omjer (OD 260 nm /OD 280 nm) upotrebom NanoDrop 2000c (Thermo, Vantaa, Finska). Samo uzorci s apsorpcijski omjer veći od 1,8 korišteni su za sintezu cDNA. Sinteza cDNA provedena iScript cDNA Synthesis Kit prema uputama proizvođača (BioRad, Kanada). Pregled

RT-PCR i kvantitativne PCR u stvarnom vremenu pregled

RT-PCR i QRT-PCR za NUCB2, grelin i RT-PCR za PC 1/3 i PC 2 su provedena po uvjetima danim u tablici 1, korištenjem sustava CFX Connect real-time PCR za detekciju (Bio-Rad). Za QRT-PCR analize, mRNA ekspresija NUCB2 se normalizira pomoću beta-aktin kao gen domaćinstva. PCR produkti za NUCB2 u želucu, jetre i debelog crijeva i tih gena (NUCB2, grelin, PC 1/3 i PC 2) u MGN3-1 stanica elektroforezi u 1% agaroznom gelu, kako bi potvrdili transkripata pojačavaju. Temelju ranijih studija [4], koristili smo beta-aktin kao interna kontrola za normalizaciju signal NUCB2 mRNA. Kada se pomoću ukupne RNA gdje mRNA kvantifikacija je bio vrlo precizan, kritične granične vrijednosti za beta-aktin ne pokazuje varijabilnost. Relativna ekspresija mRNA NUCB2 normalizirana sa beta-aktin iz istog uzorka u skladu s postupkom Livak [31]. Pregled

imunocitokemiju i mikroskopiju pregled

MGN3-1 uzgajane su u klizni sustav Labtek komornom (Nalge Nunc International, Rochester, NY), i ostave se rasti do blizu konfluencije. Stanice su isprane s 1 x otopinom fosfatnog pufera (PBS; 2 × 5 minuta, 25 ° C), te se učvršćuju paraformaldehida 4% (PFA) otopina u 1X PBS tijekom 10 minuta na 25 ° C, nakon čega slijedi drugo ispiranje sa 1X PBS ( 3 × 5 minuta, 25 ° C). Fiksirane stanice permeabilizirane u otopini od 0,3% Triton-X (Bioshop, Burlington, Ontario, Kanada) u 1X PBS tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Rezovi su inkubirani u puferu za blokiranje koji je sadržavao 10% kozjeg seruma u 1XPBS 1 sat na sobnoj temperaturi. Stanice su zatim inkubirane u primarno antitijelo (Tablica 2), na 4 ° C preko noći. Stakalca se ispiru s PBS (3 × 5 minuta, 25 ° C) i inkubirani sa sekundarnim protutijelom (tablica 2, a PC1 /3 protutijela su velikodušni dar od Dr. Iris Lindberg Sveučilišta Maryland School of Medicine) tijekom 4 sata pri sobna temperatura. Potom su stakalca isprana sa PBS-om (3 × 5 minuta, 25 ° C) i montiraju pomoću Vectashield ugradnju medij koji sadrži 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada).

Ćelije su pregledani pomoću Nikon Eclipse-ti obrnuti fluorescentnim mikroskopom (Nikon, Mississauga, Ontario, Kanada) i slike su snimljene Nikon DS-Qi1 MC fotoaparata (Nikon). Slike su analizirani pomoću NIS-Elements temeljno istraživanje softvera (Nikon) na Dell HP Workstation. Slike prikazane su reprezentativne stanice bojane grelin, NUCB2, računala 1/3 i PC2. Za visoke rezolucije slike, stanice su pregledani, analizira i slike snimljene Leica TCS SP5 konfokalnog mikroskopa. Pregled

Western blot analiza, imunohistokemija i fluorescentne mikroskopije pregled

Za potvrđuje prisutnost nucleobindin-2 (NUCB2) u crijevu i jetri, tri, korišteni su 3 mjeseca C57BL /6 muških miševa. Ukratko, jetre i tankom i debelom crijevu su prikupljeni, a odvojeno za Western analizu ili imunohistokemijski. Tkiva za Western blot homogenizirane u T-PER proteina tkiva ekstrakcije reagensa (Thermo Scientific,̑10), a zatim određivanje koncentracije proteina pomoću Bradford analizom. Uzorci su pripravljeni u 1X Laemmli puferu koji sadrži 0,2% 2-merkaptoetanola (Bio-Rad,¡-0737 i -0710), a nakon toga se kuha 95 ° C 5 minuta, nakon čega slijedi miješanje. Cijela količina uzorka (20 ul), svaka sadrži 50 ug proteina ili sintetskog štakora nesfatin-1 (ABGENT, 1 ug /ul je prethodno korišten u koraku 4, 29) se postavi na gelu i izvoditi u Mini-Protean TGX 8-16 % gradijent gela (Bio-Rad,Lj-1104). Nakon odvajanja, proteini su preneseni u 0,2 p BioTrace nitroceluloznu membranu (Pall Life Sciences,.377-000), te je membrana blokirana u 1X RapidBlock otopine (AMRESCO, # M325). NUCB2 detekcija proteina provedena je pomoću zečjeg protiv nesfatin-1 (Kataloški broj H-003-22; 1:500 razrjeđivanje, Phoenix Farmacija, Kalifornija) i GAPDH protein je otkriven pomoću antiserum kunića usmjerenog protiv mišjeg GAPDH (AbDSerotec, # AHP1628 ) razrijeđen 1:1000. Kao sekundarna antitijela, kozjim anti-zečjim IgG (H + L) konjugata (HRP Bio-Rad,ª-6515) razrijedi 1:3000 se koristi. Za protein vizualizaciju membrana se inkubira 5 min na jasnoća Western ECL supstrata (Bio-Rad,ª-5061) i snimi pomoću ChemiDoc MP imaging sustava (Bio-Rad,ª-8280) sa detekcijom kemiluminescencije. Membranski raskrivanje između detekcije proteina provedena Vrati PLUS western blot skidanje pufera (Thermo Scientific,ǐ30). korištene su precizni plus protein dvojni XTRA standarda (Bio-Rad,¡-0377) kao obilježivača molekulske težine. pregled

imunohistokemijskim studijama, tkiva sakupljani su fiksirane u 4% formaldehidu tijekom 24 sata na 4 ° C. Fiksativ se zamijenjen etanolom (tri 70% etanol), pri čemu svaki slijedi 10 minuta inkubacije pri 4 ° C. Tkiva su zatim pohranjeni u 70% etanolu pri 4 ° C, a obrađeni su i podijeljeni u Prairie dijagnostičkih usluga Inc (PDS Inc, Western College Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Saskatchewan). Parafinski rezovi od 4 um debljine su spremni za imunološko. Ove sekcije su deparafmizirani ksilenom (inkubirane dva puta u 100% ksilen, 5 minuta, 25 ° C), te rehidriraju u serijama gradiranog etanola (inkubirane dva puta u 100% etanolu i jedanput u svakom 95% -tnog etanola, 70% etanola, 50% etanol; 2 minute svaki, 25 ° C). Sekcije su zatim inkubirane s 3% -tnim vodikovim peroksidom u destiliranoj vodi kako bi se blokirala unutarnja peroksidaza aktivnosti (30 minuta na sobnoj temperaturi). Sekcije su zatim blokirane s protein block reagensa bez seruma (DAKO Corporation, California) u trajanju od 10 minuta, prije nego što se inkubiraju s primarnim antitijelima. Ove sekcije su inkubirane s anti-zečjim nesfatin-1 (Kataloški broj H-003-22; 1:500 razrjeđivanje, Phoenix Pharmaceuticals, Kalifornija), tijekom 24 sata na sobnoj temperaturi. Svi stakalca su zatim isprane tri puta s 1 x PBS-om i inkubirane s kozjim anti-zečjim IgG Texas Red (crvena-Nesfatin-1; Kataloški broj TI-1000, 1:100 razrjeđivanje, Vector Laboratories, California) sekundarnog antitijela 1 sat pri sobnoj temperatura. Svi primarni i sekundarni Antitijela su razrijeđena u razrjeđivačem antitijelo reagensom (DakoCytomation, Mississauga, Ontario). Rezovi su isprani tri puta s 1 x PBS i sedam puta s destiliranom vodom. Konačno, slajdovi su napunjeni s Vectashield medij koji sadrži nuklearni bojom DAPI (plava; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija). Sekcije su pregledani pod Nikon Eclipse Ti-E obrnutoj fluorescentnim mikroskopom (Nikon Kanada, Mississauga, Kanada). Slike su snimljene Nikon DS-QI1 MC hladi monokromatski fotoaparat spojen na Dell HP Workstation računala i NIS elementima temeljno istraživanje softvera za obradu (Nikon Kanada, Mississauga, Kanada). Jedini predstavnik slike tankog i debelog crijeva bojenja za NUCB2 /nesfatin-1 sa DAPI prikazati u rezultatima. Pregled

Nesfatin-1 /NUCB2 Razine u serumu i mediji pregled

Da bi istražili nutrijent zavisnu promjene u NUCB2 /nesfatin-1 sekreciju iz MGN3-1 stanica, medij je skupljan nakon određene perioda inkubacije. Kako bi se spriječilo ostaci stanica, uzorci su centrifugirani (13000 okretaja u minuti tijekom 10 minuta na 4 ° C) i gornjem 700 ul je pohranjen pri -20 ° C do nesfatin-1 mjerenja. Za mjerenje kruži NUCB2 /nesfatin-1, krv je sakupljena u 7 sati (odmah nakon počinje svjetlo faza), 1 sati prema (sredina svjetla faza) i na 7 sati (prije početka faze mraka). Uzorci krvi su ostavljeni da se zgruša na ledu, a serum je odvojena centrifugiranjem (7000 okretaja u minuti tijekom 9 minuta, na 4 ° C) i pohranjena na -20 ° C, dok su provedena ispitivanja. NUCB2 Razine /Nesfatin-1 u medijima su mjereni pomoću Nesfatin-1 (1-82) (Rat) ELISA kit (Kataloški broj EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Granica osjetljivosti za ispitivanje bila je 1,2 ng /ml za nesfatin-1, a može detektirati u rasponu od 0,1-1000 ng /ml. Količina imunoreaktivnim materijalom je određena pomoću nelinearne regresijske krivulje prilagođavanja, koji je korišten za kvantificiranje i usporediti koncentracije NUCB2 /nesfatin-1 u uzorcima seruma i mediju. Pregled

NUCB2 /Nesfatin- 1 u serumu razine mediji i Total grelin u medijskoj Netlogu

Da bi istražili hranjivih tvari koje ovise o promjenama u NUCB2 /nesfatin-1 i ukupnim grelin sekreta iz MGN3-1 stanica, medij je nakon određenih razdoblja inkubacije. Kako bi se spriječilo ostaci stanica, uzorci su centrifugirani (13000 okretaja u minuti tijekom 10 minuta na 4 ° C) i gornjem 700 ul je pohranjen pri -20 ° C do NUCB2 /Nesfatin-1 i ukupne mjerne grelin. Uzorci krvi su ostavljeni da se zgruša na ledu, a serum je odvojena centrifugiranjem (7000 okretaja u minuti tijekom 9 minuta, na 4 ° C) i pohranjena na -20 ° C, dok su provedena ispitivanja. NUCB2 /Nesfatin-1 nivou sekrecije u serumu i mediji su mjereni pomoću Nesfatin-1 (1-82) (štakor) ELISA kompletom (Kataloški broj EK-003-22, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Granica osjetljivosti za ispitivanje bila je 1,2 ng /ml za nesfatin-1, a može detektirati u rasponu od 0,1-1000 ng /ml. Slično tome, ukupna razina sekrecije grelin iz medija je mjerena korištenjem ghrelin (štakor, miš), EIA pribora (Kataloški broj EK-031-31, Phoenix Pharmaceuticals Inc., California). Granica osjetljivosti za ispitivanje bila je 1,16 ng /ml za potpuno ghrelin, s detektabilnim rasponu od 0-100 ng /ml. Količina imunoreaktivnim materijalom je određena pomoću nelinearne regresijske krivulje prilagođavanja, koji je korišten za kvantificiranje i usporediti koncentracije NUCB2 /nesfatin-1 u uzorcima seruma i mediju. Pregled

Statističke analize

Analiza quantified QRT-PCR i ELISA podataka su provedena jednosmjernim ANOVA slijedi Tukey je višestruke usporedbe. GraphPad Prism verzija 5 (GraphPad Software Incorporated, San Diego, CA, USA) je bio korišten za statističku obradu podataka i grafikona. Značaj dodijeljena je p < 0.05. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. Pregled

Rezultati pregled

NUCB2, PC 1/3 i PC 2 mRNA su izraženi u MGN3-1 stanice i NUCB2 mRNA izražena u želudac, jetra, mala crijeva i debelo crijevo muških miševa pregled

identificirali smo ekspresiju NUCB2 (202 bp), prohormon konvertaze 1/3 (400 bp), a prohormon konvertaze 2 (406 bp) mRNA u MGN3-1 stanica (Sl. 1A). NUCB2 (202 bp) mRNA također je detektirana u trbuh, jetra, tanko crijevo i debelog crijeva muških C57 /BL6 miševa (Sl. 1b). Apsolutne razine ekspresije NUCB2 mRNA u želucu bile više od ekspresije mRNA NUCB2 jetre, tankog crijeva i debelog crijeva (Sl. 1C). Pregled

MGN3-1 stanice imunopozitivno za ghrelin, NUCB2 /Nesfatin-1 , PC 1/3 i PC 2 pregled

Fluorescentna mikroskopija prikazan MGN3-1 stanica obojenih s anti-nesfatin-1 antitijela (Texas-Red; Sl. 2B) i anti-grelin protutijela (FITC-Green, Sl. 2A) pokazala je jasnu suradnju lokalizacije (žuta, Sl. 2c) nesfatin-1 i grelin imunoreaktivnost. Međutim, neki grelin pozitivne stanice nisu imunoreaktivne za nesfatin-1 (Sl. 2C). MGN3-1 stanice pokazuju PC 1/3 imunoreaktivnost (Texas Red, Sl. 2d) i PC 2 imunoreaktivnost (Texas Red, slika 2E.). DAPI (plava) obojeni jezgru svim stanicama, uključujući i one stanice nisu bile pozitivne za proteine ​​studirao. Kontrolni stakalaca obojenih samo sa sekundarnim protutijelom (Sl. 2F) imao imunoreaktivnost. Konfokalni slike pokazala MGN3-1 stanica obojenih s anti-nesfatin-1 antitijelo (Texas-Red, 3A.) I anti-grelin protutijela (FITC-Green, Sl. 3B) pokazuje jasnu ko-lokalizaciju (žuta, Sl. 3C) od nesfatin-1 i grelin imunoreaktivnost. Negativna kontrola obojeni sama samo sekundarnih antitijela (sl. 3D). Pregled

NUCB2 proteina izraz u debelom crijevu, tankog crijeva i jetre od muških miševa pregled

NUCB2 protein izražen u debelom crijevu, tankog crijeva i jetre iz muških miševa pokazuju izrazitu bend za NUCB2 odgovara otprilike 50 kDa. Štakora nesfatin-1 peptid upotrijebljen kao pozitivna kontrola je prikazan kao određena skupina koja odgovara približno 10 kDa (slika 4A,. Lijevu sliku). Međutim, bez vrpce koje prikazuju potpuno obrađene nesfatin-1 bile su vidljive na 10 kDa u uzorcima tkiva (Slika 4A,. Lijevu sliku). Također smo otkrili bendova otprilike 47 kDa ispod kDa bend 50 u tankom crijevu i jetri, ali ne u debelom crijevu (Slika 4A;. Lijeva slika). Izrazit bend za GAPDH koristi kao kontrolna kuća-čuvanje gena promatra na 37 kDa prikazan u svim tkivima (Slika 4A,. U pravu fotografiju). NUCB2 /nesfatin-1 imunoreaktivnost je pronađena u mukozne stanice tankog crijeva (Slika 4B,. Lijevo slika) i debelo crijevo (slika 4B;. Desna slika). Pregled

Efekti glukoze i L-triptofan na NUCB2 mRNA u i NUCB2 /nesfatin-1 sekreciju iz MGN3-1 stanica pregled

stanice su inkubirane na DMEM 100 mM glukoze imali višu ekspresiju mRNA NUCB2 od stanica koje su inkubirane u 5,6, 25 i 50 mM glukoze DMEM na 1 sat nakon inkubacije (Sl. 5A). 2 sata nakon inkubacije, stanice su inkubirane u 100 mM DMEM bile su značajno više u ekspresiji mRNA NUCB2 od stanica koje su inkubirane u 5,6 i 50 mM glukoze DMEM (Sl. 5C). 1 sat (Sl. 5B) i 2 sata (Sl. 5D), nije bilo značajne razlike u NUCB2 /nesfatin-1 sekrecija. NUCB2 mRNA bila je znatno viša u stanicama inkubiranim u 10 mM L-triptofan (Sl. 5e) u usporedbi sa stanicama inkubiranim u 0.07 i 1.0 mM L-triptofan. NUCB2 /nesfatin-1 sekreciju iz stanica inkubiranih na 1,0 i 10,0 mM L-triptofan bili značajno viši od stanica koje su inkubirane u 0,7 mM L-triptofan (Sl. 5f). Pregled

Utjecaj linolenska kiselina, oktanoična kiselina i oleinska kiselina na ekspresiju mRNA NUCB2 u i NUCB2 /nesfatin-1 sekreciju iz MGN3-1 stanica pregled

pronašli smo NUCB2 mRNA znatno smanjena u stanica koje su tretirane s 1, 10 i 100 pM oleinske kiseline (Sl. 6e) u odnosu na kontrolu. Promjena u NUCB2 mRNA su kod stanica koje su tretirane s linolenske (Sl. 6A) i oktanoična kiselina (sl. 6C), Nadalje, NUCB2 /nesfatin-1 sekrecija bila nepromijenjena u stanicama koje su tretirane s različitim dozama linolenska kiselina (sl. 6B) oktanske kiseline (Sl. 6D), i oleinske kiseline (Sl. 6f). Pregled

Učinak L-triptofan, linolenska kiselina, oktanska kiselina i oleinska kiselina, neovisno o izrazu grelin mRNA u, a ukupno izlučivanje grelin od MGN3-1 stanica

Nema promjena u grelin mRNA (S1A slici) i ukupnom izlučivanja grelin (S1B slici ) su nađeni kada su stanice tretirane sa različitim dozama glukoze nakon 1 sat inkubacije. Grelin mRNA bila je znatno viša u stanicama inkubiranim u 1 mM L-triptofan (Sl. 7A) u usporedbi sa stanicama inkubiranim u 0,07 i 10 mM L-triptofan. Nema značajne razlike u ukupnom sekrecije grelin iz stanica koje su tretirane s različitim dozama L-triptofan (Sl. 7B). Pronašli smo bez promjene u ekspresiji mRNA grelin (Sl. 7C), a ukupno izlučivanje grelin bio visok od stanica koje su inkubirane na temperaturi od 100 uM linolenske kiseline (Sl. 7d) u odnosu na kontrolu, 1 i 10 uM doza. Promjena u grelin mRNA (Sl. 7e) i ukupnog izlučivanja grelin (Sl. 7F) nalaze se kada su stanice tretirane sa različitim dozama oktanoična kiselina. U međuvremenu, grelin mRNA (sl. 7H), a ukupna izlučivanje grelin (Sl. 7I) bile su značajno više u stanicama koje su tretirane sa 100 uM oleinske kiseline, u usporedbi s kontrolom, 1 i 10 uM oleinske kiseline. Pregled

kronična učinci hranjiva na NUCB2 mRNA i seruma NUCB2 /nesfatin-1 u miševa

tjelesna težina, uzimanje hrane i razine glukoze u krvi kod miševa hranjenih profila na raznim dijeta prikazane su na slici S2. Miševi hranjeni na ishranom bogatom mastima imali značajno nisku ekspresiju NUCB2 mRNA u želucu u odnosu na one koje su hranjene kontrola, visoka protein ili visokih ugljikohidratima dijeta (Sl. 8a). Nije bilo značajne razlike u ekspresiji NUCB2 mRNA u tankom crijevu između miševa hranjenih na kontrole, visoko proteinska, visoko ugljikohidrata ili prehrana bogata mastima (Sl. 8b). Miševi hranjeni na visokoj proteina i visoke masnoće dijeta ima relativno nisku ekspresiju NUCB2 mRNA u debelom crijevu od miševa hranjenih na kontrole ili visoke ugljikohidratima dijeta (sl. 8c). Miševi hranjeni na visoko proteinska dijeta imala značajan nisku ekspresiju NUCB2 mRNA u jetri od miševa hranjenih na drugim dijetama (Sl. 8d). U 7 sati, nije bilo razlike u serumu nesfatin-1 /NUCB2 razina u miševe hranili različitih dijeta (Sl. 9A). Na 1 sati je bogata ugljikohidratima dijeta hranjeni miševi imali značajno veći serum nesfatin-1 /NUCB2 u optjecaju (Sl. 9B). Serum nesfatin-1 /NUCB2 bila je značajno niža u miševe hranili visoke ugljikohidrate, visok protein ili visoke masnoće u usporedbi s kontrolnom hranom hranili miševe u 7 sati (Sl. 9C). Pregled

Akutni učinci hranjivih tvari na ekspresiju mRNA NUCB2 , glukoze u krvi i serumu NUCB2 /nesfatin-1 u miševa

nije bilo značajnijih promjena u ekspresiji mRNA NUCB2 u želucu (sl. 10A), tankog crijeva (sl. 10B), debelog crijeva (Sl . 10C) i jetre (Sl. 10D) između miševa hranjenih na visokoj protein, visoke ugljikohidrata, visoke masnoće ili vode.